La differenziazione in vitro di staminali embrionali di topo (MES) Cellule con il metodo goccia

Le cellule staminali hanno il notevole potenziale di svilupparsi in molti tipi di cellule diverse nel corpo. Serve come una sorta di sistema di riparazione per il corpo. Possono teoricamente dividersi senza limiti per ricostituire altre cellule.

Quando una cellula staminale si divide, ogni nuova cellula ha il potenziale per rimanere una cellula staminale o diventare un altro tipo di cellula con una funzione più specializzata. Questo promettente settore della scienza sta portando gli scienziati a studiare la possibilità di terapie cellulari per il trattamento della malattia in vitro. La differenziazione delle cellule staminali embrionali si verifica quando le cellule possono aggregarsi in coltura in sospensione.

In assenza di embrioni di topo, alimentatori di fibroblasti e fattore inibitorio della leucemia, questi aggregati cellulari sono chiamati corpi embrionali. Il metodo della goccia sospesa è una procedura efficace per la differenziazione delle cellule staminali in corpi embrionali in vitro. Ciao, sono Sha Juan della divisione di Medicina Cardiovascolare dell'Università di Stanford.

Oggi vi mostreremo una procedura per la differenziazione individuale delle cellule staminali embrionali per sgrassare il corpo utilizzando il metodo della goccia a mano. In genere utilizziamo questo metodo per differenziare le cellule staminali embrionali in cardiomiociti. Questa procedura, che include i seguenti passaggi, la preparazione di una sospensione di cellule staminali embrionali a singola cellula, la generazione di colture a goccia a mano, il trasferimento di colture a goccia a mano su piastre di attacco ultra basse e la placcatura dei corpi embroidi su piastre rivestite di sporgenza.

Ok, iniziamo. Il primo passo della procedura consiste nel preparare una sospensione unicellulare di cellule staminali embrionali. Poiché coltiviamo le nostre cellule staminali embrionali indifferenziate facendole crescere su fibroblasti embrionali di topo, dobbiamo staccare le cellule e separarle dai fibroblasti.

Per fare ciò, proviamo a anizzare le cellule utilizzando procedure standard. Una volta completata la prova e il trattamento, aggiungere un terreno di coltura di cellule staminali embrionali di topo per neutralizzare la tripsina. Quindi, trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 mil.

Quindi rompere le colonie cellulari pipettando su e giù contro il fondo della provetta fino ad ottenere una sospensione fine di cellule senza grumi visibili. Ora fai girare le celle a mille giri al minuto per cinque minuti. Dopo la centrifuga, le cellule aspirano il supernat e riprospendono le cellule con 10 mil di cellule ES di topo. Medio.

Trasferire la sospensione cellulare in un pallone T 75 precodificato con gelatina allo 0,1% e incubare a 37 gradi con il 5% di CO2 per un'ora. Dopo un'ora, i fibroblasti si sono attaccati alla piastra, ma le cellule staminali rimangono nel terreno. Pipettare il terreno per raccogliere le cellule staminali.

Far girare le celle a mille giri al minuto per cinque minuti e aspirare il terreno. Quindi aggiungere altri 10 mil di terreno di differenziazione e risospendere le cellule mediante pipettaggio ripetitivo fino a quando non sembra esserci una sospensione fine di cellule. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.

Ora siamo pronti per coltivare la sospensione cellulare utilizzando il metodo della goccia sospesa. Per iniziare la coltura di gocce sospese, utilizzare la mediana di differenziazione per diluire la sospensione di cellule staminali a una concentrazione di 500 cellule per 20 microlitri. Quindi, capovolgere un coperchio della piastra di coltura tissutale da 150 millimetri.

Quindi pipettare 20 microlitri di sospensione cellulare sulla superficie interna del coperchio della piastra. Utilizzando un pipettatore multicanale, aggiungere 10 mil di PBS sulla piastra. Capovolgere rapidamente il coperchio della piastra e posizionarlo delicatamente sulla piastra per formare le gocce pendenti.

Una volta posizionato il coperchio della piastra, trasferirla con cura nella coltura dell'incubatrice. Le celle indisturbate per due giorni. Una volta completata l'incubazione, procederemo con il trasferimento della coltura di gocce sospese su piastre di attacco ultra basse.

Dopo due giorni, capovolgere con cura il coperchio della piastra e aspirare 180 microlitri di terreno di differenziazione fresco e mettere diverse gocce in una piastra di fissaggio ultra bassa da 96 pozzetti. Quindi raccogliere le gocce con una pipetta e trasferirle una ad una nella piastra a 96 pozzetti. Mettere le piastre nell'incubatrice indisturbate per tre giorni.

I corpi embrionali continueranno a crescere a forma di palla. Al termine dell'incubazione, saremo pronti a impiattare i corpi degli embrioni. Al fine di aiutare i corpi embrionali a continuare a differenziarsi.

Li trasferiamo in una piastra gelatinosa a 48 pozzetti. Per fare questo, rivestiamo prima ogni pozzetto della piastra con 300 microlitri di gelatina allo 0,1%. Dopo aver aggiunto la gelatina, incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius.

Il giorno successivo, aspirare la gelatina dalla piastra a 48 pozzetti. Quindi aggiungere 300 microlitri di terreno di differenziazione a ciascuno. Bene, ora uno per uno trasferisci i corpi embrionali dalle piastre rivestite di gelatina da 96 pozzetti a quelle da 48 pozzetti.

Di solito cambiamo il terreno il giorno successivo e poi a giorni alterni per mantenere le cellule. Utilizziamo questo metodo per cercare protocolli migliori per differenziare le cellule staminali embrionali. Per quanto riguarda i cardiomiociti, vi abbiamo appena mostrato come eseguire la differenziazione in vitro di cellule staminali embrionali di topo utilizzando colture a goccia sospese.

Questo metodo è efficace perché il fondo rotondo della goccia sospesa consente l'aggregazione delle cellule staminali embrionali, fornendo così un buon ambiente per la formazione dei corpi di Embry. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare che il numero di cellule staminali embrionali aggregate in una goccia pendente può essere controllato variando il numero di cellule nella sospensione cellulare iniziale. Questo è tutto.

Grazie per l'attenzione. Buona fortuna con il tuo esperimento.