Name: Rendendo Patch-pipette e Elettrodi Sharp con un estrattore programmabile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: Impara a preparare pipette patch-clamp ed elettrodi affilati per elettrofisiologia utilizzando un tiratore programmabile. Questo metodo garantisce strumenti di alta qualità per registrazioni cellulari.

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Ringraziamo le seguenti agenzie di finanziamento e le fondazioni per il supporto: National Institutes of Health, National Science Foundation, American Heart Association, Associazione distrofia muscolare, il B. e Donald E. Delia Baxter Foundation, il Fondo Klingenstein McKnight e il Endowment for Neuroscience.

Pipette tirando Utilizzando un microelettrodo estrattore come il P-97 Sutter Flaming / Brown, tirare un insieme di circa 10-20 pipette. <ol><li> Selezionare il capillare di vetro. Noi usiamo borosilicato capillari (Sutter BF150-110-10, 1,5 millimetri di diametro esterno, diametro interno 1,1 millimetri, 10cm di lunghezza). Conservare con cura il vetro in modo che rimane pulito e senza polvere. </li><li> Progettare un programma di trazione. Usiamo un programma STEP 5, con il calore discendente e velocità ad ogni passo, e un divano piccolo il passo finale. Ricettario pipetta Sutter è un riferimento eccellente per lo sviluppo di programmi adatti. </li><li> Esaminare i puntali al microscopio per determinare diametro di apertura e morbidezza. Eliminare ruvido, consigli irregolare, o irregolari. Un protocollo dovrebbe garantire una buona trazione questi sono rari. Per standard di patch-clamp registrazione, aperture punta dovrebbe essere del diametro di 1-3 micron. Un cono ripido (punta smussata) porta ad una minore resistenza per il diametro dell&#39;apertura stessa. Forma e dimensioni possono essere modificate con la lucidatura di pressione. </li></ol> Fuoco lucidatura pipette <ol><li> Impostare un impianto di lucidatura (microforge) con un filamento di platino riscaldamento controllato da un pedale. Un kit utile è disponibile da ALA scientifico (CPM-2) o di un apparecchio simile può essere assemblato pezzo per pezzo. </li><li> Opzionale: Cappotto la pipetta con un isolante per ridurre capacità e migliorare le caratteristiche del rumore. Noi usiamo per impronte dentarie. Sylgard 184 ™ (poli-dimetil silossani elastomero noto anche come PDMS) è anche un&#39;opzione. </li><li> Se si utilizza la cera, tenere una piccola scorta fuso nelle vicinanze. Con la pressione dell&#39;aria sul retro della pipetta per mantenere cera di entrare nella pipetta, immergere brevemente punta nella cera liquida e rimuovere. Con Sylgard, elastomeri negozio preparato in aliquote e congelati dipingere la punta della pipetta al microscopio. Di calore per curare l&#39;elastomero. </li><li> Posizionare la pipetta (patinata o meno) l&#39;apparato lucidatura e portare la punta ~ 50 micron dal filamento. Tieni presente che il filamento si espande quando riscaldato. </li><li> Consigliato: Seguire il protocollo separato per &quot;lucidare pressione&quot; per cambiare la forma della pipetta per la resistenza ottimale e diametro della punta. </li><li> Un impulso di calore breve (1-2 secondi) è sufficiente a rimuovere la cera dalla punta della pipetta e liscia del vetro. </li><li> Posizionare la pipetta finito in una scatola chiusa per proteggere dalla polvere, ripetere per 10 pipette di successo. </li></ol>

<ol><li>Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf">http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

Il protocollo è illustrato qui di uso quotidiano nei laboratori di elettrofisiologia ed è anche usato per fare aghi da iniezione di cellule e animali. Con un estrattore programmabile, è facile fare pipette per una varietà di usi. Con attenzione e cura, il filamento sul vostro estrattore durerà per un anno o più. Buona fortuna con i vostri esperimenti.

<table><tbody><tr><td>Trattore per micropipette</td><td>Strumento</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>O strumento simile (ad es. Sutter P-87 o P-2000)</td></tr><tr><td>Capillari di vetro</td><td>Reagente</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-86-10</td><td>In alternativa, vetro capillare simile. Per facilitare il riempimento della pipetta, utilizzare un capillare con un filamento di vetro interno.</td></tr></tbody></table>

rendendo patch-pipette e elettrodi sharp con un estrattore programmabile

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

Microelettrodi di vetro (chiamato anche pipette) sono state un cavallo di lavoro di elettrofisiologia per decenni. Oggi, pipette quali sono realizzati in vetro capillari con un estrattore programmabile. Tali strumenti di calore il capillare utilizzando un filamento di metallo o di un laser e tirare fuori il vetro con la gravità, un motore o entrambi. Pipette per il patch-clamp registrazione si formano con il calore e solo la gravità, mentre gli elettrodi taglienti per la registrazione intracellulare utilizzare una combinazione di calore, la gravità, e un motore. La procedura utilizzata per rendere pipette di registrazione intracellulare è simile a quello usato per fare aghi da iniezione per una varietà di applicazioni, tra cui l&#39;iniezione cRNA in ovociti di Xenopus. In generale, capillare di vetro &lt;1,2 mm di diametro è usato per fare pipette per la registrazione di patch clamp, mentre la stretta di vetro è utilizzato per la registrazione intracellulare (diametro esterno = 1,0 mm). Per ogni strumento, l&#39;estrattore è programmato in modo leggermente diverso. Questo video mostra come fare entrambi i tipi di pipette di registrazione con programmi prestabiliti estrattore.

Questo video mostra come utilizzare un estrattore programmabile per rendere pipette cerotto e gli elettrodi taglienti per elettrofisiologia. La stessa procedura può essere usato per fare una varietà di strumenti in vetro, tra cui aghi da iniezione.

Rendendo Patch-pipette e Elettrodi Sharp con un estrattore programmabile

Le microelettrodi di vetro (chiamati anche pipette) rappresentano da decenni uno strumento fondamentale per l'elettrofisiologia. Oggi, tali pipette sono realizzate a partire da capillari di vetro...

I pipetti capillari di vetro sono diventati onnipresenti nei laboratori per una vasta gamma di tecniche, come l'elettroporazione singola cellulare, la microiniezione di DNA e l'elettrofisiologia con tecnica del patch clamp. Per preparare gli elettrodi in vetro per il patch clamp per le registrazioni, il vetro silicatico viene tirato su un polarizzatore programmabile. Le punte degli elettrodi sono ricoperte di cera, quindi le punte vengono lucidate alla fiamma e conservate per un uso futuro. Ciao, sono Miriam Goodman del Dipartimento di Fisiologia Molecolare e Cellulare dell'Università di Stanford.In questo video, mostrerò come realizzare pipette per patch clamp ed elettrodi affilati per l'elettrofisiologia. I microelettrodi di vetro, chiamati anche pipette, sono da decenni uno strumento fondamentale nell'elettrofisiologia. Oggi, queste pipette vengono prodotte a partire da capillari di vetro mediante un tiraggio programmabile.Iniziamo. Per preparare le pipette per il patch clamp, utilizziamo capillari in vetro borosilicato Sutter privi di polvere e puliti, e impieghiamo il micropipettatore con filamento riscaldato Sutter P-97. Il Pipette Cookbook di Sutter è un'ottima risorsa di ri

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Questa è una guida per modificare la forma di micropipette di vetro. In particolare, utilizzando il calore e la pressione dell'aria la conicità è allargato senza aumentare l'apertura punta, con conseguente minore resistenza pipetta. Questo è fondamentale per ottenere registrazioni a basso rumore di piccole cellule, ma è utile in molte applicazioni.

Pressione lucidatura Pipette per una migliore patch-clamp di registrazione

Doppi strati lipidici planari, detti anche doppi strati lipidici artificiali, consentono di studiare ioni conduttore canali in un ambiente ben definito. In questo studio dimostriamo i singoli passi necessari per preparare la camera di doppio strato, gli elettrodi e come prova che il doppio strato è adatto per singolo canale misurazioni.

Preparazione di doppi strati artificiali per esperimenti Elettrofisiologia

Transfection strategia ottimizzata per espressione e registrazione elettrofisiologica di ricombinante tensione canali ionici in cellule HEK-293T

Qui si descrive un metodo rapido e semplice per misurare la rigidità delle cellule. Il principio generale di questo approccio è di misurare la deformazione della membrana in risposta a ben definito pressione negativa applicata mediante una micropipetta alla superficie cellulare. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare le proprietà biomeccaniche del substrato-attached cellule.

Aspirazione Micropipetta di celle substrato-attached per Stima rigidità cellulare

Ionoforesi di agonisti ed antagonisti neurali durante...

Produzione e utilizzo di Piggy-back Multibarrel Elettrodi per<em&gt; In vivo</em&gt; Manipolazioni farmacologiche di risposte neurali

Multi-elettrodo patch-clamp costituiscono un compito complesso. Qui vi mostriamo come, per l'automazione di molti dei passaggi sperimentali, è possibile accelerare il processo che porta al miglioramento qualitativo delle prestazioni e il numero di registrazioni.

Un multi-elettrodo patch-clamp Computer System-assistita

Canali meccanosensibili batteriche possono essere usati come trasduttori mechanoelectrical nei dispositivi biomolecolari. Bistrati interfaccia Droplet (DIB), cellula di ispirazione blocchi di costruzione di tali dispositivi, rappresentano nuove piattaforme per incorporare e stimolare canali meccanosensibili. Qui, dimostriamo un nuovo metodo basato micropipetta-di formare DIB, permettendo lo studio di canali meccanosensibili sotto stimolazione meccanica.

Multifunzionale, Metodo Micropipetta-based per la Costituzione e la stimolazione della batteriche meccanosensibili Ion Canali in Droplet Interface bilayers

Presentiamo metodi per la costruzione di elettrodi per registrare simultaneamente l'attività neurale extracellulare e rilasciare più sostanze neuroattive in prossimità dei siti di registrazione nei topi svegli. Questa tecnica consente l'analisi dettagliata di input sinaptici locali putativi al neurone di interesse.

Extracellulare La registrazione di un neurone attività combinata con Microiontophoretic applicazione di sostanze neuroattivi nei topi Awake

Questo protocollo descrive come effettuare esperimenti automatici con patch-cluster guidati dall'immagine utilizzando un sistema recentemente sviluppato per apparecchiature elettrofisiologiche standard in vitro .

Applicazione di morsetto di patch automatico guidato per immagini per lo studio dei neuroni in fettine di cervello

Descriviamo un protocollo per monitorare i cambiamenti nell'attività dei neuroni afferenti durante i comandi motori in un modello di sistema di cellule ciere vertebrate.

Attività dei neuroni afferenti della linea laterale posteriore durante il nuoto in Zebrafish

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo per misurare direttamente l'attività dei canali ionici sulle vescicole intracellulari utilizzando un sistema manuale di patch-clamp endolisosomiale. Illustriamo il metodo che prevede l'ingrandimento degli endolisosomi e l'isolamento manuale di queste vescicole. Questo approccio garantisce che i ricercatori possano replicare e applicare accuratamente la procedura.

Tecniche di patch-clamp per l'analisi di singole vescicole endolisosomiali

Impara a preparare pipette patch-clamp ed elettrodi affilati per elettrofisiologia utilizzando un tiratore programmabile. Questo metodo garantisce strumenti di alta qualità per registrazioni cellulari.

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