Name: Visualizzazione e quantificazione dellaccoppiamento di basi di RNA intermolecolari in cluster di RNA in vitro utilizzando reporter di RNA broccolo spaccato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-05-29T16:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Scopri come rilevare e quantificare l'accoppiamento di basi intermolecolari nei cluster di RNA in vitro utilizzando il reporter di RNA broccolo spaccato. Questo metodo offre una valutazione diretta e quantitativa delle interazioni RNA-RNA.

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	<li>Jain, A., Vale, R. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+phase+transitions+in+repeat+expansion+disorders.">RNA phase transitions in repeat expansion disorders.</a> Nature. 546, 243-247 (2017).</li><li>Langdon, E. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNA+structure+determines+specificity+of+a+polyQ-driven+phase+separation.">mRNA structure determines specificity of a polyQ-driven phase separation.</a> Science. 360, 922-927 (2018).</li><li>Tauber, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+RNA+condensation+by+the+DEAD-box+protein+eIF4A.">Modulation of RNA condensation by the DEAD-box protein eIF4A.</a> Cell. 180, 411-426 (2020).</li><li>Tian, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+intermolecular+base+pairing+in+Drosophila+germ+granules+by+mRNA+folding+and+its+implications+in+fly+development.">Controlling intermolecular base pairing in Drosophila germ granules by mRNA folding and its implications in fly development.</a> Nat Commun. 16, 8135 (2025).</li><li>Van Treeck, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+self-assembly+contributes+to+stress+granule+formation+and+defining+the+stress+granule+transcriptome.">RNA self-assembly contributes to stress granule formation and defining the stress granule transcriptome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 115, 2734-2739 (2018).</li><li>Bose, M., Rankovic, B., Mahamid, J., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+architectural+role+of+specific+RNA&#8211;RNA+interactions+in+oskar+granules.">An architectural role of specific RNA&#8211;RNA interactions in oskar granules.</a> Nat Cell Biol. 26, 1934-1942 (2024).</li><li>Jambor, H., Brunel, C., Ephrussi, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimerization+of+oskar+3&#8242;+UTRs+promotes+hitchhiking+for+RNA+localization+in+the+Drosophila+oocyte.">Dimerization of oskar 3&#8242; UTRs promotes hitchhiking for RNA localization in the Drosophila oocyte.</a> RNA. 17, 2049-2057 (2011).</li><li>Majumder, S., Coupe, S., Fakhri, N., Jain, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-encoded+intermolecular+base+pairing+modulates+fluidity+in+DNA+and+RNA+condensates.">Sequence-encoded intermolecular base pairing modulates fluidity in DNA and RNA condensates.</a> Nat Commun. 16, 4258 (2025).</li><li>Nguyen, H. T., Hori, N., Thirumalai, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensates+in+RNA+repeat+sequences+are+heterogeneously+organized+and+exhibit+reptation+dynamics.">Condensates in RNA repeat sequences are heterogeneously organized and exhibit reptation dynamics.</a> Nat Chem. 14, 775-785 (2022).</li><li>Poudyal, R. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+sequence+and+structure+control+assembly+and+function+of+RNA+condensates.">RNA sequence and structure control assembly and function of RNA condensates.</a> RNA. 27, 1589-1601 (2021).</li><li>Smola, M. J., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+2&#8242;-hydroxyl+acylation+analyzed+by+primer+extension+and+mutational+profiling+(SHAPE-MaP)+for+direct,+versatile+and+accurate+RNA+structure+analysis.">Selective 2&#8242;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension and mutational profiling (SHAPE-MaP) for direct, versatile and accurate RNA structure analysis.</a> Nat Protoc. 10, 1643-1669 (2015).</li><li>Zubradt, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DMS-MaPseq+for+genome-wide+or+targeted+RNA+structure+probing+in+vivo.">DMS-MaPseq for genome-wide or targeted RNA structure probing in vivo.</a> Nat Methods. 14, 75-82 (2017).</li><li>Nguyen, H. T., Hori, N., Thirumalai, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory+and+simulations+for+RNA+folding+in+mixtures+of+monovalent+and+divalent+cations.">Theory and simulations for RNA folding in mixtures of monovalent and divalent cations.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116, 21022-21030 (2019).</li><li>Maity, H., Nguyen, H. T., Hori, N., Thirumalai, D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odd&#8211;even+disparity+in+the+population+of+slipped+hairpins+in+RNA+repeat+sequences+with+implications+for+phase+separation.">Odd&#8211;even disparity in the population of slipped hairpins in RNA repeat sequences with implications for phase separation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 120, e2301409120 (2023).</li><li>Liao, J. N., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+intermolecular+base+pairing+using+AMT+crosslinking+in+mammalian+cells+during+oxidative+stress.">Characterization of intermolecular base pairing using AMT crosslinking in mammalian cells during oxidative stress.</a> bioRxiv. , (2025).</li><li>Kirsch, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+streamlined+protocol+for+the+detection+of+mRNA&#8211;sRNA+interactions+using+AMT-crosslinking+in+vitro.">A streamlined protocol for the detection of mRNA&#8211;sRNA interactions using AMT-crosslinking in vitro.</a> Biotechniques. 67, 178-183 (2019).</li><li>Aw, J. G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+mapping+of+eukaryotic+RNA+interactomes+reveals+principles+of+higher-order+organization+and+regulation.">In vivo mapping of eukaryotic RNA interactomes reveals principles of higher-order organization and regulation.</a> Mol Cell. 62, 603-617 (2016).</li><li>Alam, K. K., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+split+aptamer+for+visualizing+RNA&#8211;RNA+assembly+in+vivo.">A fluorescent split aptamer for visualizing RNA&#8211;RNA assembly in vivo.</a> ACS Synth Biol. 6, 1710-1721 (2017).</li><li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+transcription+of+nucleic+acids+with+efficient+T7+promoters.">Maximizing transcription of nucleic acids with efficient T7 promoters.</a> Commun Biol. 3, 439 (2020).</li><li>Imburgio, D., Rong, M., Ma, K., McAllister, W. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+promoter+recognition+and+start+site+selection+by+T7+RNA+polymerase+using+a+comprehensive+collection+of+promoter+variants.">Studies of promoter recognition and start site selection by T7 RNA polymerase using a comprehensive collection of promoter variants.</a> Biochemistry. 39, 10419-10430 (2000).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9, 671-675 (2012).</li><li>Shanaa, O. A., Rumyantsev, A., Sambuk, E., Padkina, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+production+of+RNA+aptamers+and+nanoparticles:+problems+and+prospects.">In vivo production of RNA aptamers and nanoparticles: problems and prospects.</a> Molecules. 26, (2021).</li><li>Rangan, P., DeGennaro, M., Jaime-Bustamante, K., Coux, R. X., Martinho, R. G., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+spatial+control+of+germ-plasm+RNAs.">Temporal and spatial control of germ-plasm RNAs.</a> Curr Biol. 19, 72-77 (2009).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence-independent+self-assembly+of+germ+granule+mRNAs+into+homotypic+clusters.">Sequence-independent self-assembly of germ granule mRNAs into homotypic clusters.</a> Mol Cell. 78, 941-950 (2020).</li><li>Lorenz, R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ViennaRNA+package+2.0.">ViennaRNA package 2.0.</a> Algorithms Mol Biol. 6, 26 (2011).</li><li>Filonov, G. S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Broccoli:+rapid+selection+of+an+RNA+mimic+of+green+fluorescent+protein+by+fluorescence-based+selection+and+directed+evolution.">Broccoli: rapid selection of an RNA mimic of green fluorescent protein by fluorescence-based selection and directed evolution.</a> J Am Chem Soc. 136, 16299-16308 (2014).</li><li>Song, W., Strack, R. L., Svensen, N., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plug-and-play+fluorophores+extend+the+spectral+properties+of+Spinach.">Plug-and-play fluorophores extend the spectral properties of Spinach.</a> J Am Chem Soc. 136, 1198-1201 (2014).</li><li>Guet, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+Spinach-tagged+RNA+and+gene+localization+to+image+gene+expression+in+live+yeast.">Combining Spinach-tagged RNA and gene localization to image gene expression in live yeast.</a> Nat Commun. 6, 8882 (2015).</li><li>You, M., Litke, J. L., Jaffrey, S. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+metabolite+dynamics+in+living+cells+using+a+Spinach-based+riboswitch.">Imaging metabolite dynamics in living cells using a Spinach-based riboswitch.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112, E2756-E2765 (2015).</li><li>Zinskie, J. A., Roig, M., Janetopoulos, C., Myers, K. A., Bruist, M. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+of+small+nucleolar+RNA+tagged+with+the+broccoli+aptamer+in+yeast.">Live-cell imaging of small nucleolar RNA tagged with the broccoli aptamer in yeast.</a> FEMS Yeast Res. 18, (2018).</li></ol>

<table><tbody><tr><td>1 Uomo MgCl2</td><td>Millipore Sigma</td><td>M1028</td><td>Utilizzato per la preparazione di 10 e volte; Buffer di ripiegamento dell'RNA.</td></tr><tr><td>2M KCl</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AM9640G</td><td>Utilizzato per la preparazione di 10 e volte; Buffer di ripiegamento dell'RNA.</td></tr><tr><td>50% PEG 8000</td><td>NEB</td><td>M0204S</td><td>Componente del kit di legasi di RNA T4; usata come reagente di affollamento molecolare per indurre il clustering dell'RNA. & nbsp;</td></tr><tr><td>Etanolo assoluto, 200 proof</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>T038181000CS</td><td>Utilizzato per la preparazione del buffer di lavaggio di RNA.</td></tr><tr><td>Fenolo acido:cloroformio, pH 4,5 (con IAA, 125:24:1)</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AM9722</td><td>Usato per la purificazione dell'RNA.</td></tr><tr><td>Aminoallile-UTP-Cy5</td><td>Jena Bioscienza</td><td>NU-821-CY5</td><td>Utilizzato per la marcatura dell'RNA durante la trascrizione in vitro.</td></tr><tr><td>Vetrata di copertura camerata</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>155409PK</td><td>Camera di imaging per reazioni di clustering RNA.</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>C298-500</td><td>Usato per la purificazione dell'RNA.</td></tr><tr><td>DFHBI-1T</td><td>Lucerna</td><td>410</td><td>Utilizzato come fluoroforo per la rilevazione dell'aptamero dell'RNA del broccolo.</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>D12345</td><td>Anidro; grado biologia molecolare; utilizzato per la preparazione al DFHBI-1T. &nbsp;</td></tr><tr><td>DNA Pulito & Kit Concentratore</td><td>Zymo</td><td>D4014</td><td>Utilizzato per la pulizia dei prodotti a base di DNA prima della trascrizione di T7.</td></tr><tr><td>Kit per l'estrazione del gel di DNA</td><td>NEB</td><td>T1020L</td><td>Usato per l'estrazione del gel.</td></tr><tr><td>Bagno a secco</td><td>Benchmark Scientific</td><td>BSH1001</td><td>Utilizzato per riscaldare campioni di RNA in tubi microcentrifughe.</td></tr><tr><td>FIJI/ImageJ</td><td>NIH (Istituti Nazionali di Salute)</td><td>N/A</td><td>software open source per l'analisi delle immagini; utilizzato per la quantificazione dell'intensità di fluorescenza e l'analisi del ROI.</td></tr><tr><td>Sistema di elettroforesi su gel &nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B2-BP</td><td>Usato per l'elettroforesi in gel del DNA.</td></tr><tr><td>Tintura di carico gel, viola (6 volte)</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td>Utilizzato come colorante di caricamento per l'elettroforesi del gel di DNA.</td></tr><tr><td>Microscopio a illuminazione istantanea strutturata</td><td>VisiTech internazionale</td><td>VT-iSIM</td><td>Un microscopio confocale in grado di visualizzare GFP e fluorescenza Cy5.</td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>327272500</td><td>Usato per la purificazione dell'RNA.</td></tr><tr><td>Kit di trascrizione MEGAscript T7</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AM1334</td><td>Utilizzato per la trascrizione in vitro T7. Il kit include soluzioni nucleotidiche (ATP, CTP, GTP, UTP) e DNasi.</td></tr><tr><td>Tubi microcentrifughe</td><td>Genesee Scientific</td><td>22-284</td><td>Tubo da 1,5 mL; utilizzata per memorizzare modelli di DNA per trascrizione in vitro, prodotti a RNA e aliquote di spermina e DFHBI-1T.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Mini centrifuga</td><td>Benchmark Scientific</td><td>Z763845</td><td>Usato per centrifugazioni brevi.</td></tr><tr><td>Spettrofotometro Nanodrop One</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-400-518</td><td>Spettrofotometro di microvolume per misurare la concentrazione e la qualità di DNA e RNA.</td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AM9937</td><td>Utilizzato per la risospensione di pellet di RNA, la preparazione di lavaggio e ripiegamento di RNA buffer, e la diluizione di spermina e DFHBI-1T.</td></tr><tr><td>Calcolatore online di massa molare</td><td>New England Biolabs (NEB)</td><td>N/A</td><td>Strumento online utilizzato per calcolare la massa di RNA dalla quantità molare (ad esempio, pmol).</td></tr><tr><td>Tubi PCR in polipropilene</td><td>Corning</td><td>3745</td><td>200 & mu; Tubi L PCR utilizzati per PCR, trascrizione in vitro e reazioni di clustering dell'RNA</td></tr><tr><td>Alimentazione di base PowerPac</td><td>Bio-rad</td><td>1645050</td><td>Usato per l'elettroforesi in gel del DNA.</td></tr><tr><td>Ciclatore termico Proflex PCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>44-840-73</td><td>Utilizzato per PCR, trascrizione in vitro e riscaldamento di campioni di RNA in tubetti PCR.</td></tr><tr><td>Q5 Alta Fedeltà 2 volte; Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0492S</td><td>Usato come 2 volte; Master mix ad alta fedeltà.</td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata &nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td>Utilizzato per la purificazione e la pelletazione dell'RNA. & nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione di decontaminazione RNase</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>AM9782</td><td>Utilizzato per pulire banchi di laboratorio e superfici per minimizzare la contaminazione da RNasi.</td></tr><tr><td>Spermina&nbsp; Tetraidrocloruro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1141-1G</td><td>Utilizzato per indurre il clustering dell'RNA.</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Millipore Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td>Utilizzato per la preparazione del tampone Tris (pH 7,0).</td></tr><tr><td>Agarosio ultrapuro</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>16500500</td><td>Utilizzato per l'elettroforesi del gel del DNA.</td></tr></tbody></table>

visualizzazione e quantificazione dell'accoppiamento di basi di rna intermolecolari in cluster di rna in vitro utilizzando reporter di rna broccolo spaccato

Visualization and Quantification of Intermolecular RNA Base Pairing in in vitro RNA Clusters Using Split Broccoli RNA Reporters

Visualizzazione e quantificazione dell'accoppiamento di basi di RNA intermolecolari in cluster di RNA in vitro utilizzando reporter di RNA broccolo spaccato

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