Rendendo Patch-pipette e Elettrodi Sharp con un estrattore programmabile

Le pipette capillari in vetro sono diventate onnipresenti nei laboratori per un'ampia varietà di tecniche, come l'elettroporazione a singola cellula, la microiniezione di DNA e l'elettrofisiologia del patch clamp Per preparare gli elettrodi patch clamp capillari in vetro per le registrazioni o il vetro silicato viene tirato su una polare programmabile. Le punte degli elettrodi vengono rivestite di cera, quindi le punte vengono lucidate a fuoco e conservate per un uso futuro. Ciao, sono Miriam Goodman del Dipartimento di Fisiologia Molecolare e Cellulare dell'Università di Stanford.

In questo video, dimostrerò come realizzare pipette patch clamp ed elettrodi affilati per l'elettrofisiologia. I micro elettrodi di vetro, chiamati anche pipette, sono stati per decenni un cavallo di battaglia dell'elettrofisiologia. Oggi, queste pipette sono ricavate da capillari di vetro utilizzando un tiro programmabile.

Quindi iniziamo. Per realizzare pipette a pinza per patch, utilizziamo la seta di cinghiale Sutter su capillari puliti e privi di polvere e utilizziamo il micro estrattore di elettrodi Sutter P nine seven flaming ground. Il ricettario per pipette di Sutter è un eccellente riferimento per lo sviluppo di programmi di estrazione adeguati.

Per iniziare, sollevare il coperchio antipolvere sull'estrattore. Quindi prendi un tubo capillare di vetro dalla scatola. Assicurati di riposizionare il coperchio per ridurre al minimo l'accumulo di polvere.

Quindi, con una mano, far scorrere il capillare nella scanalatura su un lato del filamento, stringere leggermente il morsetto. A questo punto, il morsetto dovrebbe essere abbastanza stretto da evitare che il tubo cada, ma abbastanza largo da poterlo far scorrere nella scanalatura. Ora, rilascia il fermo metallico della molla sullo stesso lato.

Quindi con il pollice e l'indice afferrare le linguette metalliche che sono attaccate alla parte inferiore di entrambi i supporti. Rilasciare l'altro fermo metallico della molla. Tirare i supporti fino in fondo e tenerli in posizione con una mano.

Quindi, fai scorrere il tubo attraverso l'alloggiamento del filamento nella scanalatura del supporto sull'altro lato. Evitare di spingere il vetro nel filamento riscaldante. Stringere i morsetti su entrambi i lati.

Dovrebbero essere abbastanza stretti da tenere i supporti in posizione, ma non così stretti da schiacciare il vetro. Ora chiudi il coperchio antipolvere e premi il pulsante verde. Le pipette ad asta contrassegnate per le registrazioni con patch clamp vengono formate utilizzando un programma di polling in cinque fasi con calore e velocità discendenti ad ogni passo e un piccolo palo nella fase finale.

Questo programma utilizza il calore e la gravità. La procedura per realizzare elettrodi affilati è molto simile, ma in questo caso utilizziamo il sottile capillare di vetro di Warner Instruments che ha un diametro esterno di un millimetro e un diametro interno di 0,78 millimetri. Applichiamo anche un programma di trazione che utilizza un motore oltre al calore e alla gravità quando i programmi di trazione sono terminati.

Sollevare il coperchio antipolvere, allentare entrambi i morsetti e rimuovere la pipetta finita. Quindi mettere le pipette in una scatola di lavoro. La scatola può essere realizzata incollando una striscia di schiuma al rack di una scatola di plastica per puntali per pipette, quindi tagliando da sei a otto fessure nella schiuma.

Inserire le pipette nelle fessure. Una volta che la scatola è piena di pipette estratte, procedere alla fase di lucidatura a fuoco per lucidare a fuoco le pipette. Installa un impianto di micro forgiatura con un filamento riscaldante in platino controllato da un pedale prima di iniziare la lucidatura a fuoco.

Per prima cosa rivestire la pipetta con cera dentale per ridurre la capacità e migliorare le caratteristiche di rumore. Per fare questo, tieni a portata di mano una piccola scorta di cera fusa. Applicare una pressione d'aria sul retro della pipetta per evitare che la cera penetri nel puntale.

Quindi immergere brevemente la punta nella cera liquida. E rimuovi ora. Posizionare la pipetta nell'apparecchio di lucidatura e portare la punta a circa 50 micron dal filamento.

Tieni presente che il filamento si espanderà quando riscaldato. Applicare un breve impulso di calore di uno o due secondi per rimuovere la cera dalla punta della pipetta e lisciare il vetro. Esaminare i puntali delle pipette al microscopio per determinare il diametro e la levigatezza dell'apertura.

Per le registrazioni standard con patch clamp, le aperture dei puntali devono avere un diametro compreso tra uno e tre micron, scartate, ruvide, irregolari o irregolari. Posizionare la pipetta finita in una scatola di lavoro, assicurandosi di chiudere il coperchio per proteggere le pipette dalla polvere ripetere l'operazione per 10 pipette di successo. Ti ho appena mostrato come realizzare pipette patch clamp ed elettro affilati utilizzando un estrattore programmabile.

La stessa procedura può essere utilizzata per realizzare una varietà di strumenti in vetro, inclusi gli aghi per iniezione per ottenere risultati ottimali di patch clamp. È importante ricordarsi di estrarre le nuove pipette prive di polvere lo stesso giorno dell'esperimento e di lucidarle entro un'ora dall'esperimento. Verificare inoltre mediante ispezione che le pipette siano lisce e lucidate.

Assicurati di guardare il nostro altro video, che mostra come eseguire la registrazione con patch clamp dei canali ionici espressi negli ovociti opus. Ok, questo è tutto. Ora sei un esperto di pipette e buona fortuna con i tuoi esperimenti.