Un metodo semplice e rapido per l'isolamento simultaneo degli isolotti primari e delle cellule acinari pancreatiche primarie da topi

Questo studio ha sviluppato un metodo semplificato per estrarre efficacemente isolotti primari funzionali e cellule acinar dal pancreas del topo, offrendo uno strumento prezioso per studiare la comunicazione intracellulare nella patogenesi del diabete PPDMA indotto da pancreatite acuta. I metodi attuali per isolare isolotti primari dai topi si basano principalmente sulla canulazione dei dotti biliari. Questa tecnica richiede una localizzazione precisa e una cannulazione del dotto biliare, seguite da una perfusione in vivo della soluzione di collagenasi P del parenchima pancreatico.

È piuttosto difficile da eseguire senza una formazione specializzata, ottenere una perfusione pancreatica efficace ed efficiente è una sfida. Questo video impedisce un metodo semplice e rapido per isolare isolotti di montaggio primario, adatto a ricercatori senza esperienza in perfusione. Il metodo consente anche l'acquisizione simultanea di cellule acinari pancreatiche primarie, ottenendo una quantità sufficiente di isolotti e cellule acinari di alta qualità.

Permette ai ricercatori di condurre esperimenti nello stesso contesto patologico e fisiologico, facilitando così un'analisi approfondita del meccanismo di interazione tra isolotti e cellule acinari. Isolamento degli isolotti pancreatici e delle cellule acinari pancreatiche PACs. Aggiungi la soluzione salina bilanciata di Hank e la soluzione di collagenasi P sulla piastra a 12 pozzi e aggiungi tre millilitri di soluzione di collagenasi P in un tubo centrifuga da 50 millilitri per la digestione successiva.

Anestesiare il topo con tribromoetanolo al 1,25% prima dell'intervento, seguito dall'eutanasia. Fai un'incisione addominale a forma di V per aprire la cavità addominale del topo. L'organo linfoide rosso scuro nella regione ipocondriaca sinistra è la milza, mentre l'organo bianco attaccato alla milza è il pancreas.

Eseguire con attenzione una dissezione smussata del pancreas lungo il bordo inferiore dello stomaco e la giunzione pancreaticoduodenale. Lavare il tessuto pancreasico isolato nella soluzione salina bilanciata di Hank e rimuovere gli attacchi mesenterici residui, la milza e il tessuto adiposo peripancreatico. Sposta il pancreas pre-lavorato su una piastra a 12 pozzi pre-aggiunta con due millilitri di soluzione di collagenasi P.

Tieni il pancreas fermo con una pinzetta con la mano sinistra e usa una siringa da un millilitro con la mano destra per iniettare la soluzione di collagenasi P nel parenchima pancreatico finché il tessuto pancreatico non appare traslucido ed edematoso. Taglia il pancreas in pezzi di tessuto da uno a due millimetri al cubo con forbici chirurgiche. Taglia la punta distale a 1,5 centimetri di una punta di pipetta da un millilitro per ingrandire l'apertura, e usa questa punta modificata per trasferire i pezzi di tessuto pancreatico insieme a due millilitri di soluzione di collagenasi P in un tubo centrifuga da 50 millilitri precaricato con tre millilitri di soluzione di collagenasi P.

Incubare il tubo della centrifuga in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius per 12 minuti, scuotendo delicatamente il tubo ogni cinque-sei minuti durante questo periodo. Aggiungi 10 millilitri di medium completo RPMI 1640 per interrompere l'effetto digestivo della soluzione di collagenasi P. Pipetta ripetutamente il pellet con una pipetta Pasteur da cinque millilitri, per 15-20 colpi su e giù, finché non rimangono più grandi grumi di tessuto evidenti.

Aggiungi 10 millilitri di medium completo RPMI 1640. Poi centrifuga a 180 volte G per due minuti a quattro gradi Celsius. E scartare il sovrantato Sospendere il proiettile con 20 millilitri di medium completo RPMI 1640.

Filtra la sospensione attraverso un setaccio a 40 rete. Poi centrifuga a 180 volte G per due minuti a quattro gradi Celsius. Scarta delicatamente il soprannatante.

Aggiungi 20 millilitri di soluzione Ficoll per risospendere il pellet. Poi aggiungi lentamente 15 millilitri di RPMI 1640 full medium. A questo punto, si può osservare un'interfaccia liquido chiara.

Centrifuga delicatamente a 640 volte G per 20 minuti a 25 gradi Celsius. Rimuovere con attenzione il tubo della centrifuga e aspirare lo strato superiore di mezzo rosso usando una pipetta Pasteur da cinque millilitri. Successivamente, aspirare con cura gli isolotti contenenti liquido all'interfaccia dello strato liquido e trasferirlo in un nuovo tubo centrifuga da 50 millilitri.

Aggiungi 20 millilitri di RPMI 1640 medium completo. Centrifugare a 180 volte G per due minuti a quattro gradi Celsius, e scartare il soprantantante. Sospendere il pellet con 20 millilitri di medium completo RPMI 1640.

Centrifugare a 180 volte G per due minuti a quattro gradi Celsius, e scartare il soprantantante. Sospendere il pellet con 10 millilitri di medium completo RPMI 1640. E trasferiscilo in un piatto di coltura cellulare da 60 millimetri.

Sotto un microscopio biologico rovesciato con un ingrandimento di 100 volte, scegliere manualmente gli isolotti usando una pipetta da 20 microlitri. Trasferire gli isolotti selezionati su una piastra di coltura cellulare da 24 pozzi precaricata con 500 microlitri di mezzo completo RPMI 1640 per pozzo. Scartare lo strato di soluzione di Ficoll.

Sospendere il pellet con 10 millilitri di mezzo completo DMEM. Filtra attraverso un colino a celle da 100 micrometri. Centrifugare a 180 volte G per due minuti a quattro gradi Celsius.

E scartare il soprannativante. Sospendere il pellet con 10 millilitri di mezzo completo DMEM. Centrifugare a 180 volte G per due minuti a quattro gradi Celsius e scartare il soprandante.

Successivamente, risospendere il pellet con cinque millilitri di mezzo completo DMEM per gli esperimenti successivi. Dopo la centrifugazione a gradiente di densità della soluzione di Ficoll, sono stati osservati isolotti vicino all'interfaccia tra lo strato liquido trasparente e incolore e il mezzo con pacchi presenti come sedimento sul fondo del tubo. Gli isolotti erano solitamente ovali rotondi, di colore dorato, con una resa stabile di 120 più o meno cinque per topo, Figura A e Figura B. I PAC appena isolati erano sferici e raggruppati.

Le cellule acinar avevano estremità apicali più scure con granuli di zimogeno visibili e la resa era da 1,6 a 1,95 per 10 a settima potenza per topo, Figura C e D. La colorazione PI delle isolotti e delle cellule acinari con claceina mostrano la maggior parte delle cellule colorate con calceina verde, viva, e poche PI rosse, morte, Figura A. L'analisi quantitativa basata su J rivela isolotti isolati e cellule acinar con tassi di vitalità di 97,52 più o meno 0,16% e 96,55 più o meno 0,95% rispettivamente, Figura B. Cellule acinari pancreatiche isolate, un'attività basale amilasi di 0,79 più o meno 0,01 unità per millilitro. Dopo la stimolazione con 10 nanomolari, 20 nanomolari e 50 nanomolari caeruleina, le loro attività amilasi erano rispettivamente di 1,45 più o meno 0,03 unità per millilitro, 1,65 più o meno 0,05 unità per millilitro, e 1,39 più o meno 0,02 unità per millilitro. L'ANOVA unidirezionale ha mostrato che tutti i gruppi di ceruleina presentavano un'attività amilasi significativamente diversa rispetto al gruppo di controllo, tutti i valori P inferiori a 0,001.

Inoltre, il gruppo 20 nanomolari differiva significativamente dal gruppo 10 nanomolari, valore P inferiore a 0,001, figura A. Isolotti isolati con secrezione insulinica di 0,27 più o meno 0,04 nanogrammi per millilitro per isolotto all'ora quando stimolati con 5,6 millimolari di glucosio e 0,94 più o meno 0,04 nanogrammi per millilitro per isolotto all'ora con 22 millimolari di glucosio, GSI è 3,44, Figura B. Questo studio ha stabilito un metodo per l'isolamento simultaneo degli isolotti primari del topo e delle cellule acinari pancreatiche senza perfusione in vivo complessa. Con una lunga barriera tecnica, il metodo è facile da operare, ottenendo 120 isolotti più o meno 5 e 1,6-1,95 volte 10 alla settima potenza delle cellule acine per topo, con entrambi i tipi cellulari che mostrano un tasso di vitalità superiore al 96%. Gli isolotti isolati mostrano una secrezione normale di insulina stimolata dal glucosio e le cellule acinar sono sensibili alla stimolazione della caeruleina. Ciò conferma che le cellule ottenute con questo metodo hanno funzioni intatte, rendendole adatte per studi sulle interazioni esocrine pancreatiche ed endocrine.

Tuttavia, il metodo è limitato dalla necessità di conoscenze di base dell'anatomia del topo, dalla necessità di aggiustamenti del dosaggio dei reagenti, dalle restrizioni sul numero di mouse processati simultaneamente e dal rischio di applicazione non validata. Fornisce ancora un protocollo affidabile di isolamento cellulare per i ricercatori privi di esperienza in perfusione.