4つの転写因子とマウス胚線維芽細胞を再プログラムすることによって誘導多能性幹細胞の生成、ドキシサイクリンは、レンチウイルス伝達系の誘導性

こんにちは、私の名前はブラッド・ハミルトンです。私はSTEM Genの研究開発部門に所属しています。本日は、マウス胚性線維芽細胞から人工多能性幹細胞を生成する手順をお見せします。

この手順は、人工多能性幹細胞の作製とリプログラミングプロセスの研究の両方に使用できます。それでは始めましょう。まず、マウス胚性線維芽細胞または覚せい剤細胞を、15センチメートルのゼラチンコーティング皿に、皿ごとに5番目の細胞の10倍の密度で播種します。

次に、30ミリリットルの覚せい剤増殖培地を加え、細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で2日間インキュベートし、約80%のコンフルエントになるまで培養します。終了したら、培地をインキュベートし、30ミリリットルの成長を加えます。濃縮レンチウイルスを補充した培地。

皿を優しく揺らして、培地が均等に分布するようにします。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートし、ウイルス形質導入を完了させます。次に、ドキシサイクリンによるリプログラミングに移りましょう。

形質導入後20〜24時間でリプログラミングを開始するには、トリプシンは形質導入された細胞であり、それらを200Gで5分間遠心分離します。次に、培地を細胞ペレットから慎重に吸引し、細胞を増殖培地に再懸濁します。シードを懸濁すると、形質導入したメスは、使用している細胞培養皿のサイズに適した濃度で形成されます。

ここでは、リプログラミング効率実験とIPSコロニー単離のために10センチメートルディッシュあたり2.5倍10〜5番目の細胞を使用し、免疫化学実験のために4ウェルプレートのウェルあたり10〜4番目の細胞の2倍を使用しています。形質導入効率をモニターするには、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。この段階では、必要に応じて細胞を液体窒素で凍結し、将来の分析を行うことができます。

翌日、培地を吸引し、ドキシサイクリンを最終濃度2ミリリットルあたり2マイクログラムまで補充した新鮮な成長培地と交換します。ドキシサイクリンを含まない培地を含む陰性対照が含まれています。最後に、細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%でインキュベートします。

私たちは再プログラミングプロセスを開始しました。原則として。多能性幹細胞コロニーは、16〜22日後に単離するのに十分な大きさになります。

その手順を示す前に、まず化学を使用して形質導入効率を検証し、形質導入効率を決定する必要があります。免疫化学試験は、ドキシサイクリン誘導の48時間後に4つのウェルプレートに再播種した細胞で実施されます。このプロトコルに記載されているすべての容量は、細胞を穏やかに洗浄することから始めて、細胞培養プレートのサイズに応じて調整する必要があります。

マグネシウムイオンまたはカルシウムイオンを含まないPBSを使用したら、PBS中の500マイクロリットルの4%パラフォームアルデヒドで細胞を15分間固定します。室温で、PBSで細胞を再度2回穏やかに洗浄します。次に、PBS中に氷冷0.2%Tween 20を500μL加えて細胞を透過し、室温で10分間インキュベートする。

細胞をさらに2回洗浄した後。200マイクロリットルのブロッキングバッファーを室温で1時間加え、非特異的抗体の結合をブロックします。次に、目的の一次抗体を200マイクロリットル追加します。

ここでは、多能性マーカーT 4K LF four、SOX two、およびcmicを使用しています。翌日、細胞を摂氏4度で一晩インキュベートします。PBSで細胞を2回穏やかに洗浄した後、200μLの二次抗体と室温で1時間インキュベートし、プレートを光から保護します。

ここでは、インキュベーション後に倒立蛍光顕微鏡を使用して、フルオロフォーと結合した適切な二次抗体を可視化に使用しています。細胞をさらに2回洗浄し、DPIを添加して再度10分間インキュベートし、核を可視化します。最後に、最後の洗浄後、antifa aqua mountを添加してから、倒立蛍光顕微鏡で細胞をイメージングし、形質導入効率を決定します。

多能性幹細胞の単離と増殖を開始する。リプログラミングプロセスを開始した後、毎日培養物をモニターし、48時間ごとに適切な培地を交換します。ドキシサイクリンを添加した培地を使用して、最初の12日間細胞を培養し、その後、ドキシサイクリンを培地から取り出します。

増殖のために手動で選択された人工多能性幹細胞またはIPSコロニーはドキシサイクリンです。独立した細胞は、リプログラミングプロセスを示す形態学的変化がないか毎日監視する必要があります。各実験は異なりますが、コロニーは通常、DS導入後16〜22日、コロニーの分離とトリプシンの再プログラムプロセスを開始する前日の間に分離するのに十分な大きさです。

1ウェルあたり4番目の細胞に10の5倍の密度でメッツのγ線照射フィーダー層を播種することにより、24ウェルプレートを調製する。細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。翌日、各IPSコロニーを手動で選択し、それをアニス化して細胞凝集体を解離させ、マウス胚性幹細胞培地中のIPS細胞を先行する24ウェルプレートの個々のウェルで置き換え、細胞を摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートします。

メディアは 24 時間ごとに交換します。IPSコロニーの増殖とGFP蛍光を毎日モニタリングします。培養物を6日間インキュベートした後、多能性分析のために4つのウェルプレートにパッケージングしました。

24ホイールプレートのどのウェルが均一にGFPを発現しているかを判定し、良好なGFP発現を有するウェルをトリップし、初期化し、ガンマ線照射フィーダー層が先行する4つのウェルプレートに1〜8を継代することができる。その後、これらのプレートを多能性のICC分析に使用して、多能性分析を開始できます。マグネシウムイオンやカルシウムイオンを含まないPBSで細胞を2回やさしく洗います。

PBSで20の氷冷0.2%のウェルあたり0.5ミリリットルを追加し、細胞を10分間インキュベートします。PBSブロックでさらに3回洗浄した後、室温で1時間、200マイクロリットルのブロッキングバッファーと非特異的結合します。次に、目的の一次抗体を200マイクロリットル追加します。

ここでは、SSEAを1ナノg、OCTを4°Cで一晩インキュベートしました。細胞を2回穏やかに洗浄した後、200μLの二次抗体と室温で1時間インキュベートし、光を避けます。ここでは、蛍光力で標識した適切な二次抗体を可視化に使用し、倒立蛍光顕微鏡を使用してさらに2回の洗浄後、DPIを添加し、細胞を10分間インキュベートします。

最終洗浄後、antifa aqua mountを添加してから、倒立蛍光顕微鏡で細胞をイメージングします。IPSコロニーは、市販のキットを使用してアルカリホスファターゼ活性を分析することもできます。ステムジェントドックス誘導性マウスTFレンチウイルスセットは、転写因子のMES発現の形質導入後にmesをIPS細胞に再プログラムするために使用できます。

T 4、SOX 2、KLF 4、およびseicは、ドキシサイクリンで処理した細胞で検出できますが、未処理の細胞では発現をほとんどまたはまったく検出できません。形態学的変化は時間とともに進行し、明確なコロニーエッジと3次元成長を伴う、より大きく、よりES細胞のようなコロニーを生成します。docが取り除かれると、一部のES細胞様コロニーの細胞形態の顕著な逆転が見られます。

しかし、多くのコロニーはIPSの形態を維持していました。これらのIPSコロニーは、選択して継代すると表示されます。アルカリホスファターゼ、ナノTフォー、およびSSEAワンの典型的な多能性マーカー発現。

この実験で使用された覚醒剤細胞の種類は、内因性ナグ遺伝子座からGFPを発現していました。したがって、多能性状態に再プログラムされると、GFP発現はリプログラミングを成功させるための予備的な指標として使用できます。4つの転写因子ドキシサイクリン誘導性抗ウイルスシステムを使用して、マウス胚性線維芽細胞のリプログラミングを誘導し、多能性幹細胞を誘導する方法を示しました。

この手順を実行するときは、リプログラミング実験を設計する際には、リプログラミングの効率を最適化するためにいくつかの変数を考慮する必要があることを覚えておくことが重要です。まず、一次感染ステップ中に活性ウイルスと標的細胞の比率を変更して形質導入効率を増減させることが可能であり、これにより標的細胞集団内の統合ウイルスの数に影響を与えることができる。次に、細胞がドキュメントに曝露される時間の長さを調整すると、生成されるIPSコロニーの数に影響を与える可能性があります。

第三に、標的細胞の増殖能力は、活発に成長し分裂している細胞がリプログラミングにより適しているため、リプログラミングに影響を与える可能性があります。最後に、異なる細胞数または異なるサイズの組織培養皿のプロトコルを変更する場合、標的細胞数は培養皿の表面積に比例して調整することが推奨される。というわけで、これだけです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。