の活動の定量化シス調節エレメント

この手順の全体的な目標は、蛍光転写レポーターを使用してマウス網膜インプラントをエレクトロピュレートし、その発現レベルを定量化することです。これは、まず解剖によって新生児マウス網膜組織を単離することによって達成されます。手順の2番目のステップは、蛍光DNAレポーターコンストラクトで網膜をエレクトロすることです。

手順の3番目のステップは、エレクトロポレーションされた網膜をインプラントとして8日間培養することです。手順の最後のステップは、網膜explanを採取し、蛍光レポーターの発現レベルを定量化することです。最終的には、x explanエレクトロポレーションとそれに続く定量的データ解析により、発生中のマウス網膜における異なるプロモーターレポーターコンストラクトの相対的な発現レベルを示す結果を得ることができます。

私の名前はジョー・コルボで、セントルイスのワシントン大学医学部の病理学および免疫学の教員です。そして今日は、光受容体特異的なCYS調節要素の活性を定量化する目的で、新生児マウスの網膜にXエクスプランエレクトロポレーションの技術を示すビデオプロトコルを発表し、このプロトコルを実証するのは私の研究室の大学院生、シンディ・モンタナです。まず、エレクトロポレーションチャンバーとすべての器具を70%エタノールで滅菌し、眼球採取の準備をします。

手袋とベンチトップの両方をエタノールで消毒し、手順全体を通して無菌状態を維持します。次に、組織培養フードで、6ミリリットルの解剖培地を1つの滅菌60ミリメートルペトリ皿にピペットで、3ミリリットルの培地を2つの滅菌35ミリメートル皿にピペットで移します。ベンチトップに戻り、生まれたばかりのマウスの子犬の頭と首を70%エタノールで消毒します。

ハサミで素早く頭部の首を切った後、頭部を滅菌済みの100mm皿に移し、小さなハサミで頭皮を切り取り、解剖顕微鏡で目を露出させます。湾曲した鉗子を使用して、眼窩から眼球をそっとすくい取り、解剖を含む35ミリメートルの皿に眼を置きます。中程度。エレクトロポレーションするDNAのアリコートごとに3〜4個の目があるように目を収集し続け、終了するまで目と解剖媒体を室温に保ちます。

かみそりの刃と滅菌プラスチックトランスファーピペットのラッパーの両方を70%エタノールで消毒し、かみそりの刃を使用してピペットの先端を十分に高く切り取り、目全体をピペットでピペットできるようにします。幅を広げたピペットを使用して、片方の目を35mmディッシュから60mmディッシュに高出力で解剖顕微鏡で移します。細い鉗子を使用して、眼球外筋や脂肪などの組織を目の表面から取り除きます。

次に、視神経を基部でつまんで取り除きます。網膜を分離するために、輪部の強膜に小さな穴をあけると、強膜と網膜色素上皮は、マットグレイである網膜組織に対して光沢があります。両方の鉗子のペアから1つのプロングを穴に挿入し、強膜とRPEをそっと引き裂いて開きます。

レンズは必ずそのままにしてください。幅を広げたピペットを使用して、解剖した網膜を培地が入った2番目の35ミリメートル皿に移動します。すべての網膜を採取し、摂氏37度の組織培養インキュベーターに保管します。

エレクトロポレーションする各DNA Eloquaの組織培養フードでエレクトロポレーションを行うまで、1つの滅菌35mmディッシュに解剖培地を充填し、2番目のディッシュに培養液を充填します。P 200ピペットを使用して、エレクトロポレーションディッシュ内のチャンバーを滅菌済みのXPB S3で洗い流します。チャンバーに60マイクロリットルのDNAアリコートを充填し、未使用のチャンバーには60マイクロリットルのXPBSを充填します。

電極をエレクトロポレーションディッシュに接続し、エレクトロに適切な設定を入力します。細い鉗子を使用してレンズで網膜をつかみ、それらをエレクトロポレーションチャンバーに移します。各チャンバーに最大4つの網膜を配置します。

レンズが正極に取り付けられた金属バーに寄りかかるように網膜を配置します。各チャンバー間の鉗子を拭き取り、1つのチャンバーから次のチャンバーへのDNAのキャリーオーバーを防ぎます。すべての網膜が整列したら、エレクトロのスタートを押します。

負極に取り付けられた金属棒に小さな気泡が形成されるはずです。電極を取り外し、鉗子を使用して電気をオフにします。網膜をチャンバーの壁からそっと離します。

チャンバーから網膜を解剖培地を含む35ミリメートル皿に移します。滅菌トランスファーピペットを使用して、解剖培地から培地が入った35mm皿に網膜を移します。滅菌済みの6ウェル培養プレートのウェルにラベルを付け、各ウェルに3ミリリットルの培養物を充填します。中程度。

滅菌鉗子を使用して、フィルターの光沢のある面を上に向けて、各ウェルの培地の上にワトマン核フィルターを丸く浮かべます。解剖スコープを使用して、滅菌転写ピペットのレンズ面を下にして、単一の網膜をフィルターに移します。網膜がレンズ側を上にして着地した場合は、ピペットに引き戻し、再試行してください。

各ウェルに4つ以下の網膜を配置し、別々の液滴に保持します。網膜をウェルに配置したら、培養プレートを摂氏37度の組織培養インキュベーターに移し、希望の時間成長させます。通常8日間見られる ここで見られるエレクトロポレーションは、網膜表面の4分の1から3分の1にわたってDNA構築物の発現をもたらす成功した。

蛍光レベルは、CREコンストラクトを発現する均一にエレクトロポレーションされた領域を網膜の外側の領域と比較し、その後、GFP発現を制御するために正規化することにより定量化されます。特に桿体光受容体は効率的に形質導入されることが示されています。これは、2つのロッド特異的プロモーターが外側の核層でGFPとDS redの発現を駆動するエレクトロポレーションの結果です。

この2つの発現パターンを青色のDPI染色で重ね合わせると、光受容体特異的な発現が明らかになります。インタークリア層および神経節細胞層のいずれにおいても発現は観察されない。このビデオを見た後、網膜嚢胞調節要素の活性を定量化する目的で、マウス網膜外植片の電気および培養をどのように解剖するかについてよく理解できるはずです。

ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。