Protocolli di Screening Sperimentale, Tecniche di Immunocitochimica e Imaging Microscopico per Penium margaritaceum

La nostra ricerca si concentra sul ruolo della parete cellulare nel mantenimento della forma cellulare e nella risposta allo stress esterno. Utilizziamo una gamma di tecniche di microscopia ottica e microscopia laser confocale per l'imaging della struttura della parete cellulare in cellule vive e la microscopia elettronica per l'imaging ad alta risoluzione delle pareti cellulari.

Manca l'attuale mancanza di linee cellulari trasformate per alghe streptofite che esprimono proteine subcellulari specifiche per evidenziare le dinamiche della parete cellulare. Ciò richiede quindi l'uso di anticorpi e altre sonde fluorescenti per lo studio. La parete cellulare del Penium risponde a varie forme di stress abiotico e biotico, e questo porta alla plasticità fenotipica. Abbiamo scoperto che le pectine della parete cellulare sono una parte importante di questo processo. Il fenotipo unicellulare e la capacità di eseguire la marcatura di cellule vive con Penium offre ai biologi vegetali l'opportunità di approfondire la struttura e lo sviluppo della parete cellulare.

[Istruttore] Per iniziare, rimuovi cinque millilitri di colture cellulari liquide di Penium margaritaceum in crescita attiva. Trasferire in una provetta da centrifuga di plastica da 15 millilitri, quindi centrifugare. Dopo aver versato il surnatante, risospendere il pellet in cinque millilitri di WHM fresco. Fissare saldamente il tappo della provetta e agitare energicamente la provetta per 10 secondi per risospendere il pellet e rimuovere qualsiasi sostanza polimerica extracellulare dalla superficie della parete cellulare. Dopo il lavaggio finale, risospendere il pellet in un millilitro di WHM fresco, quindi trasferire 200 microlitri di aliquote della sospensione cellulare in provette da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare le provette con tappo nella microcentrifuga a 1000 G per un minuto, quindi aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 400 microlitri di WHM fresco. Quindi, aggiungere 20 microlitri di anticorpo monoclonale diluito alla sospensione cellulare e agitare bene. Quindi, avvolgere la provetta in un foglio di alluminio e incubarla su un rotatore da laboratorio per 90 minuti. Centrifugare la sospensione, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 500 microlitri di WHM fresco prima di agitare per 10 secondi. Dopo la centrifugazione finale, risospendere il pellet in 400 microlitri di WHM e aggiungere otto microlitri di capra anti-ratto TRITC o FITC. Infine, risospendere il pellet in 100 microlitri di terreno di coltura. Tappare il tubo e avvolgerlo in un foglio di alluminio fino al momento dell'imaging. Diluire le cellule marcate con l'anticorpo JIM5 dieci volte in WHM. Aggiungere una goccia di 50 microlitri della sospensione cellulare diluita su un vetrino coprioggetti. Incubare le cellule per due minuti al buio per consentire l'adesione cellulare, quindi pipettare con cura un millilitro di WHM goccia a goccia per sciacquare via le cellule non aderenti. Aggiungere 30 microlitri di WHM sopra le celle attaccate. Sovrapporre la gocciolina con 30 microlitri di agarosio caldo al 4% in WHM e lasciarla solidificare. Per i campioni in una capsula di Petri, aggiungere una quantità di WHM sufficiente a coprire completamente le cellule incorporate nell'agarosio. Per le celle su un vetrino coprioggetti, capovolgere il vetrino coprioggetto e posizionarlo delicatamente su un vetrino a depressione riempito di WHM. Montare le cellule preparate su un microscopio a fluorescenza. Installa una lampada esterna o usa l'illuminazione integrata del microscopio per supportare la crescita e il movimento cellulare. Acquisisci immagini ogni 10-30 minuti utilizzando il filtro TRITC impostato per monitorare l'espansione della parete cellulare. Preparare una provetta contenente cinque millilitri di colture cellulari lavate da 10 a 14 giorni. Quindi, aggiungi circa 100 microlitri di perle fluorescenti da 0,75 micrometri in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Pipettare un millilitro di WHM nella provetta e agitare energicamente per risospendere le perle. Centrifugare la provetta a 10.000 G per tre minuti. Risospendere il pellet finale in 500 microlitri di WHM. Quindi, pipettare un millilitro di terreno WHM in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Aggiungere inibitori o regolatori di crescita per ottenere la concentrazione desiderata e agitare delicatamente la piastra. Aggiungere 10 microlitri della soluzione di perline e agitare delicatamente di nuovo per mescolare, quindi aggiungere 10 microlitri di cellule lavate a ciascun pozzetto prima di mescolare. Incubare la piastra per 24 ore alla luce. Senza disturbare la piastra, posizionarla su un microscopio a fluorescenza invertito dotato di filtro FITC. Pipettare un millilitro di una sospensione cellulare in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Centrifugare la provetta a 4.000 g per un minuto. Dopo aver scartato il surnatante, immergere il tubo contenente il pellet nell'azoto liquido o congelare a meno 80 gradi Celsius. Risospendere il pellet scongelato in 20 microlitri di WHM. Posizionare una goccia della sospensione a celle dense su un vetrino coprioggetti di 45 x 50 millimetri. Posiziona un secondo vetrino coprioggetti sopra la goccia per creare un panino. Premere continuamente sul sandwich per 30 secondi per rompere le cellule. Separare con cura i vetrini coprioggetto. Aggiungere WHM sui vetrini coprioggetti per lavare le cellule rotte in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e centrifugare. Esaminare il pellet bianco o leggermente verde dopo aver scartato il surnatante. Risospendere il pellet contenente le pareti cellulari in acqua deionizzata. Dopo la rottura delle celle e la centrifugazione, risospendere il pellet in 100 microlitri di acqua deionizzata prima di trasferirlo in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Quindi, attacca il nastro di carbonio alla superficie di un troncone di Cambridge. Pipettare cinque gocce da microlitro della sospensione della parete cellulare risoluta sul nastro di carbonio. Usa il bersaglio di palladio per ricoprire il mozzicone per 50 secondi dopo averlo lasciato asciugare durante la notte. Osservare le celle a cinque kilovolt, con una dimensione appropriata del punto posizionata a 10 centimetri dal rivelatore di elettroni secondario. La marcatura della parete cellulare di P. margaritaceum con anticorpi monoclonali anti-pectina ha rivelato una rete di fibre complessate di calcio che formano un reticolo irregolare. La pectina si depositò nel centro della cellula o istmo, spingendo la pectina più vecchia verso i poli. La marcatura di JIM7 ha mostrato che la pectina altamente metil-esterificata era inizialmente secreta in una banda stretta all'istmo. Altri polimeri nella parete cellulare, come la proteina arabinogalattano, sono stati rilevati con l'anticorpo monoclonale JIM13. Grandi quantità di sostanze polimeriche extracellulari sono state secrete al di fuori della parete cellulare, consentendo lo scivolamento e l'aggregazione cellulare. Le tecniche di marcatura hanno permesso di effettuare studi quantitativi sulla parete cellulare e sull'espansione, integrando approcci di imaging dello sviluppo. Studi strutturali correlati hanno rivelato che il tipico reticolo di pectina era composto da una rete di fibre che terminavano esternamente in proiezioni distinte. Il trattamento con alte concentrazioni di calcio ha trasformato il reticolo della pectina in depositi irregolari, come osservato nelle cellule marcate con JIM5. Quando le pareti cellulari trattate con calcio sono state esaminate al microscopio elettronico a scansione, la struttura disorganizzata della pectina è stata osservata in dettaglio.