Assemblaggio modulare standardizzato di operoni policistronici con clonazione modulare (MoClo) utilizzando il toolkit In-Cloning

Ho sviluppato metodi che permettono l'assemblaggio modulare del DNA da piccole parti molecolari individuali fino a costrutti di dimensioni cromosomiche, e di riprogrammare le cellule con questi cromosomi artificiali. Una delle innovazioni importanti nel campo è lo sviluppo di kit di strumenti modulari per il clonaggio che permettono l'assemblaggio modulare di costrutti multigenici da una libreria di parti molecolari standardizzate. I kit di strumenti modulari per il clonaggio sono tipicamente progettati per clonare unità di trascrizione monocistroniche.

Questo protocollo dimostra un modo generalizzabile per l'assemblaggio di unità di trascrizione policistronica con il toolkit di clonazione in-cloning. Questa strategia di clonazione di un'unità di trascrizione policistronica consente di utilizzare le sequenze codificanti in modo flessibile, sia in una singola unità di trascrizione sia in disposizioni policistroniche. Per cominciare, seleziona le parti di Livello 0 da assemblare in un'unità di trascrizione.

Questi devono includere almeno un RBS, una sequenza di codifica e un terminator. Scegli la posizione in cui l'unità di trascrizione sarà assemblata in operone. In base alla posizione scelta, si seleziona il plasmide accettatore corrispondente e si simula l'assemblaggio Golden Gate in SnapGene.

Nella reazione Golden Gate, si utilizza l'enzima SAP1 per liberare il sito di legame del ribosoma, la sequenza codificante e il terminator dai rispettivi plasmidi e tagliare il plasmide accettore. Assemblare il sito di legame del ribosoma, la sequenza codificante e il terminator nel plasmide dell'accettore di taglio. Successivamente, per la reazione Golden Gate, usa una pipetta per aggiungere 50 femtomoli di ogni inserto desiderato e 50 femtomoli del plasmide accettore.

Un microlitro ciascuno di 10x T4 DNA ligase buffer, T4 ligasi e SAP1 in un tubo di reazione. Poi aggiungi acqua senza nucleasi per portare il volume finale a 10 microlitri. Metti il tubo in un termociclatore.

Esegui 25 cicli a 37 gradi Celsius per tre minuti, 16 gradi Celsius per quattro minuti e 50 gradi Celsius per 20 minuti. Poi inattivare gli enzimi a 80 gradi Celsius per 20 minuti. Opzionalmente, si pipettano 0,5 microlitri di SAP1 alla reazione GG e si incuba a 37 gradi Celsius per un'ora.

Pipettare cinque microlitri della reazione si mescolano in 50 microlitri di cellule E. coli chimicamente competenti. Esegui una trasformazione da shock termico immergendo il tubo in un bagno d'acqua a 42 gradi Celsius per 30 secondi, poi posiziona il tubo sul ghiaccio per due minuti. Successivamente, incubare le cellule in un millilitro di mezzo per un'ora per favorire il recupero.

La piastra di 100 microlitri della trasformazione si estende su una piastra LB con coclea contenente 100 microgrammi per millilitro di ampicillina. Incubare il piatto durante la notte a 37 gradi Celsius. Il giorno dopo, scegli due colonie bianche usando un annello di inoculazione o una punta a pipetta.

Inoculare ciascuno in cinque millilitri di mezzo LB contenente 100 microgrammi per millilitro di ampicillina. Incubare durante la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore tremante a 250 giri al minuto. Esegui un'estrazione a quadri secondo le istruzioni del produttore.

Digerisci un microgrammo di DNA plasmatico estratto aggiungendo un microlitro di 10x tampone digestionale e un microlitro di BBS1. Aggiungi acqua senza nucleasi per ottenere il volume totale di 10 microlitri e incubare. Ora carica il plasmide digerito su un gel all'1%agarosio e fai eseguire l'elettroforesi a 100 volt per 35 minuti.

Poi immagini il gel e confermi l'assemblaggio corretto del plasmide. Per assemblare un costrutto di Livello M, si sceglie le unità di trascrizione di Livello 1 da assemblare. Simulare l'assemblaggio Golden Gate rilasciando la prima e la seconda unità di trascrizione e il link finale usando l'enzima BBS1.

Contemporaneamente, si apre il plasmide accettore, poi si assemblano tutte e tre le parti nel plasmide accettore per formare l'unità di trascrizione policistronica. Il controllo negativo per l'assemblaggio dei plasmidi di Livello 1, che mancava di una parte terminator, non ha prodotto colonie, mentre la reazione completa ha prodotto 292 colonie bianche e nessuna colonia rossa. L'assemblaggio del costrutto multigenico senza la seconda cassetta a 37 gradi Celsius ha prodotto solo due colonie bianche, mentre l'assemblaggio completo ha prodotto nove grandi colonie e 435 piccole colonie.

A 30 gradi Celsius, il controllo negativo per l'assemblaggio multigenico ha prodotto quattro colonie bianche, mentre la reazione completa ha prodotto più di 1.500 colonie. Il digesto BSA1 del plasmide accettore PMA60 fornisce la singola banda attesa a 5.500 coppie di basi. La digestione BSA1 dei plasmidi da 24 colonie ha rivelato che 23 su 24 mostravano il corretto schema di restrizione di due bande a circa 4.300 coppie di basi e 1.700 coppie di basi.

L'imaging a fluorescenza ha mostrato una forte fluorescenza verde e ciano nelle colonie di piastre contenenti l'induttore OC6, mentre le piastre senza induttore hanno mostrato una fluorescenza minima o assente.