Name: La differenziazione in vitro di staminali embrionali di topo (MES) Cellule con il metodo goccia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-07-23T22:33:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Impara la differenziazione in vitro di staminali embrionali di topo usando il metodo goccia sospesa. Questa tecnica permette di formare corpi embrionali per studiare la biologia cellulare e le potenziali terapie rigenerative.

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<ol><li> Gelatinizzare T75 beuta con una soluzione di 0,1% di gelatina e la piastra di incubare a 37 ° C, 5% CO 2 colture di tessuti incubatore durante la notte un giorno prima. </li><li> Estrarre le cellule MES da incubare, aspirare il terreno, lavare la coltura delle cellule ES con PBS, aggiungere la soluzione tripsina 0,05% per ricoprire il fondo del piatto (2 piastra ml/100mm). </li><li> Incubare a 37 ° C per circa 1 minuti, fino a quando le cellule sono muta fuori dal piatto. </li><li> Delicatamente triturare (pipetta su e giù) le cellule trypsinized quattro a sei volte per disperdere le cellule ES con una pipetta Pasteur collegato,. Trasferire le cellule ES dispersi in un tubo da 15 ml per centrifuga conica contenente preriscaldata (37 ° C) media MES. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione. Aspirare il surnatante, aggiungere 10 ml di terreno MES e pipettare su e giù per formare una sospensione di cellule singole. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in un pallone T75 preverniciato con 0,1% di gelatina e incubare a 37 ° C con 5% di CO 2 per un&#39;ora * Dopo un&#39;ora, i fibroblasti hanno attaccato alla piastra, ma le cellule staminali rimangono nel terreno. Pipettare il medium per raccogliere le cellule staminali. </li><li> Spin le cellule a 1000 rpm per 5 minuti e aspirare al largo della media MES. Quindi aggiungere un altro 10 ml di medium di differenziazione MES e risospendere le cellule pipettando ripetitivo fino a quando non sembra essere una sospensione fine di cellule. </li><li> Contare le celle con un mezzo di differenziazione emocitometro utilizzare per diluire la sospensione di cellule staminali ad una concentrazione da 400 a 500 cellule per 20 ul (20ul/drop) in una bacinella sterile. </li><li> Sollevare il coperchio, capovolgere delicatamente e collocarlo sulla parte superiore del piatto che contiene 10 ml di PBS. Utilizzando una pipetta multicanale, fare file di 20 ul gocce sul up-trasformato superficie interna del coperchio del piatto coltura di tessuti. </li><li> Con attenzione la capsula in incubatrice per 2 giorni. Dopo due giorni, con attenzione capovolgere la piastra di copertura, aspirare 180 media ul differenziazione fresco e mettere alcune gocce nel pozzetto di una piastra a 96 pozzetti ultrabassa attaccamento. Poi la goccia pick-up con le gocce pipetta e il trasferimento, uno ad uno, alla piastra a 96 pozzetti. Posizionare le piastre in indisturbati per 3 giorni incubatrice. </li><li> Cappotto ciascun pozzetto di una 48-e piastra di coltura tissutale con 300ul di 0,1% di gelatina. Dopo aver aggiunto la gelatina, incubare la piastra di una notte a 37 ° C un giorno prima prima del trasferimento della Ebs. </li><li> Il giorno dopo, aspirare la gelatina dal 48-pozzetti. Poi aggiungere 300 ul di medio differenziazione in ciascun pozzetto. Trasferire la EB dal 96 pozzetti alle 48 e gelatina rivestite piatti uno per uno. Modificare il medium il giorno dopo e quindi modificare il medium a giorni alterni per mantenere le cellule. </li><li> Spontanea contrazioni cardiaomyocyte dovrebbe essere evidente entro 7 giorni. </li></ol>

<ol><li>Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pluripotent+mouse+embryonic+stem+cells+are+able+to+differentiate+into+cardiomyocytes+expressing+chronotropic+responses+to+adrenergic+and+cholinergic+agents+and+Ca2%2B+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers.</a> Differentiation. 48, 173-182 (1991).</li>
<li>Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transition+in+cardiac+contractile+sensitivity+to+calcium+during+the+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> J Cell Biol. 126, (1994).</li>
</ol>

Gli svantaggi del metodo della goccia pendente sono i seguenti: il volume di una goccia di liquido è limitata a meno di 50ul dovuto al mantenimento di gocce sul coperchio dalla tensione superficiale, ed è impossibile cambiare il supporto per appendere gocce. Osservazione di formare EBS in gocce direttamente con la microscopia è anche molto difficile durante la coltivazione. Più ulteriormente più, il metodo goccia consiste di due fasi, quindi, una serie di passo del metodo goccia può essere fastidioso.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Serum bovino fetale (FBS)</td><td>Reagente</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Aminoacidi non essenziali</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina / Stretomicina</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Reagente</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11360-70</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-mercapto&amp;#8211;etanolo</td><td>Reagente</td><td>Chemicon International</td><td>ES-007-E</td><td></td></tr><tr><td>fattore inibitore della leucemia (LIF)</td><td>Reagente</td><td>Chemicon International</td><td>LIF2005</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti con attacco ultrabasso</td><td>Strumento</td><td>Corning</td><td>3474</td><td></td></tr></tbody></table>

la differenziazione in vitro di staminali embrionali di topo (mes) cellule con il metodo goccia

In vitro Differentiation of Mouse Embryonic Stem (mES) Cells Using the Hanging Drop Method

Le cellule staminali hanno la potenzialità notevoli di svilupparsi in molti tipi cellulari diversi. Quando una cellula staminale si divide, ogni nuova cellula ha il potenziale per rimanere sia una cellula staminale o diventare un altro tipo di cellula con una funzione più specializzati, questo promettente della scienza sta portando gli scienziati a studiare la possibilità di terapie basate sulle cellule per curare le malattie. Quando la cultura in sospensione senza fattori antidifferenziazione, le cellule staminali embrionali differenziare spontaneamente e formare aggregati pluricellulari tridimensionale. Questi aggregati di cellule si chiamano corpi embrionali (EB). Hanging cultura goccia è un metodo ampiamente utilizzato formazione EB induzione. Il fondo arrotondato di goccia consente l&#39;aggregazione delle cellule staminali in grado di fornire cellule MES un buon ambiente per la formazione di EBS. Il numero di cellule ES aggregatied in una goccia può essere controllata variando il numero di cellule nella sospensione cellulare prima di essere appeso come una goccia dal coperchio della piastra Petri. Con questo metodo possiamo riproducibile forma omogenea EB da un numero predeterminato di cellule ES.

Questo video mostra come condurre differenziamento in vitro di cellule staminali embrionali di topo di corpi embrionali usando il metodo goccia pendente.

La differenziazione in vitro di staminali embrionali di topo (MES) Cellule con il metodo goccia

Le cellule staminali possiedono il notevole potenziale di differenziarsi in molti tipi cellulari diversi. Quando una cellula staminale si divide, ogni nuova cellula ha il potenziale di...

Le cellule staminali hanno la notevole capacità di differenziarsi in molti tipi cellulari diversi nell'organismo. Fungono da sistema di riparazione per il corpo. Teoricamente, possono dividersi senza limiti per rimpiazzare altre cellule.Quando una cellula staminale si divide, ogni nuova cellula ha la capacità di rimanere una cellula staminale oppure di diventare un altro tipo di cellula con una funzione più specializzata. Questo promettente settore della scienza sta portando i ricercatori a indagare la possibilità di terapie basate sulle cellule per trattare malattie in vitro. La differenziazione delle cellule staminali embrionali avviene quando le cellule sono lasciate aggregare in coltura in sospensione.In assenza di fibroblasti embrionali murini come cellule nutritizie e del fattore inibitore della leucemia, questi aggregati cellulari sono chiamati corpi embrionali. Il metodo della goccia sospesa è una procedura efficace per la differenziazione delle cellule staminali in corpi embrionali in vitro. Ciao, sono Sha Juan della divisione di Medicina Cardiovascolare di Stanford University.Oggi vi mostreremo un procedimento per la differenziazione individuale delle cellule staminali embrionali in corpi embrionici mediante il metodo delle gocce manuali. Utilizziamo tipicamente questo metodo per differenziare le cellule staminali embrionali in cardiomiociti. Questa procedura include i seguenti passaggi: preparazione di una sospensione monocellulare di cellule staminali embrionali, generazione di colture a gocce manuali, trasferimento delle colture a gocce manuali in piastre a basso attaccamento ultraleggero e semina dei corpi embrionici su piastre rivestite con gelatina.Ok, cominciamo. Il primo passo della procedura consiste nel preparare una sospensione monocellulare di cellule staminali embrionali. Poiché coltiviamo le nostre cellule staminali embrionali indifferenziate facendole crescere su fibroblasti embrionali di topo, dobbiamo staccare le cellule e separarle dai fibroblasti.Per fare ciò, si procede alla tripsinizzazione delle cellule utilizzando procedure standard. Una volta completato il trattamento con tripsina, aggiungere il mezzo per cellule staminali embrionali di topo per neutralizzare la tripsina. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml.Quindi frammentare le colonie cellulari aspirando e dispensando ripetutamente contro il fondo del tubo fino a ottenere una sospensione fine di cellule senza grumi visibili. Adesso centrifugare le cellule a mille giri al minuto per cinque minuti. Dopo la centrifugazione, aspirare il soprannatante e risospendere le cellule in 10 ml di mezzo per cellule staminali embrionali di topo.Trasferire la sospensione cellulare in una fiasca T 75 pre-ricoperta con gelatina 0,1% e incubare a 37 gradi con 5% CO2 per un'ora. Dopo un'ora, i fibroblasti si sono attaccati alla piastra, ma le cellule staminali rimangono nel mezzo. Aspirare il mezzo per raccogliere le cellule staminali.Centrifugare le cellule a mille giri al minuto per cinque minuti ed aspirare il mezzo. Quindi aggiungere altri 10 ml di mezzo di differenziamento e risospendere le cellule mediante pipettaggio ripetuto finché non si ottiene una sospensione fine di cellule. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.Ora siamo pronti per coltivare la sospensione cellulare utilizzando il metodo della goccia sospesa. Per iniziare la coltura in goccia sospesa, utilizzare il mezzo di differenziamento per diluire la sospensione di cellule staminali fino a una concentrazione di 500 cellule per 20 microlitri. Successivamente, capovolgere il coperchio di una piastra per colture cellulari da 150 millimetri.Quindi pipettare 20 microlitri della sospensione cellulare sulla superficie interna del coperchio della piastra. Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 10 ml di PBS sulla piastra. Capovolgere rapidamente il coperchio della piastra e posizionarlo delicatamente sulla piastra per formare le gocce sospese.Una volta posizionato il coperchio della piastra, trasferire con attenzione la piastra nell'incubatore. Lasciare le cellule indisturbate per due giorni. Al termine dell'incubazione, procederemo con il trasferimento della coltura a goccia sospesa in piastre a bassissima adesione.Dopo due giorni, capovolgere con attenzione il coperchio della piastra, quindi aspirare 180 microlitri di mezzo di differenziamento fresco e aggiungere alcune gocce in una piastra da 96 pozzetti a adesione ultra bassa. Successivamente, raccogliere le gocce con una pipetta e trasferirle una alla volta nella piastra da 96 pozzetti. Collocare le piastre nell'incubatrice senza disturbarle per tre giorni.I corpi embrionali continueranno a crescere assumendo una forma sferica. Al termine dell'incubazione, saremo pronti a piastrare i corpi embrionali, al fine di favorire la loro ulteriore differenziazione.Li trasferiamo in una piastra da 48 pozzetti rivestita con gelatina. Per fare ciò, rivestiamo innanzitutto ogni pozzetto della piastra con 300 microlitri di gelatina allo 0,1%. Dopo aver aggiunto la gelatina, incubare la piastra tutta la notte a 37 gradi Celsius.Il giorno successivo, aspirare la gelatina dalla piastra a 48 pozzetti. Quindi aggiungere 300 microlitri di mezzo di differenziamento a ciascun pozzetto. Ora, trasferire un corpo embrionale alla volta dalla piastra a 96 pozzetti alle piastre a 48 pozzetti rivestite con gelatina.Di solito cambiamo il mezzo il giorno successivo e poi ogni due giorni per mantenere le cellule. Utilizziamo questo metodo per individuare protocolli migliori per la differenziazione delle cellule staminali embrionali. Nei cardiomiociti, abbiamo appena mostrato come eseguire la differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali di topo mediante colture a goccia sospesa.Questo metodo è efficace perché il fondo arrotondato della goccia sospesa permette l'aggregazione delle cellule staminali embrionali, creando così un buon ambiente per la formazione dei corpi embrionali. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che il numero di cellule staminali embrionali aggregate in una goccia sospesa può essere controllato variando il numero di cellule nella sospensione cellulare iniziale. È tutto.Grazie per aver guardato. In bocca al lupo per il tuo esperimento.

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Shrinky-Dink Hanging Gocce: un modo semplice per forma e cultura corpi embrionali

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Modificato il mouse sulle cellule staminali Saggio base per quantificare l&#39;efficienza di induzione cardiogeno

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Differenziazione efficiente di cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori

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La differenziazione in vitro di staminali embrionali di topo (MES) Cellule con il metodo goccia

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