T波イオンモビリティー質量分析：タンパク質複合体解析のための基本的な実験手順

次の実験の一般的な目標は、タンパク質複合体の全体的な形状を決定することです。これは、タンパク質複合体イオンの質量分析鉄移動度データを取得し、各電荷状態のドリフト時間値を測定することで達成されます。第2のステップとして、天然タンパク質構造の移動度測定を確実にするために、実験条件が検証されます。

次に、測定されたドリフト時間の値を断面積と相関させます。その結果、タンパク質または未知の三次元構造を持つタンパク質複合体の衝突断面積値が決定されます。この情報は、全体的な形状、サブユニットのパッキング、およびトポロジーに関する手がかりを提供します。

こんにちは、私はワイズマン科学研究所の生物化学部門マイク研究室のアイザック・レスキです、そして私は同じくmi研究所のナーム・キルシェンバウムです。本日は、ハイブリッド質量分析計と鉄移動度装置を用いた衝突断面積タンパク質複合体の測定手順をご紹介します。当研究室では、この手順を用いて、タンパク質複合体の全体的な形状と組織化を研究しています。

それでは始めましょう。この手順では、鉄の移動度、質量分析、またはタンパク質複合体のIMM MS分析に焦点を当てています。サンプル調製ステップ、装置のキャリブレーション、MSおよびタンデムMSの最適化手順は、関連するJOプロトコルで実証されています。

一般に、このプロトコルには、酢酸アンモニウムなどの揮発性緩衝液中の低マイクロモル濃度の複合体が含まれます。ナノフローあたり1〜2マイクロリットルが消費されることを考慮すると、キャピラリーはMS条件の最適化を可能にするために、最小容量として10〜20マイクロリットルを準備します。この手順を開始するには、進行波またはT波シナップIMMSを、イオンのIMと飛行分離の時間、陽イオン取得とVモードの両方に対してトライ波と圧力が自動的に設定される操作移動度tofの次のモードに設定し、フライトチューブと反射オンのイオンの経路を設定しますここですべてのガスをオンにします。

窒素はIM分離に使用され、アルゴンはトラップおよびトランスファー領域に使用されます。推奨される初期値は、IMS デバイスのガス流量が 24 ミリリットル/分、トラップ領域が 1.5 ミリリットル/分のガス流量です。次に、未知のタンパク質複合体のマスト電荷比取得範囲を設定します。

最初は広い質量範囲を使用し、その後、目的の値に減らすことができますが、それに応じてMSプロファイルを調整します。大規模な複合体の伝送効率を最大化するには、取得質量範囲を1030 2000 MAの電荷比から、MSプロファイルを自動に設定する必要があります。それ以外の場合は、示されているグラフに従ってプロファイルを設定できます。

RF設定を確認し、必要に応じて、図のように大きなタンパク質複合体に適した値に調整します。次に、サンプルをロードし、キャピラリー電圧と低ナノフロー圧力を印加します。スプレーが開始されたら、ナノフロー圧力を最小限に下げてみてください。

さらに、コーンに対するキャピラリーの位置を調整し、MS取得パラメータを調整して、十分に分離されたMSスペクトルを取得します。装置とサンプリングコーンに沿った圧力勾配、および関連するJoVEプロトコルに詳述されている抽出コーンバイアストラップとトランスファーの潜在的な設定を最適化します。これらのパラメータはサンプルによって異なりますが、ペプチドからタンパク質複合体までのさまざまな鉄塊のMSスペクトルを取得するために使用される条件を以下に示します。

大きなイオンは、より高い衝突エネルギーとバイアス電圧を必要とします。また、大きなタンパク質複合体の分析では背圧を上げて、複合体の活性化を最小限に抑えることをお勧めします。ピークの位置を変えずに、サンプルコーン抽出、コーントラップ、バイアス電圧を約10ボルトずつ段階的に下げてみてください。

最適なマススペクトルが得られたら、タンパク質集合体を分析する際にドリフト時間またはIMプロファイルを調整する必要があります。質量測定と移動度測定の両方に最適な条件は、多くの場合、互換性がありません。したがって、2つの間の適切なバランスをとることが重要です。

全体として、鉄の移動度プロットは、ピークがドリフト時間範囲全体に分布し、ピークプロファイルが滑らかになるように最適化する必要があります。ジアン分布に近づくと、ピークの非対称性が大きくなると、複数のコンフォメーションの分離が不十分になることがあります。T波の速度、T波の高さ、およびIMSガスの流量を調整して、移動度分離を最適化することができます。T波の速度を上げると、ドリフト時間分布プロファイルが広がります。

T波の高さの値が大きくなると、同様にIMSガスの流れが毎分10ミリリットルから始まり、ドリフト時間プロファイルがより高い値にシフトし、鉄の移動度スペクトルを最適化するために機能します。3 つの変数のうち 2 つを固定し、3 つ目の変数を最適化することで、T 波の速度を秒速 250 メートルに設定し、ガス流量を毎分 24 ミリリットルに設定します。次に、出発点として、高さを3ボルトに設定し、段階的に1ボルトずつ増やします。

高いバイアス電圧を使用する場合は、IMSガス圧を下げ、バイアス電圧の低下を可能にすることをお勧めします。その結果、複雑な活性化と解離が減少します。ロールオーバー効果は、条件が最適化されていない場合に現れることがあり、ドリフト時間スペクトルとテーリングエッジの最初の部分に同一のピークとして観察されます。

イオンがIAMデバイスを通過しない場合、イオンの移動は、次に鉄パケットがモビリティセルに放出されるのに必要な時間よりも長くかかる可能性があります。その結果、前のパケットがプッシャー領域に配信される前に、新しいイオンの束がトラップ領域から放出されます。このアーチファクトをなくすには、T-wave の高さを大きくし、T -wave の速度と IMS 圧力を下げます。

また、トラップのリリース時間を調整することもできます。さらに、伝達T波の高さが少なくとも5ボルトに設定されていることを確認することが重要です。また、IMSセルへのイオンの漏れを防ぐため。

モビリティトラップの高さは最大レベルに保つ必要があります。伝達T波の速度が遅く、振幅が大きいと、ドリフト時間分布プロファイルが波打つ可能性があります。このアーチファクトは、プシャ周波数と移動T波速度との間の部分的な同期により、イオンの移動度分離が移動領域とタフ領域を通じて維持されない場合に発生します。

この影響をなくすには、プッシャータイムまたはトランスファーT波速度のいずれかを調整する必要があります。pushaの周波数は質量範囲に関連しているため、このアーティファクトが再び現れる可能性があります。このパラメータが変更されたとき。

T波の高さはわずかな効果を発揮します。ただし、その減少は波紋を排除するのにも役立つ可能性があります。前述のパラメータが最適化されると、IMMSデータを取得して高分解能を達成できます。

さん。ピークタンパク質複合体は、多くの場合、質量分析計内で活性化され、残留水およびバッファー成分のストリッピングを促進します。しかし、活性化エネルギーが閾値を超えて増加すると、パーシャルアンフォールディングが発生し、複数の中間状態が形成される可能性があり、これはネイティブの溶液状態構造に対応する可能性は低いです。その結果、ドリフト時間のピークは、展開された構造の水素性集団を反映してシフトし、拡大する可能性があります。

溶液相構造と一致するドリフト時間データを得るためには、IM分離前にイオン加速に使用される電圧を慎重に制御することが不可欠であり、したがって、ドリフト時間スペクトルへの影響を監視しながら、キャピラリー電圧とコーン電圧を段階的に増加させる必要があります。また、MSの分解能を高くするためには、トラップ電圧よりもトランスファー電圧を上げることが好ましい。IMデバイスが最初に配置され、次に転送領域とTOFアナライザが配置されます。

IM測定後に活性化が行われるため、IMでは影響を受けませんが、MSの精度を上げて、複合体のネイティブ構造を維持する条件下でデータ取得を確実に行うことができますが、単一の最適化されたパラメータセットに固執するのではなく、さまざまな実験条件および溶液条件でデータを収集することが重要です。そのため、トラップ衝突電圧を段階的に増加させ、鉄の移動度プロファイルへの影響を監視しながら10ボルト間隔でデータを取得します。最後に、アンフォールドされた確認を同定し、取得したデータを手動で評価し、サンプルを酢酸で2〜7のpH範囲にわたって滴定することによりタンパク質複合体の解離を誘導し、データを記録するために、T波IMSシステムでのデータを分析し、ドリフト時間キャリブレーションアプローチによって定義される断面積、 既知の断面積値を持つCainタンパク質を使用します。

まず、変性口径のタンパク質溶液をそれぞれ10マイクロモルで調製します。ウマのシトクロムC馬、心臓ミオグロビン、ウシユビキチンを49、49 0.2体積比の水メタノール酢酸で使用します。次に、標的タンパク質またはタンパク質複合体に使用したのとまったく同じ装置条件下で、キャリバータンパク質のIMMSデータを取得し、IM分離設定を維持するためにすべての電圧と圧力値を同一に保ちます。

データを取得した後、各電荷の実験ドリフト時間値を抽出します。Cainタンパク質の状態は、次の式を使用して、キャリバードリフト×TプライムDのそれぞれを修正します(MOVZは観測されたイオンのマスター電荷比、Cは強化されたデューティサイクルEDC遅延係数です)。その値は通常 1.4 から 1.6 の間は、機器によって異なります。

EDC値は、システム内の1つの取得設定、1つの取得設定タブに表示され、鉄の装填状態と減少質量の両方について各口径の断面積を修正します。ここで、オメガCは補正された断面、オメガは文献の断面、Zは鉄の電荷です。状態Mはカインイオンの分子量、MGは鉄の分子量です。

バックグラウンドガスは、典型的には、オメガCのセランに対してTプライムDの窒素プロップセランである。パラメータXとAは、プロットを線形関係に適合させることで抽出できます。傾き X は指数比例係数に対応し、A は適合決定定数を表します。

近似相関係数 R の 2 乗を計算します。R二乗の許容値は0.95より大きいです。相関係数値が低いのは、タンパク質の不完全なアンフォールディング、サンプルの老化が原因である可能性があります。

異なる口径のタンパク質に使用される実験条件の異なさ、ノイズの多いスペクトル、データの不完全な処理、または計算エラー。決定された指数係数 X を使用して ca ドリフト時間を修正し、オメガ C と T 素数 D. 再度 Define の相関係数をリロトして計算を検証します。0.95よりも高い値は、前に説明した手順と同様に予想され、ターゲットタンパク質またはタンパク質複合体の測定ドリフト時間を修正し、計算された指数係数Xを使用してターゲットタンパク質またはタンパク質複合体のドリフト時間を較正します。各実験条件について、これらの手順を繰り返します。

未知のタンパク質またはタンパク質複合体の断面積を定義するときは、各実験を少なくとも3回繰り返し、衝突断面積の値が決定されたら、これらの三重測定の標準偏差を決定することをお勧めします。モデリングアプローチは、複合体のトポロジカルまたは配置を予測するために採用されます。これは、全体として生成されたモデル構造から計算されたsilico Omega値内に実験的な衝突断面積値を適合させることによって行われますが、この分野はまだ初期段階にあり、このアプローチを汎用的で広範囲の複合体に適用できるようにするには、さらなる開発が必要です。

ここでは、ウシヘモグロビンの四量体型の表面表現を示します。酸素トランスポーターヘモグロビン複合体は、上記のアプローチの一例として役立つことができます。ヘモグロビンは、2つのアルファサブユニットと2つのベータサブユニット(それぞれ青色と赤色)で構成される四量体タンパク質複合体であり、アルファベータ二量体の二量体を形成します。

ヘモグロビンのIMMSスペクトルをここに示します。この錯体のIM msスペクトルを取り込んだことから、インタクトな錯体およびマイナー電荷シリーズに対応するメジャー電荷系列の分布が明らかになり、これはアルファベータダイマーおよびアルファおよびベータモノマーサブユニットの質量に適合します。ここでは、さまざまな形態のヘモグロビンの理論的および測定されたCCSを示します。

ジメリックおよびテトラメリック形態のいくつかの電荷状態について取得されたドリフト時間値を使用して、オメガ値を計算しました。これらは理論値と比較されました。四量体複合体には、環状二面体または鎖状のパッキングの3つの関連付けの可能性があると仮定します。

二量体から四量体に移動する際のオメガの増加を計算することで、構造組織化を予測できます。これまでの研究や私たち自身の実験では、測定されたccssと結晶構造データから得られたタンパク質表面積との間に強い相関関係があることが示されました。この相関関係は、さまざまな保圧形態の二量体と比較した四量体の表面積の予想増加を計算するために使用できます。

これは、各サブユニットの非球面オブジェクトを考慮することによって行われます。鎖のようなアセンブリは四量体CCSを約2倍に増加させますが、C、4、またはDの2つの充塡剤は、それぞれ約1.5と1.67の増加をもたらします。ヘモグロビンの四量体とDME型の測定されたCCS値との間の計算された比率は、1.57±0.03でした。

この数値は、ネイティブ構造が線形に組織化されておらず、環状四量体または二面体四量体としてよりコンパクトな形で配置されていることを示しています。ヘモグロビンの分解結晶構造について同じ計算を繰り返すと、四量体とDME形態の表面積の比は1.63であり、D2対称性に適合します。明らかに、この幾何学的モデルは単純化されており、タンパク質サブユニットは単に球形ではありません。

しかし、この計算は、IMMSが未知の高分解能構造を持つ複合体の充填を明らかにするためのエキサイティングな可能性を示しています。タンパク質のドリフト時間を測定する方法と、タンパク質複合体が衝突断面積の値を計算する方法を示しました。この手順を実行するときは、標的タンパク質またはタンパク質複合体に使用したのとまったく同じ条件を使用して、キャリバータンパク質のIMMSデータを取得することが重要です。

さらに、これらの実験を少なくとも3回繰り返し、これらの三重測定の標準偏差を決定することを強くお勧めします。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。