Trypsinizing e Trapianto cellule di mammifero

La tecnologia della coltura tissutale ha trovato ampia applicazione nel campo della biologia cellulare. Tuttavia, le cellule in coltura richiedono una manutenzione regolare per rimanere in salute. Quando le cellule raggiungono la cofluenza, devono essere sub-coltivate o fatte passare.

In caso contrario, si ottiene una riduzione della crescita e, infine, la morte cellulare. In questo video, dimostriamo come mantenere le cellule di coltura tissutale sia per le linee cellulari aderenti che per quelle in sospensione. Ciao, sono Ricky qui al Laboratorio del Dr.LAN presso la Molecular Pathology Laboratories Network nel Tennessee orientale.

Oggi voglio mostrarvi due tecniche per confezionare le celle in sospensione e aderenti. Al passaggio una piastra di cellule. Inizieremo con una coltura primaria coltivata in co-fluidità in una piastra di Petri da 60 millimetri o in una fiaschetta di coltura tissutale quadrata da 25 centimetri contenente cinque mil di terreno di coltura tissutale.

Iniziamo rimuovendo tutto il terreno dalla coltura primaria con la pipetta sterile. Quindi laviamo il monostrato di cellule aderenti una o due volte con un piccolo volume di 37 gradi Celsius HBSS senza calcio e magnesio. Per rimuovere qualsiasi residuo di siero fetale bovino che potrebbe inibire l'azione dell'enzima tripsina che si aggiungerà nel passaggio successivo.

Quindi, aggiungere una quantità sufficiente di soluzione calda di tripsina EDTA alla coltura in modo da coprire lo strato cellulare aderente. Quindi puoi posizionare il piatto su una teglia scaldavivande a 37 gradi Celsius per uno o due minuti. Dopo l'incubazione, picchiettare il fondo della piastra su una superficie piana per rimuovere le cellule.

Controllare la coltura con un microscopio invertito per assicurarsi che le cellule siano arrotondate per eccesso, il che indica che sono staccate dalla superficie. Se le celle non sono sufficientemente staccate, rimettere la piastra nel vassoio scaldavivande per un altro minuto o due. Dopo aver esaminato l'endoscopio, sciacquare la capsula in terreno completo e pipettare la sospensione in un tubo conico da 15 mil contenente due mil di terreno completo.

Girare le celle verso il basso per pellettare e risospendere il pellet in mezzo completo. A questo punto, aggiungere un volume uguale di sospensione cellulare a ciascuna delle piastre fresche che sono state adeguatamente etichettate. In alternativa, le cellule possono essere contate utilizzando un emocitometro e diluite alla densità desiderata in modo da poter aggiungere un numero specifico di cellule a ciascuna piastra.

Assicurati di etichettare ogni targa con la data della sottocultura e il numero di passaggio. Dopo aver aggiunto la sospensione cellulare, posizionare un mil di terreno fresco in ogni nuova coltura. Ora incubare le piastre in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius al 5% di CO2.

Dopo aver incubato le cellule durante la notte, aggiungi del terreno fresco alle piastre e rimettile a 37 gradi. Una volta che la piastra è cresciuta fino a diventare consapevole, è possibile passare nuovamente la piastra ripetendo questa procedura e continuare il passaggio se necessario. Ora vi mostreremo come far passare le cellule in coltura in sospensione.

Il confezionamento delle cellule in coltura in sospensione è più semplice rispetto alle cellule di aderenza. Prima di confezionare le colture in sospensione, le cellule devono essere mantenute somministrandole ogni due o tre giorni fino a quando non raggiungono la cofluenza, ovvero quando le cellule si aggregano nella sospensione e il terreno appare turido. Quando il pallone viene fatto roteare.

Per fare ciò, rimuovere il pallone di celle di sospensione dall'incubatrice, facendo attenzione a non disturbare quelle che si sono depositate sul pallone. Sul fondo asettico, rimuovere e scartare circa un terzo del terreno dal pallone e sostituirlo con un volume uguale di terreno di preriscaldamento a 37 gradi Celsius. Dopo aver cambiato il mezzo, fai roteare il pallone e rimettilo nell'incubatore, che si trova a 37 gradi Celsius, 5% di CO2.

Se la quantità è inferiore a 15 mil, un mezzo nel pallone incuba il pallone in posizione orizzontale per migliorare il contatto tra cellula e mezzo. In caso contrario, il pallone può essere incubato verticalmente nei giorni in cui le colture non vengono alimentate. Controllali facendo roteare le parti piatte per risospendere le celle.

Assicurati di osservare eventuali cambiamenti di colore nel terreno che indicano una buona crescita metabolica. Una volta che le colture sono confluenti, che dovrebbero essere circa 2,5 milioni di cellule per mil, è possibile farle passare. Ancora una volta, vi abbiamo appena mostrato come far passare le cellule in coltura sia per le colture aderenti che per quelle in sospensione.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con tutti i tuoi esperimenti.