Name: Isolamento e quantificazione degli mRNA assonali utilizzando inserti di membrana porosi e RTddPCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: Impara a isolare e quantificare gli mRNA assonali utilizzando inserti di membrana porosi e RT-ddPCR. Questo metodo consente la separazione dei compartimenti neuronali e la rilevazione di trascritti a bassa copia con alta sensibilità.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>Inserti in coltura cellulare per piastra a 6 pozzi, 1.0&nbsp; &mu; m Dimensione dei pori, sterile</td><td>Corning</td><td>353102</td><td>Consumabili</td></tr><tr><td>Inserti in coltura cellulare per piastre a 6 pozzi, 3.0&nbsp; &mu; m Dimensione dei pori, sterile</td><td>CELLTREAT</td><td>230603</td><td>Consumabili</td></tr><tr><td>Sollevatore a celle con lama stretta</td><td>VWR</td><td>76036-006</td><td>Consumabili</td></tr><tr><td>Piastre di coltura tissutale a 6 pozzi CELLSTAR</td><td>VWR</td><td>82050-842</td><td>Consumabili</td></tr><tr><td>ddPCR Placche a 96 Pozzi &nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>12001925</td><td>Consumabili</td></tr><tr><td>ddPCR Olio per Lettore di Gocce &nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>1863004</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>Cartucce DG8 per generatore di gocce QX200/QX100</td><td>Bio-rad</td><td>1864008</td><td>Consumabili</td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Gibco/Fisher Scientific</td><td>23017-015</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>LunaScript RT SuperMix Kit</td><td>NEB</td><td>E3010L</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>Micropiastre per neri a base di fluorescenza, a 96 pozzi</td><td>Thermo Fisher</td><td>M33089</td><td>Consumabili</td></tr><tr><td>Sigillatura termica per piastra PCR, stagnola, perforabile</td><td>Bio-rad</td><td>1814040</td><td>Consumabili</td></tr><tr><td>Poli-lisina</td><td>Sigma</td><td>P1274</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>PTC Tempo 96 Thermal Cycler</td><td>Bio-rad</td><td>12015382</td><td>Equipaggiamento</td></tr><tr><td>Software QuantaSoft</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Software per l'analisi dati PCR</td></tr><tr><td>Kit di test per il reagente Quant-it RiboGreen e RNA</td><td>Thermo Fisher</td><td>R11490</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>QX200 ddPCR EvaGreen Supermix</td><td>Bio-rad</td><td>1864034</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>Olio per la generazione di gocce QX200 per EvaGreen</td><td>Bio-rad</td><td>1864005</td><td>Reagenti</td></tr><tr><td>Generatore di Gocce QX200</td><td>Bio-rad</td><td>17005227</td><td>Equipaggiamento</td></tr><tr><td>Lettore di gocce QX200</td><td>Bio-rad</td><td>17005228</td><td>Equipaggiamento</td></tr><tr><td>Reagente Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15-596-026</td><td>Reagenti</td></tr></tbody></table>

isolamento e quantificazione degli mrna assonali utilizzando inserti di membrana porosi e rtddpcr

Isolation and Quantification of Axonal mRNAs Using Porous Membrane Inserts and RTddPCR

I neuroni corticali dei roditori embrionali primari, i neuroni ippocampali e i BFCN placcati su inserti da 1 μm rivestiti con PLL aderiscono in modo robusto e estendono le neuriti attraverso la membrana per 5-7 giorni in vitro (DIV). A 11 DIV, le colture mostrano reti dense. Per i DRG di ratto adulto, aggiungere uno strato di laminina a inserti da 3 μm rivestiti con PLL aiuta a ottenere un'estensione assonale comparabile di 5 DIV. Queste osservazioni confermano la capacità degli inserti di sostenere la crescita neuronale a lungo termine e di fornire materiale assonale sufficiente per l'estrazione dell'RNA a valle. In caso di necessità di scalare, combiniamo più inserti per avere materiale sufficiente.
L'estrazione da TRIzol da singoli inserti produce abbastanza RNA per la trascrizione inversa e la successiva ddPCR. La quantificazione RiboGreen conferma rese coerenti di RNA da frazioni intere di neuroni (212,85 ng/inserto) e rese inferiori da frazioni di neuriti (42,75 ng/inserto) (Figura 2). Generalmente otteniamo ~5-7 volte l'RNA dall'intera frazione neuronale rispetto a quella arricchita da neurite.
Tutti gli innesci vengono convalidati prima degli esperimenti RTddPCR. Per ogni trascrizione bersaglio, almeno due set di primer vengono ordinati e testati tramite PCR convenzionale su cDNA generato dagli stessi campioni neuronali. La coppia di primer che produce la banda più forte e specifica viene selezionata per RTddPCR (Figura 3A). Ad esempio, abbiamo scelto il set di primer 1 per Gap43. Nei casi di risultati ambigui, come quelli ottenuti per Actγ, eseguiamo una PCR a gradiente per ottimizzare le temperature di ricottura (Figura 3B). Questo garantisce che solo primer ben convalidati vengano utilizzati per la quantificazione assoluta, riducendo la probabilità di artefatti nella separazione delle gocce.
La procedura di raschiamento e tamponamento separa in modo affidabile i compartimenti somatici e neuritici. L'RNA isolato dall'intera frazione del neurone mostra arricchimento di trascrizioni, come Actγ 46,47,48,49 (Figura 4). Al contrario, le frazioni di assoni/neurite producono RNA totale nettamente inferiore, coerente con il loro volume limitato, ma mostrano un arricchimento di trascrizioni note per localizzarsi nei processi distali, come Gap43 (Figura 4). Un rilevamento incrociato minimo di trascritti soma-restricted indica un'elevata purezza compartimentale quando gli inserti vengono maneggiati con cura e placcati alla densità ottimale.
I risultati positivi sono caratterizzati da: (1) morfologia neuronale intatta con chiara estensione assonale, (2) separazione netta dei compartimenti senza rottura della membrana, (3) primer validati che producono una separazione netta tra gocce positive e negative, e (4) forti segnali RTddPCR per i trascrizioni assonali. Esperimenti subottimali portano a una bassa resa di RNA, contaminazione incrociata evidenziata dai marcatori soma nelle frazioni di neurite, o da artefatti RTddPCR come l'aumento della "pioggia" di gocce dovuta alla dimerizzazione del primer. Questi problemi sono più spesso legati a danni alla membrana dell'inserto, pressione di raschiamento eccessiva o un'ottimizzazione inadeguata della temperatura di ricottura dell'innesco.
<img alt="Figura 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1: Panoramica dell'isolamento dell'RNA specifico per compartimento utilizzando inserti a membrana. I neuroni dei roditori sono stati coltivati su inserti semipermeabili con una dimensione dei pori di 1-3 μm, che permettono l'estensione delle neuriti limitando il soma. Per la preparazione dell'intero neurone, le cellule del compartimento superiore venivano raschiate via utilizzando uno scraper cellulare sterile, pallinate e poi lisate in TRIzol per l'isolamento dell'RNA, la sintesi del cDNA e la RTddPCR. I residui cellulari venivano rimossi dalla membrana inserita con un cotton fioc sterile. Per la preparazione delle neuriti, la membrana inserita che ora conteneva solo neuriti è stata invertita e tagliata con una lama di bisturi, e immersa direttamente nel TRIzol, seguita da isolamento di RNA, sintesi di cDNA e RTddPCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: Curva standard di concentrazione di RNA utilizzando il saggio RiboGreen. (A) L'intensità di fluorescenza è stata misurata utilizzando il saggio di quantificazione dell'RNA RiboGreen su una serie di diluizione di standard di RNA. Un'analisi di regressione lineare ha rivelato una forte correlazione tra la concentrazione di RNA e il segnale di fluorescenza (R² = 0,9956). Il valore R² vicino a uno dimostra un'eccellente linearità e affidabilità del saggio RiboGreen per una quantificazione accurata dell'RNA. (B) Utilizzando l'equazione (y=19,738x + 14,905) per la pendenza ottenuta in A, è stato calcolato l'RNA totale per ogni frazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: Validazione del primer tramite PCR ed elettroforesi del gel di agarosio. (A) I prodotti di amplificazione PCR utilizzando cDNA per Actγ e Gap43 sono stati risolti su un gel di agarosio al 2% per valutare la specificità del primer. Per ogni gene, sono stati testati due set di primer indipendenti (set 1 e set 2). I marcatori di dimensione del DNA (scale) sono mostrati nelle corsie adiacenti con i pesi molecolari indicati (10 kb, 0,5 kb, 0,1 kb). Bande singole distinte della dimensione attesa confermano un'amplificazione e specificità riuscita dei set di primer selezionati. (B) L'amplificazione per PCR è stata eseguita utilizzando il primer Actγ impostato 2 su un gradiente di temperatura (55-65 °C) per determinare la temperatura ottimale di ricottura. I prodotti amplificati sono stati risolti su un gel di agarosio al 2% accanto a una scala di DNA (corsia 2, dimensioni indicate). Bande singole costanti della dimensione attesa sono state osservate lungo tutto il range testato, con l'amplificazione più forte rilevata a 55 °C, suggerendo che sia la temperatura ottimale per questo set di innescenti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig3v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figura 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69601/69601fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: Analisi RTddPCR di trascritti selezionati e quantificazione di copie di mRNA. (A,B) Grafici di ampiezza rappresentativo unidimensionale che mostrano la separazione delle gocce per (A) Actγ e (B) Gap43. Ogni punto rappresenta una singola goccia, con gocce blu che indicano amplificazione positiva e gocce grigie che indicano amplificazione negativa. L'asse Y rappresenta l'ampiezza, mentre l'asse X indica la posizione del pozzo nella piastra ddPCR. La netta separazione tra gocce positive (blu) e negative (grigie) conferma una rilevazione robusta dei trascrizioni target con i set di primer indicati. (C) Tabella che riassume il numero di copie/μL e copie per ogni ng di RNA totale per i trascrizioni Actγ e Gap43 nelle frazioni intere di neuroni e neuriti. Le stime del numero di copie sono state ottenute dalla quantificazione assoluta utilizzando i conteggi delle gocce ddPCR (mostrati nei pannelli A,B). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69601/69601fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Isolamento e quantificazione degli mRNA assonali utilizzando inserti di membrana porosi e RTddPCR

The spatial dynamics of mRNA localization and translation within neurons are essential for various mechanisms of neuronal function, including neuronal ...

isolation-quantification-axonal-mrnas-using-porous-membrane-inserts

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

In questo video-articolo vi presentiamo un metodo per l'isolamento e la purificazione...

Isolamento e purificazione di Drosophila Neuroni periferici da Magnetic Ordinamento Bead

I neuroni vengono prima caratterizzata elettrofisiologico. Poi il citoplasma dal neurone registrato è aspirato e sottoposto a trascrizione inversa-PCR per rilevare l'espressione di mRNA per la sintesi degli enzimi dei neurotrasmettitori, canali ionici e recettori.

Profiling di potassio voltaggio-dipendenti espressione di mRNA nei neuroni Canale nigral con singola cella di RT-PCR Tecniche

Un passo dal protocollo passo per isolare e identificare complessi RNA associati attraverso RIP-Chip.

Metodo per l&#39;isolamento e l&#39;identificazione di mRNA, microRNA e componenti proteiche dei complessi Ribonucleoproteina da estratti cellulari con RIP-Chip

Questo articolo descrive un sistema di coltura neuronale che può essere utilizzato per ottenere grandi quantità di campioni assonali puri per analisi biochimiche e immunocitochimiche. Questa tecnica consentirà una migliore comprensione della normale fisiologia assonale e delle vie di segnalazione che portano alla neurodegenerazione.

Produzione e isolamento degli assoni dai neuroni sensoriali per l&#39;analisi biochimica Uso dei filtri porosi

In questo studio, una nuova piattaforma per indagare le firme molecolari intraneuronali di risposta al trattamento nel disturbo bipolare (BD) è stato sviluppato e validato. Epitelio olfattivo da pazienti BD è stato ottenuto attraverso biopsie nasali. Poi laser-capture microdissezione è stato combinato con Tempo reale RT PCR per indagare la firma molecolare della risposta litio in BD.

I neuroni olfattivi ottenuti attraverso nasale biopsia combinato con laser-Capture Microdissection: un approccio potenziale per studiare risposta al trattamento in Disturbi Mentali

Analisi dell'espressione genica di un sottogruppo di cellule in un tessuto specifico rappresenta una grande sfida. In questo articolo si descrive come isolare RNA totale di alta qualità da una popolazione di cellule specifiche, combinando un metodo immunomarcatura rapida con microdissezione laser.

RNA isolamento da cellulari sottopopolazioni specifiche utilizzando laser-capture Microdissection combinazione con Rapid immunomarcatura

Le interazioni RNA-proteina sono al centro di molti processi cellulari. Qui, descriviamo un metodo in vivo per isolare RNA specifico e identificare nuove proteine ad esso associate. Questo potrebbe gettare nuova luce su come gli RNA sono regolati nella cellula.

Novel RNA-Proteine ​​leganti isolamento dalla rapida Metodologia

Qui presentiamo un protocollo per la rilevazione dell'espressione di microRNA nella membrana peritoneale del ratto utilizzando la reazione a catena di polimerasi reattiva-trasversale in tempo reale. Questo metodo è adatto allo studio del profilo di espressione di microRNA nella membrana peritoneale del ratto in diverse condizioni patologiche.

Rilevamento dell&#39;espressione di microRNA nella membrana peritoneale dei ratti usando il quantitativo PCR in tempo reale

Questo protocollo descrive le fasi critiche e le precauzioni necessarie per eseguire la singola cella multisala trascrizione d'inversione della polimerasi reazione a catena dopo patch clamp. Questa tecnica è un metodo semplice ed efficace per analizzare il profilo di espressione di un insieme predeterminato di geni da una singola cellula caratterizzata da registrazioni di patch-clamp.

Singola cella multisala trascrizione inversa Polymerase Chain Reaction dopo Patch-clamp

È descritta una procedura di isolamento di RNA (viaggio) tandem per il recupero dei complessi in modo endogeno formato mRNA-proteina. In particolare, complessi RNA-proteina sono reticolate in vivo, poliadenilazione RNAs sono isolati dagli estratti con i branelli di oligo e particolare mRNA vengono catturati con oligonucleotidi antisenso RNA modificati. Proteine legate a mRNA vengono rilevati dall'analisi del immunoblot.

Una procedura di isolamento del RNA basati su Oligonucleotide Tandem recuperare mRNA-proteina eucariotica complessi

Forniamo un protocollo per l'isolamento della microglia da diverse regioni sezionate di un emisfero cerebrale adulto, seguito dalla preparazione della libreria semiautomatica per il sequenziamento profondo dell'RNA unicellulare di trascrittomi a lunghezza intera. Questo metodo aiuterà a chiarire l'eterogeneità funzionale della microglia in salute e malattia.

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

Impara a isolare e quantificare gli mRNA assonali utilizzando inserti di membrana porosi e RT-ddPCR. Questo metodo consente la separazione dei compartimenti neuronali e la rilevazione di trascritti a bassa copia con alta sensibilità.

Isolamento e quantificazione degli mRNA assonali utilizzando inserti di membrana porosi e RTddPCR

Esplora altri video