原子間力顕微鏡を用いて組換えDNAとタンパク質の複合体の可視化

この手順の全体的な目標は、原子間力顕微鏡を使用して、水性バッファー内のDNAやタンパク質などの生体分子をリアルタイムでイメージングすることです。これは、最初にイメージングする生体分子を準備することによって達成されます。次に、原子間力顕微鏡をセットし、FMカンチレバープローブを位置決めします。

次に、サンプル表面と目的の生体分子をイメージングし、分析します。最終的には、原子間力顕微鏡法により、緩衝条件でのDNAとタンパク質、および不均一な生体分子複合体の一般的なサイズ、量、および組織を示す結果を得ることができます。この方法は、シャペロンとcosシャペロンのSTO形状がクライアントにとって複雑であるなど、分子シャペロン分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。

この方法のタンパク質視覚的デモンストレーションは、A FMおよびKentレバープローブの準備ステップが、主にそれらの物理的操作に関連する複雑さのために印刷された指示から学ぶのが難しい場合があるため、有益です。手順を実演するのは、私の研究室の2人の学生であるモーガン・シャノンとジョン・ガーツです イメージングするタンパク質またはDNA分子を分離し、それらを水性緩衝液に懸濁します。サンプルの純度を確認した後、氷上のFM吸収バッファーでインキュベートし、サンプルのマイカへの付着を促進します。

タンパク質サンプルには、10ミリモルのヒープバッファーを使用してください。また、10ミリモルトリス、pH7.5 10ミリモル塩化ナトリウム、2ミリモル塩化マグネシウムからなるDNAマグネシウム含有緩衝液については、A FMプローブの搭載に適している。液セルプローブホルダーを対応するカンチレバー設置ドッキングステーションに置きます。

イメージングに使用する鋭利な窒化物レバープローブの長くて厚いカンチレバーを見つけます。慎重に液セルプローブホルダーに移し、先端が直立したままであることを確認します。次に、光学顕微鏡でカンチレバーを検査し、カンチレバーが無傷で、液体セルプローブホルダーに適切に装着されていることを確認します。

次に、ニューラルヘッドクランプネジを締めて、FMヘッドを機器ダブテールアセンブリから慎重に取り外します。FMヘッドを反転させ、液体セルプローブホルダーをFMヘッドの基部にある4本のピンにしっかりと押し込みます。最後に、FMヘッドをテールアセンブリの機器に慎重に戻します。

サンプルをイメージングする前にFMをさらに準備するには、オンボード光学顕微鏡のノブを動かしてカンチレバーチップの位置を特定し、ソフトウェア上の光学コントローラーの上下矢印を調整してカンチレバーチップに焦点を合わせます。レーザー調整ノブを使用して、レーザーをカンチレバーの先端に合わせます。これは、プロトコルの中で最も技術的に困難なステップの1つであり、ポジショニングは手動で行われ、正確なノブ調整が必要です。

反射スポットと照明スポットのレーザーを注意深く監視すると、アライメントが成功する可能性が高くなります。次に、FMヘッドの光検出器ノブを調整して、光検出器を中央に配置します。金属製のFM試料ディスクに取り付けた新たに劈開したMICAのシートを、A FMホルダープレートの上の磁化されたサンプルホルダーに置きます。

FMホルダープレートを回転させて、試料ディスクが初期イメージング用に配置されるようにします。装置ソフトウェアのフォーカスサーフェスコントロールを使用して、FMヘッドをMICA試料ディスクの表面に向かって下に移動します。MICA表面の明確な特徴または先端の反射に焦点が合うまで、機器ソフトウェアからチューニングアイコンを選択し、カンチレバーを調整します。

推奨されるMSNLまたはSNLプローブの共振周波数は20〜60キロヘルツです。MICAサンプルをイメージングするための5%ピークオフセットを選択します。まず、プローブをMICA表面にかみ合わせ、初期スキャンサイズを10マイクロメートルに、スキャンレートを1ヘルツに設定します。

10マイクロメートルフィールドの完全なスキャン画像をキャプチャします。次に、スキャンサイズを5マイクロメートルと0.5マイクロメートルに縮小し、各フィールドの完全な画像をキャプチャします。装置ソフトウェアの解除アイコンを一度クリックして、プローブを解除します。

目的の生体分子を画像化するには、調製したサンプルの5マイクロリットルと45マイクロリットルの新鮮な吸収緩衝液を混合します。0.5マイクログラム/ミリリットルの生体分子含有溶液のうち50マイクロリットルをMICUの表面に直接慎重に追加します。5分間一時停止して、サンプル中の生体分子がマイカ表面に付着

次に、さらに50〜100マイクロリットルの吸収緩衝液を液セルプローブホルダーにピペットで移します。プローブ、FMヘッド、またはMICAにピペットチップが触れないように注意しながら、必要に応じてフォトディテクターを再調整し、レーザーをカンチレバーに再調整します。次に、装置ソフトウェアを使用してプローブを再度取り付けます。

スキャンサイズを大きくして、関心領域を特定します。イメージングが完了したら、装置ソフトウェアの引き出しアイコンを数回選択して、プローブを解除します。最後に、蒸留水を使用して、液セルプローブホルダーと試料ディスクを十分にすすぎます。

次に、圧縮空気で試してみてください。A FMイメージの例を次に示します。マイカ基質は、DNAとタンパク質が吸収できる分子的に平らな表面を提供します。

生体分子サンプルの前にMICAをイメージングすると、ネガティブコントロールとイメージングノイズの評価が可能になります。また、カンチレバーが適切に調整され、その後のサンプルイメージングが成功するという保証レベルも提供します。二本鎖血漿DNAは、スーパーコイル状と推定され、その非対称な外観と、以前は目立たなかったマイカ基質への均一な沈着によって容易に識別されます。

また、離散的な粒子サイズのタンパク質複合体も、Micah基質と一意に区別できます。粒子径の違いはサンプルの不均一性を示しており、タンパク質、複雑なストイックな形状、または生化学的活性の近似に役立ちます。観察されたタンパク質粒子の一般的な対角線形状と一貫した配向。

これは、タンパク質がランダムにMicah基質上に配向すると予想されるため、イメージングアーティファクトです。観察されたアーチファクト、物理的な先端の異常、または先端の畳み込みが絶対的な長さ測定を防止する一方で、スキャンレートの2つの速い速度でのFMイメージングの考えられる原因、x軸とY軸の高さ測定またはZ軸と相対的なXとYの測定は、それでも、画像化された生体分子の生物物理学的特性を推定するのに役立つ可能性があります。この手順を試行する間、カンチレバーを正確に調整し、この基本的なFM手順に従ってフォトディテクターを位置合わせすることを覚えておくことが重要です。

緩衝液交換流体細胞の使用を含む他のステップは、分子シャペロンがDNA応答要素からのステロイド受容体の放出に影響を与える能力などの追加の質問に答えるために追加することができます。このビデオを見れば、緩衝条件で原子間力顕微鏡を使用してDNAタンパク質や生体分子複合体をイメージングする方法について理解を深めることができるはずです。