Imaging 3D ad alta risoluzione e analisi con apprendimento automatico senza marcatura di organoidi intestinali tramite olotomografia a bassa coerenza

Il nostro obiettivo è quello di stabilire metodi di imaging in tempo reale e privi di marcature per il monitoraggio dei cambiamenti biofisici negli organoidi vivi durante lo sviluppo e in risposta ai farmaci. Questo protocollo facilita la semplificazione della scala di imaging e dei test farmacologici non invasivi in organoidi vivi, supportati da mutazioni guidate dall'intelligenza artificiale e dalla selezione quantitativa della texture per la ricerca biomedica. Stiamo pianificando di integrare ulteriormente l'imaging 3D label-free e l'analisi di un anno per studi di organoidi non invasivi ad alta risoluzione nella modellazione delle malattie e nella medicina di precisione.

Per iniziare, aspirare il terreno esaurito da ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti contenente la matrice extracellulare. Aggiungere 200 microlitri di soluzione di recupero cellulare in ogni pozzetto e incubare a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Utilizzando una pipetta, raccogliere delicatamente la sospensione di organoidi e trasferirla in una provetta da microcentrifuga.

Centrifugare la provetta a 150 g per tre minuti, quindi rimuovere con cura il surnatante. Per dissociare meccanicamente il pellet, risospeso in 200 microlitri di terreno di coltura e pipettare la sospensione su e giù da 20 a 30 volte utilizzando una pipetta P200 prima di centrifugarla per tre minuti. Dopo la centrifugazione e la rimozione del surnatante, aggiungere al pellet una matrice extracellulare media e fresca, o ECM, in un rapporto di uno a quattro, e pipettare delicatamente per miscelare accuratamente.

Erogare 15 microlitri di miscela per cupola in ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti. Posizionare la piastra capovolta in un incubatore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per un'ora per consentire la polimerizzazione della ECM. Dopo la polimerizzazione, aggiungere 200 microlitri di terreno di coltura fresco a ciascun pozzetto e riempire i pozzetti esterni vuoti con PBS.

Per preparare il campione per l'imaging, erogare 15 microlitri di cupola ECM organoide su una capsula di imaging con fondo vetrino coprioggetti numero 1,5 e incubarla a temperatura ambiente per un minuto. Posizionare la piastra capovolta in un incubatore a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per un'ora. Quindi, aggiungere delicatamente una quantità sufficiente di terreno di coltura per immergere completamente gli organoidi.

A cinque giorni dal passaggio, lavare il campione due o tre volte con PBS immediatamente prima dell'imaging. Quindi, per l'imaging, attivare il controller ambientale. L'unità di controllo della camera imposterà automaticamente la temperatura a 37 gradi Celsius e l'anidride carbonica al 5%Premere il pulsante Porta per aprire la porta.

Aggiungere acqua fino a formare uno strato sottile all'interno della camera bene. Posizionare la capsula di imaging nel supporto del recipiente, inserirla nella camera di imaging e fissarla con uno spillo per impedirne il movimento. Chiudere la porta per evitare interferenze con la luce esterna.

Ora avvia il software TomoStudio X e accedi. Fare clic su Avvia per aprire la finestra principale, quindi fare clic su Aggiungi progetto nell'angolo in alto a sinistra e assegnare l'esperimento. Verificare che sia stato selezionato il tipo di supporto corretto per l'utilizzo appropriato dell'indice di rifrazione.

Fare clic sul pozzetto desiderato nel pannello, quindi fare clic su Crea in alto per registrare il pozzetto come campione. Quindi, fai clic su Impostazione ROI nell'angolo in alto a destra per definire la regione di interesse nel piatto. Una volta impostato, fai clic su Esegui esperimento nell'angolo in basso a destra per aprire la finestra di acquisizione dell'immagine.

Fare clic su Load Vessel nell'angolo per visualizzare un'immagine in campo chiaro. Regolare la posizione Z utilizzando i pulsanti Z e Z per mettere a fuoco l'immagine. Nella scheda Imaging singolo, regolare le dimensioni del ROI.

Cattura gli organoidi in un campo visivo di 160 micrometri per 160 micrometri e acquisisci stack fino a 140 micrometri di profondità. Passare alla scheda Time Lapse Imaging per impostare l'imaging a lungo termine e impostare la durata e l'intervallo desiderati. Fai clic sull'icona Scansione per acquisire la posizione ROI corrente.

Fare clic sul pulsante BF per regolare l'intensità e i valori di esposizione per l'imaging in campo chiaro. Spostate la casella ROI nel pannello Anteprima per selezionare il ROI. Una volta selezionata la ROI desiderata, fare clic su Aggiungi punto in basso, verrà creato l'elenco dei punti di imaging.

Ora, fare clic su Acquisisci per avviare l'imaging e acquisire i dati dell'immagine grezza. Avviare il server di elaborazione HTX facendo clic sull'icona Desktop. Trascinare e rilasciare i file di immagine raw sul server di elaborazione HTX.

Fare clic su Elabora per generare un file TCF dal file di immagine non elaborato. Avviare TomoAnalysis Viewer facendo clic sull'icona Desktop. Carica i file TCF elaborati trascinandoli e rilasciandoli nella finestra del visualizzatore.

Fare doppio clic sulla miniatura di un file per aprire il tomogramma ROI. Esamina la vista 2D navigando tra i piani X, Y, Z utilizzando i controlli di zoom, panoramica e scorrimento. Fare clic sull'icona della vista di rendering MIP a sinistra per passare alla modalità di rendering 3D.

Naviga nella vista 3D ruotando, ingrandendo e spostando l'immagine. Per la segmentazione delle immagini basata sull'apprendimento automatico, esportare il file immagine TCF in formato HDF5 per garantire che i dati siano in un formato multidimensionale, compatibile con ilastik. Apri ilastik e vai a Nuovo progetto.

Seleziona Classificazione pixel nella sezione Flusso di lavoro di segmentazione e salva il progetto in una cartella designata. Per caricare il file HGF5, accedere alla scheda Dati di input, fare clic su Aggiungi nuovo file, selezionare il set di dati H5 appropriato e verificare le assegnazioni corrette dei canali immagine. A questo punto, passare alla scheda Selezione funzioni per scegliere caratteristiche come colore, intensità, bordo e texture per ottimizzare la segmentazione.

Nella scheda Allenamento, etichettare le regioni organoidi e non organoidi utilizzando pennellate di colore diverso. Fai clic su Aggiornamento in tempo reale per visualizzare in anteprima i risultati della segmentazione e apportare le modifiche, se necessario. Una volta terminato, vai alla scheda Esportazione previsione.

Seleziona Segmentazione semplice come origine per esportare le previsioni etichettate e fai clic su Esporta tutto. Impostare il formato di esportazione su H5 o TIFF in base ai requisiti di analisi. Per l'analisi quantitativa, aprire il file di codifica supplementare 2.

Designare i percorsi di cartella appropriati per il file maschera e il file TCF corrispondente all'interno dello script. Eseguire il codice per avviare l'analisi quantitativa. Il codice calcolerà il volume dell'organoide, la densità proteica e il contenuto proteico totale per ciascun set di dati.

Questa figura illustra le ricostruzioni tridimensionali dell'indice di rifrazione ad alta risoluzione utilizzate per visualizzare la morfologia complessiva degli organoidi dell'intestino tenue. Le ricostruzioni renderizzate rivelano differenze strutturali distinte tra gli organoidi trattati con veicolo e quelli trattati con cisplatino in tutte e tre le profondità della sezione ottica. Gli organoidi trattati con cisplatino hanno mostrato un volume significativamente più elevato, una densità proteica inferiore e un contenuto proteico totale più elevato, rispetto agli organoidi trattati con veicolo a 10 minuti dopo il trattamento, indicando un rigonfiamento strutturale precoce e una composizione proteica alterata.

L'imaging time-lapse nell'arco di 24 ore ha mostrato che gli organoidi trattati con veicolo hanno mantenuto l'integrità strutturale, mentre gli organoidi trattati con cisplatino hanno subito una progressiva degradazione strutturale, tra cui il collasso della cripta e l'aumento della dissociazione cellulare, suggerendo un danno citotossico tempo-dipendente. Il monitoraggio quantitativo ha confermato che gli organoidi trattati con veicolo sono aumentati di volume e contenuto proteico nel tempo, mentre gli organoidi trattati con cisplatino hanno mostrato un declino dipendente dal tempo in entrambi i parametri, indicando che il cisplatino sopprimeva la crescita e induceva la degradazione cellulare. La densità proteica è rimasta stabile negli organoidi trattati con veicolo, ma è progressivamente diminuita negli organoidi trattati con cisplatino nel corso delle 24 ore, suggerendo una rottura della struttura cellulare e un aumento dello spazio extracellulare dovuto all'esfoliazione.