ELISAを用いたベイトタンパク質とプレイタンパク質の相互作用解析法

2つのタンパク質パートナー間の物理的相互作用は、下流の生物学的メカニズムを調節します。

酵素結合免疫吸着アッセイであるELISAを使用してタンパク質間相互作用を検出するには、マルチウェル免疫測定プレートを使用します。相互作用するタンパク質の1つであるベイトタンパク質を含むコーティングバッファーを加え、インキュベートします。餌タンパク質は、非特異的な疎水性相互作用を介してウェル表面に吸着されます。

使用済み溶液を廃棄し、プレートを緩衝液で洗浄して、結合していないタンパク質を除去します。ブロッキング溶液を加えてインキュベートし、溶液のブロッキング剤分子がウェル表面の非特異的結合部位をブロックできるようにします。

相互作用するタンパク質パートナーである獲物タンパク質を、ヒスチジン残基でタグ付けして定量しやすくします。インキュベートし、獲物タンパク質が相互作用パートナーである餌に特異的に結合できるようにします。獲物に結合する西洋わさびペルオキシダーゼ酵素と結合した抗ヒスチジン抗体の溶液を加え、餌-獲物-抗体複合体を形成します。

酵素の基質と過酸化水素を含む溶液をピペットで移し、インキュベートします。

西洋わさびペルオキシダーゼ酵素は、その基質の接触酸化に過酸化水素を使用し、青色の生成物を形成します。酵素を変性させる酸性溶液を加えて反応を止め、黄色の反応生成物を形成します。

マイクロプレートリーダーを使用して、結合した獲物タンパク質の量に比例し、タンパク質間相互作用の成功を示す製品の色の強度を測定します。

ELISAの準備をするには、100マイクロリットルのタンパク質溶液をPolysorpマイクロタイタープレートの各ウェルに分注します。蓋でプレートを閉じ、摂氏4度で一晩保存して、マイクロタイタープレートウェルへのタンパク質の固定化を促進します。マイクロタイタープレートから溶液をシンクの上で逆さまに傾けて捨てます。次に、ウェルあたり300マイクロリットルのPBSでウェルを3回洗浄します。

2.5重量体積パーセントのBSAを含むPBSで、コーティングされたウェルを室温で1時間ブロックします。ブロッキング溶液を除去した後、ウェルあたり300マイクロリットルのPBSTでウェルを3回洗浄します。次に、100マイクロリットルの50ナノモル組換えHisタグ付きPHを各サンプルに加えます。コントロールウェルには、100マイクロリットルのPBS-BSAのみを追加します。プレートを室温で1時間インキュベートします。

インキュベーション後、タンパク質溶液を廃棄し、ウェルあたり300マイクロリットルのPBSTでウェルを3回洗浄して、結合していないタンパク質を除去します。次に、西洋わさびペルオキシダーゼ結合抗Hiスポリクローナル抗体を含む100マイクロリットルのPBS-BSAを追加します。

室温で1時間インキュベートした後、ウェルあたり300マイクロリットルのPBSTでウェルを3回洗浄します。各ウェルに100マイクロリットルのELISA検出試薬を加えて、抗原抗体複合体を検出します。次に、ウェルあたり50マイクロリットルの1モル硫酸を加えて反応を停止します。マイクロプレートリーダーを使用して、450ナノメートルのウェルの光学密度を測定します。