Name: の活動の定量化シス調節エレメント (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: 学ぶマウス網膜エクスプラント電気穿孔法によるシス調節エレメントの活性定量化。蛍光レポーター発現レベルを定量的に解析し、網膜細胞における遺伝子発現制御メカニズムを解明する信頼性の高い手法を習得できます。

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著者らは、エレクトロポレーションチャンバーのセクションを記述建設で彼女の助けのためにカレンローレンスに感謝します。

<ol><li>Carroll, S. B., Grenier, J. K., Weatherbee, S. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarroll%2C+SB+%22From+DNA+to+diversity+%3A+molecular+genetics+and+the+evolution+of+animal+design%22">From DNA to diversity : molecular genetics and the evolution of animal design</a>. , 2nd edn, Blackwell Pub. (2005).</li>
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<li>Corbo, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRX+ChIP-seq+reveals+the+cis-regulatory+architecture+of+mouse+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRX ChIP-seq reveals the cis-regulatory architecture of mouse photoreceptors.</a> Genome Res. 20, 1512-1525 (2010).</li>
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</ol>

利害の衝突は宣言されません。

外植片のエレクトロポレーションは、開発途上のマウス網膜でのシス調節活性を定量化する簡単な手段です。マウスの遺伝子導入を介してシス調節の解析と比較して、エレクトロポレーションは、新生仔マウス、DNA、解剖器具、およびエレクトロポレーション/組織培養装置を必要とする、はるかに安いです。また、消費するはるかに短い時間です：一つの実験では、唯一の準備時間の数時間、約8日間の培養期間、およびイメージングとデータ解析のための実験の終わりに数時間を必要とします。外植片のエレクトロポレーションは、また細胞培養ベースの実際の網膜組織が ​​利用されているので、 シス調節の解析に優れています。網膜は、外植片ではかなり正常に発達文化 - それは、光受容体は、外側のセグメントを詳しく説明するために失敗するものの、3つの異なる細胞の層を（外顆粒層、内顆粒層、および神経節細胞層）を形成する。 さらなる利点は、外植片のエレクトロポレーションは非常に再現性があります。一般的にであっても別の日に、別の網膜中にエレクトロ同じ構造、同じ相対的な発現レベルの結果。さらに、エレクトロポレーションプラスミドを核内でエピソームに保持されると考えられていると染色体に組み込まれていないので、彼らは、トランスジェニックマウスで行われたシス調節の解析をイライラさせる、同じ組込み部位の影響を受けるように表示されません。 外植片のエレクトロポレーションは、いくつかの制限があります。最初に、細胞周期に残っている細胞のみが効率的にエレクトロ15で形質導入することができます。 P0で、ロッドと他の後の生まれの網膜細胞の種類は（双極細胞、アマクリン細胞、M llerのグリア細胞）この方法の対象となる主要な細胞集団です。 P0エレクトロポレーションにより、錐体光受容体のエレクトロポレーションは、16を報告したが、効率は低いように見えるされています。 2つ目の制限は、網膜の進行性の奇形で2週間の結果を超えてその移植片培養であるため、推奨されません。プロモーターの定量化が遅いタイムポイントで必要な場合はセクション9で説明したように、しかし、in vivoでのエレクトロポレーション9、目的のタイムポイントで網膜切開続いて、実行解剖網膜のフラットマウント、および定量化されることがあります。 3番目の制限は、このアッセイが適度にハイスループットであることです。細胞培養ベースの単一の実験での構造の何百ものテストができるアッセイとは異なり、このプロトコールに記載された技術は、構造ごとに全体のマウス網膜の最小値を必要とします。従って、唯一の数十個の構造は合理的に一日に電気穿孔することができます。 現在のアプローチを使用して、プロモーター活性の定量化に関するつの追加の注意点は非常に強力なプロモーターを測定する際、特に、GFPのチャンネルにDsRedの蛍光​​の&quot;ブリードスルー&quot;の可能性があるということです。その理由は、GFPのDsRedの一部が重なるのその発光スペクトルである。この問題を回避するために、最適化された発光フィルターは、DsRedのとGFPとの間のスペクトルの重なりを最小限にすることを使用する必要があります。このような最適化されたフィルタセットが利用できないときは、別の潜在的な解決策は、GFPの代わりにブルーシフトした蛍光タンパク質（ 例えば 、BFPやCFP）を使用することです。

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント（省略可能） </th></tr><tr><td>エレクトロポレーション料理、Microslide 453 </td><td> BTXハーバード装置</td><td> 45から0105 </td><td>修正のためにプロトコルのセクション1を参照してください</td></tr><tr><td> 100％のシリコーンゴム水族館のセメント</td><td>パーフェクトマニュファクチャリング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラスチック製のマイクロチューブのラック</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 05から541 </td><td>のみラックハンドルが使用されます。 </td></tr><tr><td>ドレメルツール</td><td></td><td></td><td>プラスチックチューブのラックからハンドルを切断するための</td></tr><tr><td> DMEM </td><td> GIBCO / Invitrogen社</td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> GIBCO / Invitrogen社</td><td> 11765 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glu/pen/strep </td><td> GIBCO / Invitrogen社</td><td> 10378-016 </td><td> 100X濃度</td></tr><tr><td>インスリン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> I - 6634 </td><td> 1000X株式の場合は、5mMの塩酸で5mg/mlに再懸濁し、ろ過滅菌</td></tr><tr><td> FBS </td><td> GIBCO / Invitrogen社</td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830方形波エレクトロ</td><td> BTXハーバード装置</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nucleporeフィルター</td><td>ワットマン紙</td><td> 110606 </td><td> 25ミリメートル、0.2μmの</td></tr><tr><td>組織培養インキュベーター</td><td></td><td></td><td> 37℃、5％CO 2 </td></tr><tr><td>ガラス製カバースリップ＃1.5 </td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td> 12 - 544E </td><td>厚さ0.16ミリメートル</td></tr><tr><td>カメラを装備した蛍光化合物の顕微鏡</td><td></td><td></td><td>カメラは単色（浜松などし、ORCA - ERカメラ）でなければなりません</td></tr><tr><td> EGFP /複合顕微鏡のためのDsRedのフィルタセット</td><td>クロマテクノロジー株式会社</td><td> 86007 </td><td>赤と緑のchanenelsの間でこのフィルタセットを最小限に抑えるbleedthrough </td></tr><tr><td> ImageJのソフトウェア</td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr></tbody></table>

の活動の定量化シス</em植片エレクトロポレーションによってマウス網膜で>調節エレメント

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

短い細胞遺伝子ネットワーク内の転写因子のシス調節エレメント（CRES）に結合することにより、その標的遺伝子の発現の時空間パターンとレベルを制御する、（〜300〜600 bp）は下流、または内で、上流に位置することができるゲノムDNAの伸び彼らが制御する遺伝子のイントロン。クレス（ すなわち 、エンハンサー/プロモーターは）一般的に1から3の転写活性化因子およびリプレッサーの両方のクラスタ化された複数の結合部位で構成されています。彼らは、時空間に、正確で定量的に正確なプロモーター活性の形で単一出力を与える転写入力の論理的な積分器として機能する。これまでのシス調節哺乳類のほとんどの研究は4-5 CRESのエンハンサー機能をアッセイするための手段として、マウスの遺伝子導入に頼ってきた。この手法は、時間のかかるコストと、挿入部位の効果のアカウントで、大半は非定量的である。一方、哺乳類のCREの機能の定量的アッセイは、組織培養系（ 例えば 、デュアルルシフェラーゼアッセイ）で開発されているが、これらの結果の生体適合性でしばしば不明である。 エレクトロポレーションは、哺乳類の生体組織におけるシス調節活性の時空間と定量的に評価の両方を可能にするという点で従来のマウスの遺伝子導入に優れた代替手段を提供しています。この手法は、特に大脳皮質や網膜6-8に、中枢神経系におけるシス調節の解析に特に役立っています。 in vivoおよびex vivoの両方でマウス網膜エレクトロは、開発し、広範囲に松田とCepko 6-7,9で説明してきたが、我々は最近、エレクトロポレーション、マウスの網膜10に光受容体特異的なCRESの活性を定量化するシンプルなアプローチを開発しました。エレクトロポレーションによって網膜に導入されるDNA量は実験から実験に変えることができることを考えると、それは全ての実験において共同エレクトロポレーション&quot;ローディングコントロール&quot;を含める必要があります。この点で、手法は、培養細胞でのプロモーター活性を定量化するために使用するデュアルルシフェラーゼアッセイに非常によく似ています。 光受容体のシス調節活性を測定するときに、エレクトロポレーションは、通常、ピークロッドの製作11月12日の時間である新生マウス（生後0日、P0）で実行されます。一度網膜細胞の種類は、有糸分裂後になって、エレクトロポレーションは、あまり効率的です。新生児マウスのロッドの出生率の高さとロッドは成体マウスの網膜では細胞の70％以上を占めているという事実を考えると、P0でエレクトロポレーションされている細胞の大部分はロッドです。このような理由から、桿体は、エレクトロポレーションを経由して勉強する最も簡単な網膜細胞のタイプです。我々はここで説明するテクニックは、感光体のCRESの活性を定量化するために主に有用です。

このプロトコルは、外植片のエレクトロポレーションを使用してマウスの網膜を生体内でのシス調節エレメント（例えば、エンハンサー/プロモーター）の活性を定量化するための簡単​​で安価な方法を説明します。 DNA調製、網膜切開、エレクトロポレーション、網膜移植片培養、お​​よびポスト固定分析と定量化が説明されています。

細胞内の遺伝子ネットワークにおける転写因子は、標的遺伝子の...に結合することにより、その発現レベルおよび時空間的な発現パターンを制御しています。

本手順の目的は、蛍光転写レポーターを用いてマウス網膜インプラントをエレクトロポレーションし、その発現量を定量化することです。まず、解剖によって新生マウスの網膜組織を単離します。次に、蛍光DNAレポーター構築物を網膜にエレクトロポレーションします。手順の第3段階は、エレクトロポレーション後の網膜をインプラントとして8日間培養することです。手順の最終段階は、網膜外植片を回収し、蛍光レポーターの発現レベルを定量することです。最終的に、ex vivo外植片エレクトロポレーションとそれに続く定量データ解析を通じて、発達中のマウス網膜における異なるプロモーターレポーター構築物の相対的な発現レベルを示す結果を得ることができます。私はジョー・コルボです。セントルイスにあるワシントン大学医学部の病理・免疫学部門の教員を務めています。本日は、光受容体特異的なCYS調節エレメントの活性を定量化することを目的とした、新生マウス網膜へのex vivo電極導入法のビデオプロトコルを提示します。このプロトコルの実演を行うのは、私の研究室の大学院生であるシンディ・モンタナです。まず、眼球を採取する準備として、電極導入チャンバーとすべての器具を70% ethanolで滅菌します。エタノールで手袋と作業台の両方を消毒し、手順全体を通して無菌状態を維持します。次に、組織培養用クリーンベンチ内で、1枚の滅菌済み60 mmペトリ皿に6 mLの解剖用培地を、2枚の滅菌済み35 mm皿にそれぞれ3 mLの培地をピペットで分注します。作業台に戻り、新生マウスの頭部と頸部を70%エタノールで消毒します。ハサミを用いて迅速に脱頭した後、頭部を滅菌済みの100mmディッシュに移し、解剖顕微鏡下で小型ハサミを用いて頭皮を切り除き、眼球を露出させます。湾曲鑷子を用いて、眼窩から眼球を優しくすくい出し、解剖用培地を入れた35mmディッシュに配置します。電気穿孔法に用いるDNA 1アリコートあたり3〜4個の眼球が集まるまでこの操作を繰り返し、完了するまで眼球と解剖用培地を室温で保持します。カミソリの刃と滅菌プラスチック転送ピペットの包み紙を70%ethanolで消毒し、カミソリを使って、眼球全体をピペットで吸い込める十分な高さでピペットの先端を切り落とします。広げたピペットを使用し、実体顕微鏡の高倍率下で、35 millimeterディッシュから60 millimeterディッシュへ眼球を1つ転送します。微細ピンセットを用いて、眼球表面から外眼筋や脂肪などの組織を除去します。次に、視神経の根元をつまんで切り離し、除去します。網膜を分離するために、角膜縁の強膜に小さな穴を開けます。強膜と網膜色素上皮は、マットグレーである網膜組織に比べて光沢があるように見えます。2組のピンセットの爪を1本ずつ穴に挿入し、強膜とRPEをゆっくりと引き裂いて開けます。レンズはそのままにしておいてください。幅を広げたピペットを使用して、切り出した網膜を培地が入った2つ目の35 mmディッシュに移動させます。すべての網膜を回収し、37 °Cの組織培養インキュベーターで保存します。エレクトロポレーションを行う前に、組織培養用フード内で、エレクトロポレーションに使用するDNAの各分注量に対して、1枚の滅菌済み35 mmディッシュに解剖用培地を、もう1枚のディッシュに培養液を満たします。P 200ピペットを用いて、エレクトロポレーション用ディッシュのチャンバーを滅菌済み1 XPB Sで3回洗浄します。チャンバーに60 µLのDNA分注量を注入し、未使用のチャンバーには60 µLの1 XPBSを満たします。電極をエレクトロポレーション皿に接続し、電撃装置に適切な設定を入力します。精密ピンセットでレンズ部分を持って網膜を掴み、エレクトロポレーションチャンバーに転送します。各チャンバーに最大4枚の網膜を配置してください。レンズ部分が陽極に接続された金属棒に寄りかかるようにして、網膜を配置します。あるチャンバーから次のチャンバーへDNAが混入するのを防ぐため、チャンバーごとにピンセットを拭き取ってください。すべての網膜が整列したら、電極装置のスタートボタンを押します。陰極に接続された金属棒に小さな気泡が生じるはずです。ピンセットを用いて電極を外し、電気泳動装置の電源を切ります。網膜をチャンバーの壁面から慎重に離します。網膜をチャンバーから、解剖用培地を入れた35mmディッシュに移します。滅菌済みの転送ピペットを使用し、網膜を解剖用培地から、培養液を入れた35mmディッシュに移します。滅菌済みの6ウェル培養プレートの各ウェルにラベルを貼り、各ウェルに3 mLの培養液を満たします。滅菌済みピンセットを用いて、円形のWatmanニュークレオフィルターを各ウェルの培地の上に浮かべます。この際、フィルターの光沢面を上にしてください。解剖顕微鏡を用いて、滅菌済み転送ピペットで網膜を1つずつ、レンズ側を下にしてフィルター上に移します。もし網膜がレンズ側を上にして置かれた場合は、再度ピペットで吸い上げ、やり直してください。各ウェルに4個まで網膜を配置し、それぞれ別々の液滴に保持します。網膜をウェルに配置後、培養プレートを37 °Cの組織培養インキュベーターに移し、必要な時間培養します。通常、ここでは8日間の培養で、DNA構築物が網膜表面の1/4から1/3にわたって発現するという良好なエレクトロポレーション結果が得られます。蛍光レベルは、CRE構築物を発現している均一にエレクトロポレーションされた領域を、網膜外の領域と比較し、その後コントロールのGFP発現で標準化することで定量されます。特に桿体光受容細胞が効率的に導入されていることが示されています。ここでは、2つの桿体特異的プロモーターが外核層においてGFPおよびDS redの発現を誘導した際のエレクトロポレーションの結果を示します。ここで青色で示されているDPI染色による2つの発現パターンを重ね合わせることで、光受容体特異的な発現が明確になります。内顆粒層および神経節細胞層のいずれにおいても、発現は認められません。このビデオを視聴することで、網膜シス regulatory elements の活性を定量化することを目的とした、マウス網膜外植えの電気生理学的解剖および培養方法について十分に理解できたはずです。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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