ToxRアッセイによって決定される膜貫通ドメインのオリゴマー化の傾向

次の実験の全体的な目標は、天然の膜環境におけるタンパク質、膜貫通ドメイン、またはT MDの靭帯化傾向を調査することです。これは、大腸菌の目的の膜貫通ドメインをキメラタンパク質として発現させ、マルトース結合タンパク質をペリプラズムおよび毒素に局在させることによって達成されます。転写レポーターとしてのRは、膜貫通ドメイン誘導靭帯化により、tox Rの二量体化およびLXi転写の活性化をもたらす第2のステップとして、細胞をONPGで溶解および処理し、ONPGで処理し、これはベータガラクトによって光吸収種OニトロホレートまたはONPに加水分解されます。

次に、ONPレベルは、405ナノメートルの光の吸収率を測定することにより定量化されます。膜貫通ドメインのレベルを決定するために、結紮術の結果は、tox Rレポーターアッセイに基づいて膜貫通ドメインの結紮傾向を明らかにします。この手法の主な利点は、SDSページや蛍光などの既存の生物物理学的方法よりも優れている点は、膜貫通ドメインの挙動が、洗剤などの膜模倣システムではなく、大腸菌での発現によって天然のリン脂質二重層で研究されることです。

この方法は、膜貫通ヘリックス会合に関与する主要な構造的特徴の解明など、膜タンパク質分野の重要な質問に答えるのに役立ちます このプロトコルの開始前に、必要なキメラタンパク質を発現する7つのプラスミドは、商業的に合成されたオリゴヌクレオチドから調製され、NHE 1とBMH1に隣接する目的のTDSを表します。プラスミドを調製した後の制限部位は、氷上でfhk 12コンピテントセルを穏やかに解凍します。解凍後、細胞を各血漿DNAの200ナノグラムの15ミリリットルの培養チューブに別々のチューブに移し、細胞を氷上で30分間インキュベートします。

次に、細胞を摂氏42度で90秒間熱ショックし、続いて800マイクロリットルのSOC培地で氷上で2分間インキュベートし、インキュベーション後1時間振とうしながら摂氏37度でサンプルをインキュベートし、クロラムフェニコールを含むLB培地5ミリリットルと50マイクロリットルの形質転換混合物を15ミリリットルの培養チューブを使用して各サンプルに接種します。最後に、サンプルを摂氏37度で20時間振とうしながらインキュベートします。TDSベータガラクトターゼ活性のすべての靭帯化を測定するために決定されます。

まず、プレートリーダーを摂氏28度に予熱します。Zバッファーストックを使用して、書かれたプロトコルに記載されているように、新しいZバッファー溶液を調製します。Zバッファークロロホルムをチューブからリザーバーに移し、Zバッファークロロホルムの上部水層のみを配管するようにしてください。

96ウェルプレートを紙の上に置き、グリッドを引いて正確にピペッティングし、100マイクロリットルのZバッファークロロホルムを96ウェルプレートの各ウェルに移し、続いて各培養物5マイクロリットルをクワッドに移します。重複して、ブランクとして機能する4つのウェルから培養を省略します。プレートの外径5 95を測定して、セル密度を決定します。

プレートのすべてのウェルに50マイクロリットルのZバッファーSDSを添加します。次に、プレートリーダーでプレートを10分間振とうし、ONPGの50マイクロリットルのZPAで細胞溶解した後、すべてのウェルに細胞をlyします。プレートをプレートリーダーに戻し、OD 4 0 5を30秒ごとに20分間測定します。

ブランクに正規化するミラー単位の計算を通じて、ベータラクトサーゼ活性のレベルを決定します。ウェスタンブロッティングは、コンストラクト間の同等のタンパク質発現を確認するために行われます。まず、50マイクロリットルの三重培養物を組み合わせ、次にマイクロ遠心分離機を使用してサンプルを遠心分離します。

ピペッティングとリサスで上清を取り除きます。残留ペレットを2 x サンプルローディングバッファーに懸濁し、各サンプルの7.5マイクロリットルを標準的な8%ゲルにロードし、移送後1時間5分間、125ボルトで電気泳動を行います。抗M-V-P-H-R-P標識抗体とメンブレンをインキュベートすると、約70キロダルトンのキメラタンパク質が観察され、48キロトン前後の分解生成物が見られることもあります。

内因性MVPも45キロダルトンで観察されます。キメラTMDコンストラクトの適切な膜挿入を評価するために、マルトース結合タンパク質欠損PD 28細胞株は、マルトースを唯一の炭素源とする最小培地で増殖する場合に使用され、マルトース結合タンパク質を周囲形質に正しく位置する膜内密性発現産物を発現する細胞のみが増殖できます。fhk 12細胞について説明したようにPD 28細胞を形質転換し、2ミリリットルのLB培地を接種します。

インキュベーション後、細胞を摂氏37度で増殖させ、300 RPMで一晩振とうします。遠心分離により細胞をペレット化し、2ミリリットルのPBSでResus懸濁液で洗浄し、大きな先端で穏やかにピペッティングします。ペレット化後、細胞を再びPBSで再度洗浄し、その後、1ミリリットルのPBS中で最終遠心分離および懸濁液を蘇生する。

再懸濁した細胞の25マイクロリットルを使用して、5ミリリットルの最小限の培地を接種します。摂氏37度の細胞を15時間で振とうしながらインキュベートします。各サンプルの200マイクロリットルを96ウェルプレートに移し、プレートリーダーを使用してOD 5 9 5の読み取り値を取得します。

このプロセスを 2 時間ごとに 25 時間ごとに繰り返します。tox R転写レポーターアッセイを用いて、複数の膜にまたがる膜内性タンパク質潜伏膜タンパク質1から個々の膜貫通ドメインの全靭帯化傾向を解析した。膜貫通ドメイン5は、高ミラーユニットで示されるように、リガ上昇の強い傾向を示し、これはポジティブコントロールGPAAの確立された二量体化配列に匹敵します。

膜貫通ドメイン5D150Aの有害な突然変異は、配列の能力をすべてのリガ上昇LMP1に低下させ、TM1は有意にすべてのリガ上昇をせず、非形質転換FHK12細胞であるブランクのシグナルのすぐ上で非常に低いミラー単位シグナルを示す。このビデオを見た後、目的の膜貫通ヘリックスが天然の膜環境で高次複合体を形成する能力を持っているかどうかを判断する方法をよく理解しているはずです この手順を試みる際には、大きなエラーを回避し、気泡が発生しないように、96ウェルプレートに非常に慎重にピペットで挿入することが重要です。