Visualizzazione e quantificazione dell'accoppiamento di basi di RNA intermolecolari in cluster di RNA in vitro utilizzando reporter di RNA broccolo spaccato
29 maggio 2026
Questo protocollo descrive un saggio visivo che utilizza segnalatori di RNA broccoli divisi per rilevare e quantificare l'accoppiamento intermolecolare di basi in cluster di RNA in vitro.
Applichiamo il saggio del segnalatore di RNA spacciato per rilevare e quantificare l'accoppiamento intermolecolare di basi in cluster di RNA in vitro. Le indagini chimiche e le simulazioni suggeriscono interazioni con l'RNA ma non possono misurarle direttamente. Questo protocollo consente una valutazione diretta e accurata all'interno dei cluster di RNA.
Dopo aver preparato i modelli di DNA per la trascrizione in vitro dell'RNA, pulire la superficie di lavoro, i rack per tubi e le pipette con una soluzione di decontaminazione per ribonucleasi. Usa punte filtrate senza ribonucleasi per tutte le fasi di pipettatura. Scongelare le soluzioni di tampone di reazione e nucleotidi fornite con il kit di trascrizione insieme al trifosfato di uridina Cianina 5, o UTP-Cy5, su ghiaccio.
Centrifuga tutti i tubi a 2.000g per due secondi prima dell'uso. Poi calcola il numero di basi timina nel DNA. Determinare i volumi richiesti di UTP e UTP-Cy5 per una reazione di trascrizione di 20 microlitri mantenendo una densità di marcatura costante tra le specie di RNA.
Successivamente, prepara una reazione di trascrizione di 20 microlitri combinando i reagenti presentati. Mescola accuratamente pipettando su e giù e centrifuga a 2.000g per due secondi. Dopo aver incubato la reazione a 37 gradi Celsius per sei ore, aggiungere un microlitro di desossiribonucleasi fornito con il kit, mescolare accuratamente tramite pipetto e centrifugare nuovamente.
Poi incubare a 37 gradi Celsius per altri 15 minuti. Trasferisci la reazione su un tubo da 1,5 millilitri. Aggiungi 115 microlitri di acqua priva di nucleasi e 15 microlitri di soluzione di cesto di acetato di ammonio fornita con il kit.
Dopo la miscelazione, centrifugare la soluzione a 2.000g per due secondi. Successivamente, aggiungi 150 microlitri di fenol cloroformio al tubo e mescola delicatamente per unire le fasi. Centrifugare a 16.000g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Poi trasferisci la fase acquosa superiore su un nuovo tubo. Aggiungi un volume uguale di cloroformio alla soluzione trasferita e mescola accuratamente per garantire una corretta interazione di fase. Ora centrifuga a 16.000g per due minuti a quattro gradi Celsius e ripeti ancora una volta il processo di separazione delle fasi.
Poi trasferisci lo strato acquoso di circa 100-150 microlitri in un nuovo tubo. Aggiungi 900 microlitri di isopropanolo e mescola bene. Dopo aver allicitato la soluzione in tubi separati, conservare i campioni a meno 20 gradi Celsius durante la notte o fino a un mese.
Centrifugare il campione di RNA in isopropanolo a 16.000g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Rimuovere con attenzione l'isopropanolo senza disturbare il pellet di RNA. Poi aggiungi un millilitro di etanolo al 70% preparato in acqua senza nucleasi al pellet.
Centrifuga a 16.000g per due minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver rimosso l'etanolo, aggiungere un millilitro di etanolo al 70% preparato in acqua priva di nucleasi al tubo e ripetere la centrifugazione. Durante il lavaggio finale con etanolo, rimuovere la maggior parte dell'etanolo usando una pipetta da 1.000 microlitri.
Centrifugare brevemente a 2.000g per due secondi in una mini centrifuga da banco e rimuovere eventuali residui di etanolo usando una pipetta da 20 microlitri. Una volta che il pellet di RNA è essiccato, si risospende in 20 microlitri di acqua priva di nucleasi. Tieni il campione sul ghiaccio e proteggilo dalla luce.
Utilizzando uno spettrofotometro di microvolume, misura la concentrazione e la purezza dell'RNA. Assicurarsi che il rapporto di assorbanza a 260 su 280 nanometri sia di circa 2,0 e che il rapporto a 260 su 230 nanometri sia superiore a 2,0. Scongelare un tubetto di soluzione di spermina da 100 millimolari e il 50% di glicole polietilenico 8.000 su ghiaccio.
Prepara da zero un buffer di ripiegamento dell'RNA 10X combinando i componenti mostrati. Dopo aver miscelato accuratamente i componenti tramite pipetta, centrifugare a 2.000g per due secondi in una mini centrifuga da banco da banco. Per la condizione di co-ripiegatura, in un tubo PCR da 200 microlitri si combina RNA trascritto in vitro che trasporta sequenza superiore o inferiore, buffer di ripiegamento dell'RNA e acqua priva di nucleasi.
Mescola accuratamente pipettando su e giù e centrifuga come dimostrato prima. Riscalda il campione a 90 gradi Celsius per due minuti. Trasferisci immediatamente il campione a temperatura ambiente.
Proteggi dalla luce e incuba per un'ora. Per la condizione di piegamento separato, riscalda il campione di RNA in un tubo PCR da 200 microlitri e poi lo metti immediatamente sul ghiaccio per almeno 15 minuti. In un tubo PCR da 200 microlitri, si combina RNA trascritto in vitro che trasporta sequenza superiore o inferiore, buffer di ripiegamento dell'RNA 10 volte e acqua priva di nucleasi.
Incubare la reazione a temperatura ambiente per 30 minuti, protetta dalla luce. Ora combina i campioni di RNA contenenti le sequenze superiore e inferiore in un unico tubo PCR e mescola accuratamente pipettando su e giù. Centrifuga a 2.000g per due secondi in una mini centrifuga da banco.
Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Per entrambe le condizioni, aggiungere sei microlitri di un premix uno a due di spermina da 100 millimolari e al 50% di glicole polietilenico 8.000. Dopo aver miscelato il contenuto, centrifugare a 2.000g per due secondi in una mini centrifuga da banco.
Ora mescola due microlitri di un millimolare DFHBI-1T alla reazione e centrifuga di nuovo. Carica la reazione in un vetro con copertura a camera di vetro. Incubare la camera a temperatura ambiente per quattro ore al buio con il coperchio per minimizzare l'evaporazione.
Carica il vetro con camera di vetro sul palco del microscopio. Accendi il laser, poi usa gli oculari per localizzare e mettere a fuoco il campione. Configura il microscopio per visualizzare ogni regione di interesse con il canale cyanine 5 prima in ciascun piano Z.
Poi immagini la stessa regione di interesse usando il canale proteico fluorescente verde. Imposta il tempo di esposizione a 500 millisecondi per tutti i canali. Poi imposta la potenza del laser all'80% per il canale proteico fluorescente verde e al 40% per il canale 5 della cianina.
Utilizzando una dimensione Z di 150 nanometri, si immagina una regione di copertura di scorrimento al di fuori della goccia di reazione a temperatura ambiente. Successivamente, quantifica l'accoppiamento intermolecolare di basi utilizzando software di analisi delle immagini. All'induzione del clustering dell'RNA, entrambi gli RNA formavano cluster singolarmente o insieme.
La fluorescenza di DFHBI-1T all'interno dei cluster di RNA era sostanzialmente inferiore per gli RNA superiori o inferiori rispetto alla condizione di co-ripiegatura. Nella condizione di folding separato, il segnale normalizzato DFHBI-1T era 0,031, paragonabile ai livelli di base osservati solo in alto o in basso. Shu-top, shu-bottom, shu-anti-top e shu-anti-bottom hanno mostrato singolarmente una fluorescenza minima DFHBI-1T.
Il co-folding dello shu-top con lo shu-bottom o dello shu-anti-top con lo shu-anti-bottom produceva un segnale DFHBI-1T più alto rispetto al piegamento separato. Il co-folding di shu-top e shu-bottom ha portato a un aumento di 5,63 volte della fluorescenza normalizzata di DFHBI-1T. Il piegamento separato dello shu-top e del shu-bottom ha mostrato solo un aumento di 1,04 volte paragonabile ai livelli di base.
Shu-top mescolato con shu-anti-bottom e shu-anti-top mescolato con shu-bottom ha mostrato una fluorescenza DFHBI-1T più alta rispetto alle coppie dello stesso orientamento in entrambe le condizioni di piegatura. Il co-folding di shu-top con shu-anti-bottom e shu-anti-top con shu-bottom ha portato rispettivamente a aumenti di fluorescenza DFHBI-1T di 61,86 e 82,60 volte. Il ripiegamento separato di queste coppie miste ha prodotto aumenti minori rispettivamente di 2,69 e 4,94 volte.
La considerazione più importante è che la generazione robusta di segnali può richiedere reagenti di affollamento, mentre la sensibilità dipende da una dimerizzazione e dal piegamento efficienti degli RNA spezzati del broccolo. Questo saggio integra gli approcci di pull-down dell'RNA e dell'elettroforesi su gel per studiare l'accoppiamento intermolecolare di basi nei cluster di RNA. Questo saggio può esaminare gli effetti di sequenze di RNA, elicasi e ioni sull'accoppiamento intermolecolare di basi all'interno dei cluster di RNA.
Overview
This article presents a protocol for directly detecting and quantifying intermolecular base pairing in RNA clusters in vitro using a split Broccoli RNA reporter assay. The method leverages fluorescently labeled RNAs and a split aptamer system to visualize and measure RNA–RNA interactions, providing a quantitative alternative to chemical probing and computational predictions.
Key Study Components
Area of Science
- Molecular biology
- RNA biochemistry
- Fluorescence microscopy
Background
- RNA clustering is driven by multivalent intermolecular RNA–RNA interactions.
- Traditional methods like chemical probing and computational simulations infer but do not directly measure these interactions.
- Direct assessment of intermolecular base pairing within RNA clusters has been limited.
- The split Broccoli RNA aptamer system enables fluorescence-based detection of RNA dimerization.
Purpose of Study
- To develop and demonstrate a visual assay for direct detection of intermolecular base pairing in RNA clusters.
- To quantify how in vitro clustering conditions affect RNA–RNA interactions.
- To provide a complementary approach to existing RNA interaction assays.
Methods Used
- Preparation of DNA templates and in vitro transcription of RNAs labeled with Cy5.
- Purification of transcribed RNAs using phenol-chloroform extraction and ethanol precipitation.
- Folding of RNAs under co-folding and separate folding conditions with crowding reagents (spermine, PEG 8000).
- Assembly of split Broccoli RNA reporters and addition of DFHBI-1T fluorophore.
- Fluorescence imaging using confocal microscopy and quantitative image analysis.
Main Results
- DFHBI-1T fluorescence was substantially higher in co-folded RNA samples compared to separately folded or single RNA controls.
- Co-folding of complementary split Broccoli RNAs resulted in up to 82.6-fold increases in fluorescence, indicating robust intermolecular base pairing.
- Mixed orientation pairs (shu-top with shu-anti-bottom, etc.) showed the highest fluorescence increases upon co-folding.
- Robust signal generation depended on crowding reagents and efficient RNA dimerization.
Conclusions
- The split Broccoli RNA reporter assay enables direct, quantitative assessment of intermolecular base pairing in RNA clusters.
- This method complements traditional RNA interaction assays such as pull-downs and gel electrophoresis.
- The assay can be used to study the effects of RNA sequence, helicases, and ions on RNA–RNA interactions in vitro.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Direct quantification of intermolecular RNA base pairing in vitro addresses a critical gap in early discovery, enabling mechanistic de-risking of RNA-driven clustering phenomena. The split Broccoli RNA reporter assay provides a quantitative, fluorescence-based readout for RNA–RNA interactions, supporting predictive confidence in target validation and assay development. This capability enhances portfolio triage by clarifying the molecular basis of RNA clustering under defined conditions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of RNA–RNA interaction hypotheses within clustered assemblies.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing specific intermolecular base pairing from background association.
- Provides quantitative data to inform target validation and early-stage portfolio decisions.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated RNA cluster systems for downstream screening workflows.
- Delivers standardized, reproducible fluorescence outputs for assay benchmarking.
- Enables reliable evaluation of sequence, helicase, or ionic effects on RNA–RNA interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant RNA clustering models when mechanistic continuity is required.
- Supports risk-adjusted advancement by providing quantitative, comparative readouts across experimental conditions.
- Offers predictive de-risking for RNA-targeted therapeutic strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery continuum from hypothesis-driven target validation through assay development and preclinical mechanistic studies.
- Discovery Biology: Quantifies direct intermolecular base pairing, clarifying RNA clustering mechanisms.
- Screening: Provides reproducible, quantitative fluorescence outputs for comparative analysis.
- Analytics: Enables statistical comparison of folding conditions and sequence variants using normalized fluorescence measurements.
- Translational Research: Supports continuity by modeling RNA–RNA interactions relevant to disease or therapeutic context.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse RNA interaction studies across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA clustering studies.
- Operational Value: Standardizes detection and quantification of RNA–RNA interactions for scalable workflows.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk for RNA-targeted assets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization based on direct, quantitative mechanistic data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA biochemistry and fluorescence microscopy.
- Needs access to confocal imaging and quantitative image analysis infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of RNA preparation and folding protocols.
- May require adaptation for different RNA sequences or clustering models.
- Sensitivity depends on efficient dimerization and folding of split Broccoli RNAs and use of crowding reagents.
