ベータグルコシダーゼアッセイを使用した細菌の突然変異頻度の評価

遺伝子組み換え細菌の培養を取ります。

細菌は、校正活性に欠陥のあるDNAポリメラーゼの変異変異体を発現するように誘導され、複製エラーの可能性が高まります。

これらのエラーは、調節領域に自発的な突然変異を引き起こし、ベータグルコシダーゼ遺伝子を抑制し、ベータグルコシダーゼ酵素の発現を引き起こす可能性があります。

一定の時間間隔でサンプルを収集し、各培養における細菌の生成数を評価します。サンプルを遠心分離し、上清を廃棄します。

ペレットをバッファーに再懸濁します。

透過性溶液を加え、混合して細菌膜を透過性化します。

透過処理された細菌サンプルをマルチウェルプレートに移します。

細菌に入り、ベータグルコシダーゼ酵素と反応して着色された生成物を生成する基質を追加します。

色の濃さを測定して、ベータグルコシダーゼ活性を測定します。

細菌培養中のベータグルコシダーゼ活性を分析して、世代にわたる突然変異の頻度を決定します。

pBAD-εおよびpGOOD1-εD12A11ベクターを含む 大腸菌 TOP10の単一コロニーを、抗生物質で処理した1ミリリットルのLB培地に移します。

培養物を摂氏37度で一晩インキュベートします。翌朝、10ミリリットルの新鮮な培地を含む3つのフラスコで前培養1〜250を希釈します。誘導剤にアラビノース、IPTGまたはアラビノースとIPTGをそれぞれ1ミリモルずつ加え、誘導培養物を摂氏37度で8時間インキュベートします。

非誘導培養物を並行して調製します。1ミリリットルのアリコートを集め、10ミリリットルの新鮮な培地を含む新しいフラスコで1〜500に希釈し、誘導剤を補充または補充しませんでした。次に、混合物を摂氏37度で一晩インキュベートします。

翌日、前培養の希釈から始まる手順を繰り返し、1ミリリットルのアリコートを収集します。次に、アリコートを冷凍庫に入れます。

次に、各文化圏で発生した世代数を決定します。100マイクロリットルの適切な連続希釈液の接種物と培養物をLBプレートに移します。

プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。翌朝、LBプレートのコロニーを数えます。

接種物またはlog Iおよび増殖終了時の培養物またはlog Cに存在する細胞数の対数を計算し、世代数を決定します。

次に、培養物を5,000gsで20分間遠心分離し、細胞を1ミリリットルの50ミリモルトリスHCL、pH 7.6、50ミリモルNaClに再懸濁します。

細胞を透過性化するには、クロロホルムを2〜3滴加え、20秒間ボルテックスします。

最後に、96ウェルマイクロプレート中の各アリコートのグルコシダーゼ活性を測定します。

ウェル内に気泡が発生しないようにしながら、100マイクロリットルの透過処理細胞と100マイクロリットルのp-ニトロフェニル-D-グルコピラノシド基質を使用します。

マイクロプレートリーダーとフィルターを使用して、420ナノメートルの吸光度を読み取ります。