分泌胚性アルカリホスファターゼレポーターアッセイを用いた生理活性型I型インターフェロンの定量(英語)

試験サンプル中のインターフェロン-アルファやインターフェロン-ベータなどの生理活性I型インターフェロンを定量するには、操作されたレポーター細胞を含むマルチウェルプレートを採取します。これらの細胞は、インターフェロンアルファおよびベータ誘導性プロモーターの制御下で、分泌された胚性アルカリホスファターゼ、SEAP、レポーター遺伝子を発現します。

のI型インターフェロン濃度を含む試験サンプルを追加します。さまざまなヒトタイプIインターフェロン濃度を他のウェルにピペットで移動し、標準対照として機能します。インキュベート。

試験井戸のI型インターフェロンは、特定の細胞表面受容体に結合し、ヤヌスキナーゼを活性化します。これらのプロテインキナーゼは、転写のシグナル伝達物質および活性化因子であるSTAT、タンパク質をリン酸化し、二量体化して特定のインターフェロン調節因子と複合体を形成します。

核に入ると、複合体はインターフェロン-アルファおよびベータ誘導性プロモーターの特定のDNA配列に結合し、SEAP遺伝子転写を活性化し、培地に分泌されるSEAP酵素を生成します。

SEAP含有培地をSEAP特異的基質を有するマルチウェルプレートウェルに移します。SEAP はピンク色の基質を加水分解し、紫青色の生成物を生成します。

マイクロプレートリーダーを使用して、テストウェルと標準ウェル内の製品の吸光度を測定し、SEAPレベルとタイプIインターフェロン濃度を示します。

プロットされた標準I型インターフェロン曲線から、試験サンプル中の生理活性I型インターフェロン濃度を決定します。

HEK-Blueインターフェロン-アルファ/ベータレポーター細胞を使用して生理活性I型インターフェロンを測定するには、まず、レポーター細胞を96ウェルの平底プレートにウェルあたり50,000細胞の密度でプレートし、最終容量180マイクロリットルにします。次に、採取したばかりの共培養上清20マイクロリットルを各ウェルに2回ずつ加えます。一連の内部標準コントロールを含め、プレートを摂氏37度および5%の二酸化炭素で18〜22時間インキュベートします。

レポーター細胞から放出されるアルカリホスファターゼのレベルを決定するには、新しい平底プレートの各ウェルに180マイクロリットルのQUANTI-Blue溶液を追加します。次に、誘導されたHEK-ブルーインターフェロン-アルファ/ベータ細胞上清を20マイクロリットルを各ウェルに加え、標準的なインターフェロンコントロールウェルで色が発色するまでプレートを摂氏37度でインキュベートします。

QUANTI-Blue溶液は、酵素の存在下でピンクから紫青に変化します。最後に、分光光度計を使用して、620〜655ナノメートルで分泌されたアルカリホスファターゼのレベルを評価し、インターフェロン標準曲線の線形部分からの外挿によってI型インターフェロンの濃度を決定します。