Isolamento e quantificazione degli mRNA assonali utilizzando inserti di membrana porosi e RTddPCR

La nostra ricerca studia come la sintesi proteica locale viene regolata e i loro ruoli nella riparazione, sviluppo e degenerazione neurale. I progressi recenti includono tecniche di rilevamento di mRNA ad alta sensibilità, come gdPCR, per identificare MRNA assonali a bassa abbondanza, e compartimentare colture neuronali. Per iniziare, aliquota, 250 microlitri di triazolo in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri corrispondente a ciascun inserimento in un pozzo o inserto di una piastra a sei pozzi.

Tieni da parte i tubi finché non servono. Aggiungi due millilitri di PBS sterile in ogni pozzetto di una seconda piastra a sei pozzi, assicurandoti che il numero di pozzi o piastre corrisponda al numero di inserti. Scavare il mezzo di coltura sia dalla parte superiore inferiore dell'inserto sia trasferire l'inserto nella piastra a sei pozzi contenente PBS.

Ora, usando la pinza, posiziona delicatamente l'inserto, poi aggiungi due millilitri di PBS sopra. Aspira il PBS da entrambi i lati e ripeti il lavaggio due volte. Poi lascia l'inserto in PBS fresco.

Successivamente, usa un raschiatore cellulare sterile per raschiare l'intera frazione neuronale dalla parte superiore dell'inserto. Raccogli il soma lysate dall'inserto. Trasferiscilo in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Centrifuga il tubo a 10.000-15.000 G per due minuti. Scartare il sovrandante e risospendere il pellet in 250 microlitri di trizol. Etichetta questo tubo come l'intera frazione del neurone.

Per raccogliere la frazione di neurite, muovi lentamente un'estremità di un cotton fioc sterile in zigzag dall'alto verso il basso su tutto il lato neuronale dell'inserto. Ruota l'inserto di 90 gradi e ripeti usando l'altra estremità del tampone. Poi butta via il tampon.

Usa un nuovo tampone e muovi in cerchi concentrici, partendo dal centro dell'inserto verso l'esterno, assicurandoti di pulire anche la circonferenza. Inverti l'inserto in modo che il lato neurite sia rivolto verso l'alto. Taglia la membrana usando una nuova lama sterile per bisturi.

Posizionare la membrana tagliata nella piastra a sei pozzi contenente il trizol con il lato del neurite rivolto verso il basso. Assicurati che la membrana sia sommersa. Ora raccogli il trizol contenente il lisato di neurite dal pozzo.

Trasferiscilo in un tubo microcentrifuga da 1,5 millilitri. Procedere con l'isolamento dell'RNA oppure conservare i lisati di soma e neurite a meno 80 gradi Celsius per un elaborato successivo. Prepara reazioni PCR digitali a gocce di trascrizione inversa usando Droplet Digital PCR Ready-To-Use Universal Mix e mira su primer specifici con DNA complementare appropriato.

Pipetta la miscela di reazione nella cartuccia di generazione delle gocce. Poi aggiungi l'olio di generazione nei pozzi designati della cartuccia. Ora, sigilla la cartuccia con la guarnizione.

Genera le goccioline usando il generatore di gocce. Una volta generate le gocce, trasferiscile in una piastra PCR da 96 pozzi e sigillale con della carta prima di inserire la lastra nel termociclatore. Apri il software QX Manager per iniziare l'analisi.

Clicca sull'opzione Sfoglia e apri il file per essere analizzato. Quando il file è stato caricato, la vista del cruscotto appare sul pannello sinistro. Seleziona i pozzi di interesse tenendo premuto il tasto Control mentre clicchi.

Clicca su ampiezza 1D per visualizzare un punto plot. Seleziona Threshold Multiple Wells per applicare la stessa soglia a più di un pozzo. Inserisci il valore soglia basato su dove si osserva una chiara separazione tra gocce positive e negative.

Ora visualizza bene la sezione dati, che mostra la descrizione del campione, i valori delle concentrazioni, il numero di gocce accettate, così come i conteggi positivi e negativi. Clicca su Salva per registrare i risultati della soglia di soglia. La quantificazione dell'RNA tramite il saggio ribo green ha rivelato che le frazioni intere dei neuroni hanno prodotto 212,85 nanogrammi di RNA per inserto mentre le frazioni di neurite hanno prodotto 42,75 nanogrammi.

La validazione PCR ha identificato il set di primer uno come il più specifico per la trascrizione Gap43, mostrando una banda singola distinta. Risultati PCR ambigui per la gamma-actina hanno richiesto un test del gradiente di temperatura utilizzando il set di primer due, che ha mostrato l'amplificazione più forte a 55 gradi Celsius. I grafici di ampiezza RT-ddPCR hanno mostrato una netta separazione delle gocce per la gamma-actina sia in campioni di neuroni interi che di neurite, confermando una rilevazione affidabile dei trascrizioni.

Per Gap43, quasi il 23% del pool di mRNA è presente nei neuriti, rispetto al Gamma-actin, dove solo il 5% del pool di mRNA è presente nei neuriti rispetto all'intera frazione neuronale. Abbiamo dimostrato la presenza di strutture granulografiche di stress negli assoni in condizioni fisiologiche, che inibiscono la sintesi proteica locale. Il nostro protocollo offre un metodo affidabile e coerente per isolare i compartimenti neuronali e rilevare gli mRNA a basso ambiente.

L'analisi futura si concentrerà sull'isolamento e la caratterizzazione di sottodomini assonali distinti, come i coni di crescita e l'asta assonale, oltre l'analisi del volume.