バイオミメティックビーズを使用した細菌と宿主細胞の相互作用の評価

哺乳類上皮細胞培養物を含むマルチウェルプレートを取ります。

テストウェルに、細菌の表面タンパク質に結合したポリマービーズとともに細菌病原体を追加します。

コントロールウェルに、細菌表面タンパク質を欠く病原体とビーズを追加します。インキュベート。

テストウェルでは、ビーズは細菌表面を模倣し、上皮細胞膜ホスファチジン酸への結合をめぐって病原体と競合し、細菌の付着を減少させます。

コントロールウェルでは、ビーズは細菌の付着に影響を与えません。

培地を取り出し、バッファーで洗浄して、結合していない成分を除去します。

非イオン性界面活性剤とインキュベートして細胞を溶解し、膜に付着した細菌やビーズを放出します。

ライセートをピペットで移動して均一な懸濁液を作成し、バッファーを使用してホモジネートを連続的に希釈します。

希釈液を寒天プレートに移し、コロニー形成を可能にするためにインキュベートし、コロニーを数えます。

テストプレートは対照よりもコロニーが少なく、細菌と宿主の相互作用が減少していることを示しています。

細菌培養物を無色のDMEMに希釈して、添加剤を含まない感染培地を調製します。

10%の体積対体積ビーズ懸濁液を含む摂氏37度に予熱。MOIを10にするには、ウェルあたり1ミリリットル、サンプルあたり10〜20%の過剰体積を準備します。ウェルから古い培地を取り出し、摂氏37度に予熱した滅菌PBSを各ウェルに1ミリリットル加えて、培養したHeLa細胞を洗浄します。PBSを取り出し、ウェルあたり1ミリリットルの感染培地を加えます。ポジティブコントロールとしてコントロールビーズとバクテリアを含む溶液を、ネガティブコントロールとして接着ビーズとバクテリアを含まない溶液を追加します。

溶解コントロールとして0.1%Triton X 100を含むDMEMを加えます。

プレートを摂氏37度の組織培養インキュベーターで所望の時間インキュベートします。

細菌の接着の測定は、感染の1時間後に行われます。細胞層から培地を取り出し、滅菌予熱PBSで細胞層を完全に洗浄して、未付着の細胞を除去します。毎回1ミリリットルのPBSで少なくとも3〜4回洗浄してください。PBS中の無菌1%体積対体積Triton X 100溶液を各ウェルに1ミリリットル添加することにより、宿主細胞を溶解します。プレートを摂氏37度で5分間インキュベートします。

各サンプルを数回上下にピペットで移動させてから、各ウェルの内容物を別々の1.5ミリリットルチューブに移します。サンプルを滅菌PBSに10倍に連続希釈して調製します。各サンプル100マイクロリットルを海洋LB寒天培地にプレートし、セルスプレッダーを使用して散布します。細菌株と時点に応じて、プレートする希釈液を最適化します。

この実験セットアップでは、10倍から5倍または10倍から6倍の希釈により、適切な数のCFUが得られます。プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、コロニーカウントで細菌を列挙します。