Name: Assemblaggio modulare standardizzato di operoni policistronici con clonazione modulare (MoClo) utilizzando il toolkit In-Cloning (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: Impara l'assemblaggio di operoni policistronici con la clonazione modulare MoClo utilizzando il toolkit In-Cloning. Questo metodo permette di costruire unità di trascrizione multi-gene da parti molecolari standardizzate.

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<ol><li>James, J. S., Dai, J., Chew, W. L., Cai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+and+engineering+of+synthetic+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">The design and engineering of synthetic genomes.</a> Nat Rev Genet. 1, 1-22 (2024).</li>
<li>Weber, E., Engler, C., Gruetzner, R., Werner, S., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+cloning+system+for+standardized+assembly+of+multigene+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs.</a> PLoS One. 6 (2), e16765(2011).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Pingoud, A., Jeltsch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+type+II+restriction+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structure and function of type II restriction endonucleases.</a> Nucleic Acids Res. 29 (18), 3705-3727 (2001).</li>
<li>Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golden+Gate+shuffling%3A+A+one-pot+DNA+shuffling+method+based+on+type+IIs+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Golden Gate shuffling: A one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes.</a> PLoS One. 4 (5), e5553(2009).</li>
<li>de Vries, S. T., Kley, L., Schindler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Golden+Gate+plasmid+set+enabling+scarless+MoClo-compatible+transcription+unit+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Golden+Gate+Cloning%3A+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Use of a Golden Gate plasmid set enabling scarless MoClo-compatible transcription unit assembly.</a> Golden Gate Cloning: Methods Protoc. 2850, 105-132 (2024).</li>
<li>de Vries, S. T., Köbel, T. S., Sanal, A., Schindler, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-%26+Out-Cloning%3A+Plasmid+toolboxes+for+scarless+transcription+unit+and+modular+Golden+Gate+acceptor+plasmid+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">In-& Out-Cloning: Plasmid toolboxes for scarless transcription unit and modular Golden Gate acceptor plasmid assembly.</a> Synth Biol. 9 (1), ysae016(2024).</li>
<li>Schindler, D., Milbredt, S., Sperlea, T., Waldminghaus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+assembly+of+DNA+sequence+libraries+for+chromosomal+insertion+in+bacteria+based+on+a+set+of+modified+MoClo+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and assembly of DNA sequence libraries for chromosomal insertion in bacteria based on a set of modified MoClo vectors.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1362-1368 (2016).</li>
<li>Zumkeller, C., Schindler, D., Felder, J., Waldminghaus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+assembly+of+synthetic+secondary+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Bacterial+Chromatin%3A+Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">Modular assembly of synthetic secondary chromosomes.</a> Bacterial Chromatin: Methods Protoc. 2819, 157-187 (2024).</li>
<li>Hoffmann, S. A. YeastFab cloning of toxic genes and protein expression optimization in yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHoffmann%2C+SA+%22Golden+Gate+Cloning%3A+Methods+and+Protocols%22">Golden Gate Cloning: Methods and Protocols</a>. , Springer, New York. (2025).</li>
<li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-evaluation+of+E.+coli%27s+operon+structures+via+a+whole-cell+model+suggests+alternative+cellular+benefits+for+low-+versus+high-expressing+operons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Cross-evaluation of E. coli's operon structures via a whole-cell model suggests alternative cellular benefits for low- versus high-expressing operons.</a> Cell Syst. 15 (3), 227-245.e7 (2024).</li>
<li>Zhao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+stoichiometry+control+of+bacterial+operons+revealed+by+deep+proteome+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Multifaceted stoichiometry control of bacterial operons revealed by deep proteome quantification.</a> Front Genet. 10, 1-12 (2019).</li>
<li>Müntjes, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+polycistronic+expression+in+the+model+microorganism+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Establishing polycistronic expression in the model microorganism Ustilago maydis.</a> Front Microbiol. 11, 1-10 (2020).</li>
<li>Behrendt, G., Frohwitter, J., Vlachonikolou, M., Klamt, S., Bettenbrock, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymo-Parts%3A+A+Golden+Gate+modular+cloning+toolbox+for+heterologous+gene+expression+in+Zymomonas+mobilis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Zymo-Parts: A Golden Gate modular cloning toolbox for heterologous gene expression in Zymomonas mobilis.</a> ACS Synth Biol. 11 (11), 3855-3864 (2022).</li>
<li>Green, R., Rogers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+transformation+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chemical transformation of E. coli.</a> Methods Enzymol. 529, 329-336 (2013).</li>
<li>Köbel, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+easy-to-use+plasmid+toolset+for+efficient+generation+and+benchmarking+of+synthetic+small+RNAs+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">An easy-to-use plasmid toolset for efficient generation and benchmarking of synthetic small RNAs in bacteria.</a> ACS Synth Biol. 11 (9), 2989-3003 (2022).</li>
<li>Meyer, A. J., Segall-Shapiro, T. H., Glassey, E., Zhang, J., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+%26%2334%3BMarionette%26%2334%3B+strains+with+12+highly+optimized+small-molecule+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli &#34;Marionette&#34; strains with 12 highly optimized small-molecule sensors.</a> Nat Chem Biol. 15 (2), 196-204 (2019).</li>
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<li>Chen, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+582+natural+and+synthetic+terminators+and+quantification+of+their+design+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of 582 natural and synthetic terminators and quantification of their design constraints.</a> Nat Methods. 10 (7), 659-664 (2013).</li>
<li>Togna, A. P., Shuler, M. L., Wilson, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+plasmid+copy+number+and+runaway+plasmid+replication+on+overproduction+and+excretion+of+beta-lactamase+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Effects of plasmid copy number and runaway plasmid replication on overproduction and excretion of beta-lactamase from Escherichia coli.</a> Biotechnol Prog. 9 (1), 31-39 (1993).</li>
<li>Messerschmidt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+characterization+of+the+synthetic+secondary+chromosome+synVicII+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimization and characterization of the synthetic secondary chromosome synVicII in Escherichia coli.</a> Front Bioeng Biotechnol. 4, 1-9 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ampicillina</td><td>Merck Life Science</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>Agar batterico</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>P0011B</td><td></td></tr><tr><td>BbsI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3539</td><td></td></tr><tr><td>BsaI-HF V2</td><td>New England Biolabs</td><td>R3733</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha; Cellule competenti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Mastercycler&nbsp; Nexus Thermal Cyclers</td><td>Eppendorf</td><td>6333000014</td><td></td></tr><tr><td>EzDrop 1000 Micro-Volume Spectrophotometro</td><td>Blue-Ray Biotech</td><td>BRED-1000</td><td></td></tr><tr><td>Kit Miniprep per plasmidi GeneJET</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>In- & Fuori - Kit degli attrezzi per la clonazione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffer della ligasi</td><td>New England Biolabs</td><td>B0216</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova&reg; &nbsp; 42/42R - Shaker Incubatore Impilabile</td><td>Eppendorf</td><td>M1335-0080</td><td></td></tr><tr><td>PhenoBooth+</td><td>Strumenti cantanti</td><td>PHB-007</td><td></td></tr><tr><td>SapI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0569</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomicina</td><td>Merck Life Science</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Materiale standard per laboratorio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ligasi del DNA T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>Thermomix MM</td><td>B. Braun Biotech International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triptone</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>LP0042B</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>LP0021B</td><td></td></tr></tbody></table>

assemblaggio modulare standardizzato di operoni policistronici con clonazione modulare (moclo) utilizzando il toolkit in-cloning

Standardized Modular Assembly of Polycistronic Operons with Modular Cloning (MoClo) using the In-Cloning toolkit

Assemblaggio modulare standardizzato di operoni policistronici con clonazione modulare (MoClo) utilizzando il toolkit In-Cloning

Modular Cloning (MoClo) toolkits enable the rapid assembly of multigene constructs. They are based on Golden Gate cloning, which uses Type IIS restriction ...

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Questo video descrive BiFC-PALM - una combinazione di microscopia di localizzazione fotoattivata e complementazione a fluorescenza bimolecolare - per valutare le interazioni proteina-proteina. La BiFC prevede la fusione di due frammenti proteici fluorescenti con due proteine di interesse interagenti. Quando le due proteine interagiscono, i frammenti vengono portati in prossimità, il che consente alle due parti di unirsi e ricostituire una proteina fluorescente funzionale. La fluorescenza di un...

Microscopia di localizzazione fotoattivata accoppiata a complementazione a fluorescenza bimolecolare

Complessi proteici catalizzano le funzioni cellulari fondamentali. Caratterizzazione funzionale e strutturale dettagliata di molti complessi essenziali richiede la produzione ricombinante. MultiBac è un sistema di celle di baculovirus / insetto particolarmente adattato per esprimere proteine ​​eucariotiche e dei loro complessi. MultiBac è stato implementato come una piattaforma open-access, e le procedure operative standard sviluppati per massimizzare la sua utilità.

Il MultiBac Protein Complex Piattaforma di produzione al EMBL

La sintesi di plasmidi personalizzati richiede lavoro e tempo. Questo protocollo descrive l'uso della clonazione dell'assemblaggio Gibson per ridurre il lavoro e la durata della procedura di clonazione del DNA personalizzata. Il protocollo descritto produce anche costrutti proteici marcati affidabili per l'espressione nei mammiferi a un costo simile al tradizionale clonaggio del DNA taglia e incolla.

Generazione di plasmidi vettori che esprimono proteine ​​FLAG-tagged Ai sensi del regolamento di Human Factor-allungamento 1α Promotore Uso Gibson Assembly

Le interazioni proteina-proteina vengono visualizzate in cellule con risoluzione spaziale nanometrica combinando la complementazione a fluorescenza bimolecolare (BiFC) con la microscopia a localizzazione fotoattivata (PALM). Qui viene descritto l'uso di BiFC-PALM per l'imaging delle interazioni Ras-Raf nelle cellule U2OS per visualizzare il clustering e la diffusione su scala nanometrica di singoli complessi Ras-Raf.

Fotoattivato localizzazione Microscopia con complementazione fluorescenza biomolecolare (BiFC-PALM)

Descriviamo un sistema di ovociti e cappucci animali di Xenopus per il clonaggio dell'espressione di geni in grado di indurre una risposta in un ectoderma competente, e discutiamo le tecniche per la successiva analisi di tali geni. Questo sistema è utile nell'identificazione funzionale di un'ampia gamma di prodotti genici.

Clonazione funzionale utilizzando un<em&gt; Xenopus</em&gt; Ovociti Expression System

Qui, un flusso di lavoro automatizzato per eseguire il montaggio modulare di "dispositivo" di DNA usando un metodo di assemblaggio modulare clonazione di DNA su robot di maneggio del liquido è presentato. Il protocollo utilizza uno strumento intuitivo software per la generazione di elenchi a discesa gestore liquido per combinatoria generazione della libreria dispositivo DNA, che dimostriamo utilizzando due piattaforme di gestione dei liquidi.

Automatizzato robot Liquid Handling Assembly di dispositivi modulari del DNA

Qui, presentiamo un protocollo che descrive come i) assemblare un vettore auto-replicante utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate, ii) introdurre il vettore in un ospite cianobatterico per coniugazione, e iii) caratterizzano ceppi di cianobatteri transgenici utilizzando un lettore di lamele o citometria di flusso.

Modificazione genetica dei cianobatteri mediante congiugazione utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate

L'obiettivo di questo protocollo è fornire una guida dettagliata e dettagliata per assemblare costrutti multi-genico utilizzando il sistema di clonazione modulare basato sulla clonazione di Golden Gate. Fornisce anche raccomandazioni sui passaggi critici per garantire un assemblaggio ottimale in base alle nostre esperienze.

Assemblaggio rapido di costrutti multi-gene utilizzando la clonazione modulare del Golden Gate

Lo studio descrive un protocollo per la creazione di grandi quantità (μg-mg) di DNA per campagne di screening proteico da frammenti di geni sintetici senza clonazione o utilizzando cellule viventi. Il modello minimo viene digerito enzimaticamente e circolarizzato e quindi amplificato utilizzando l'amplificazione isotermica del cerchio di rotolamento. Le reazioni di espressione senza cellule potrebbero essere eseguite con il prodotto non purificato.

Metodi rapidi ed enzimatici per l'amplificazione di modelli minimi e lineari per la prototipazione di proteine utilizzando sistemi privi di cellule

Un modulo di clonazione molecolare adattabile di Gibson Assembly è stato impiegato in un formato di esperienza di ricerca universitaria (CURE) basato su corsi per studenti di laboratori di biologia molecolare. La valutazione dei risultati di apprendimento degli studenti ha mostrato una migliore comprensione e fiducia nella clonazione molecolare dopo il completamento del CURE e nuovi plasmidi sono stati clonati per la ricerca sulla biosintesi di prodotti naturali.

Migliorare i risultati degli studenti con un'esperienza di ricerca universitaria basata su corsi di clonazione molecolare adattabile

Impara l'assemblaggio di operoni policistronici con la clonazione modulare MoClo utilizzando il toolkit In-Cloning. Questo metodo permette di costruire unità di trascrizione multi-gene da parti molecolari standardizzate.

Assemblaggio modulare standardizzato di operoni policistronici con clonazione modulare (MoClo) utilizzando il toolkit In-Cloning (Video) | JoVE Journal

Assemblaggio modulare standardizzato di operoni policistronici con clonazione modulare (MoClo) utilizzando il toolkit In-Cloning

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