脳溶解物中の標的タンパク質レベルの定量のための電気化学発光アッセイ

電気化学発光、ECL、イムノアッセイを使用してマウス脳溶解物中の特定のタンパク質を定量的に検出するには、マルチウェルアッセイプレートから始めます。

井戸は導電性作業電極と対電極で構成され、電気回路を完成させます。誘電体層が電極を分離し、アッセイ感度を向上させます。

標的タンパク質に対する一次マウスモノクローナル抗体をウェルに追加します。結合能力の高い作動電極は、抗体がそれらに固定化することを容易にします。

タンパク質含有溶液とインキュベートし、ウェルの残りの結合面に結合し、バックグラウンド干渉を減らします。

マウス脳核画分溶解物を加える。ライセート中の標的タンパク質はモノクローナル抗体に特異的に結合します。

標識ポリクローナル抗体を添加し、電極上の一次モノクローナル抗体に結合しているタンパク質上のエピトープを認識して結合します。ルテニウム複合体で標識された特異的二次抗体を添加し、非標識抗体に結合します。界面活性剤を含む適切なバッファー(適切なECL生成環境を提供する)とトリプロピルアミン(TPA)を追加します。

マルチウェルプレートをECL検出システムに入れます。電極全体に電位を印加すると、抗体に結合したルテニウム錯体が酸化されます。同時に、TPAは酸化され、自然に陽子を失います。

得られたTPAラジカルは、酸化したルテニウム錯体を励起状態に還元します。基底状態に緩和すると、ルテニウム錯体は光検出器によって検出された光子を放出します。

測定された光強度は、ライセートの特定のタンパク質濃度を表します。

冷蔵庫から96ウェルプレートを取り出し、ホイルを取り除きます。抗体コーティング溶液を廃棄物容器にフリックしてウェルから取り除きます。次に、プレートをペーパータオルで軽くたたいて、残っている溶液を取り除きます。

次に、各ウェルに125マイクロリットルのブロッキング溶液を追加します。次に、プレートを粘着ホイルで再度密封します。プレートを800RPMに設定したオービタルマイクロプレートシェーカーに置き、室温で90分間インキュベートします。

氷、MeCP2またはTAT-MeCP2タンパク質ストック溶液、マウス脳溶解物、およびHDF溶解物の1バイアルで解凍します。原稿の表2に記載されているように、タンパク質原液をきれいなチューブで希釈します。

次に、ライセートサンプルを希釈します。マウス脳溶解物には、溶解バッファー25マイクロリットルあたり1〜20マイクログラムを使用します。HDFライセートの場合、25マイクロリットルの溶解バッファーあたり0.25〜1マイクログラムを追加します。

96ウェルプレートを90分間インキュベートした後、ブロッキング溶液を廃棄物容器にフリックしてウェルから取り除きます。次に、プレートをペーパータオルで軽くたたいて、残っている溶液を取り除きます。次に、洗浄液を加えてすぐに取り除き、150マイクロリットルの洗浄液でプレートを3回洗浄します。

25マイクロリットルの標準試料とサンプルを96ウェルプレートのウェルに加えます。プレートを密封し、室温でさらに4時間インキュベートし、800 RPMを一定に振とうします。

標識検出抗体であるポリクローナルウサギ抗MeCP2を氷上で解凍します。アッセイ希釈液を使用して、抗体を1:6000の比率で希釈します。96ウェルプレートがシェーカーでのインキュベートが終了したら、プレートを廃棄物容器にフリックして標準試料とサンプルを取り出します。次に、プレートをペーパータオルで軽くたたいて、残っている溶液を取り除きます。

液を加えて、150マイクロリットルの洗浄液でプレートを3回洗浄し、すぐに取り除きます。マルチチャンネルピペッターを使用して、25マイクロリットルの非標識検出抗体溶液を各ウェルに加えます。プレートを密封し、室温で800 RPMで一定振とうしながら1時間インキュベートします。

冷蔵庫から特異的二次抗体を入手し、氷の上に置きます。二次抗体をアッセイ希釈液で希釈し、穏やかに混合します。

遊離の標識なし検出抗体を96ウェルプレートから取り除くには、それを廃棄物容器にフリックしてから、ペーパータオルでプレートを軽くたたきます。前述のように、プレートを3回洗浄した後、マルチチャンネルピペッターで各ウェルに25マイクロリットルの二次抗体を追加します。プレートを密封し、室温で800 RPMで一定振とうしながら1時間インキュベートします。

遊離二次抗体を廃棄物容器にフリックして除去し、ペーパータオルでプレートを軽くたたき、前述のようにプレートを3回洗浄します。

プレートの各ウェルに、光生成用の共反応物としてトリプロピルアミンを含む界面活性剤を含む150マイクロリットルの1Xトリスベースの金リードバッファーを加えます。

気泡の発生を避けるために、リバースピペッティング技術を使用してください。96ウェルプレートを、電気化学発光検出システムを備えたマイクロプレートプラットフォーム上に置きます。

のCCDカメラを使用して、すぐにデータのキャプチャを開始します。相対的な光単位に対応し、光の強度に正比例する信号数を記録します。