遺伝子発現のすべての段階でウイルス機能を定量化するためのワクレポーターウイルス

この手順の全体的な目標は、ウイルス遺伝子発現が化学処理によって影響を受ける段階を特定することです。これを行うために、組織培養細胞を播種し、インキュベートします。コンフルエントになるまで、細胞はトリプルレポーターワクチンウイルスまたはコントロールプロモーターリストウイルスのいずれかに感染します。

次に、処理化合物を適用し、細胞を18時間インキュベートして、ウイルス遺伝子発現のすべての段階を完了させます。得られた蛍光は、プレートリーダーを使用して測定されます。最終的には、実験化合物によって引き起こされる発現の相対的な変化を示す結果を得ることができます。

この手法は、単一の蛍光融合タンパク質を発現するウイルスによる感染に対する主な利点として、この一連のウイルスがウイルスのライフサイクルのどこに特定の治療薬が作用しているかについてより多くの情報を提供し、その作用機序についての洞察が得られることです。この方法は、ウイルス感染の阻害剤を同定するために使用できますが、非許容性細胞株またはRNAiスクリーニングで完了したウイルス複製の段階を検出し、感染に必要な細胞因子を同定するためにも使用できます。このプロトコルは、トリプルウイルスまたはTrip V多段レポーターウイルスを利用しており、スペクトル的に異なる3つのフルオロ4つが単一のベニアウイルスのダブレットストランドゲノムに組み込まれています。

これらのフルオロフォーのそれぞれは、明確に定義されたステージ固有のプロモーターによって制御されます。C11 RプロモーターはVenusの早期発現用、G eight R中間プロモーターはM cherryの発現用、F 17 RプロモーターはタグBFPの後期発現用です。このように、Venus m CherryとタグBFPは感染時に逐次的に発現します。

コントロールとして、プロモーターリストウイルスが用いられます。PLVは、Trip Vと同様の静脈構造を含んでいますが、機能的な転写プロモーターはありません。このプロトコルは、解離から開始します。

10cmの皿で増殖させたHela細胞を、増殖培地中の細胞を1ミリリットルあたり10〜5細胞目の約2.0倍に希釈する。次に、黒壁の透明な平底96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルを分注し、細胞を摂氏37度のインキュベーターで5%二酸化炭素で24時間インキュベートし、ウイルスを希釈するまで、37°Cの水浴でトリップVとPLVを解凍し、次いで5分間超音波処理して脱凝集させる。次に、ウイルスストックを37°Cに予温した感染培地でウイルスストックを10〜7PFU/mLの1.0倍に希釈して細胞に感染させます。

増殖培地を希釈したウイルス50マイクロリットルと交換し、各処理で各ウェルに注入します。3つの複製ウェルにTripp Vを感染させ、さらに3つの複製ウェルをPLVに感染させて、各処理に特異的なバックグラウンド蛍光を考慮します。これは、時間が 0 時間に等しいと定義されます。

例えば、感染後は、それぞれ50マイクロリットルの6 96ウェルに対して350マイクロリットルを作ります。各化合物は、ウェル内にすでに存在する接種量に加えられるため、最終濃度の2倍に希釈する必要があります。次に、各処理条件について、実験化合物またはPBSやDMSOなどのビヒクル制御溶媒を希釈して、すべての反復に十分な感染培地に希釈することにより、2×マスターミックスを作成します。

さらに、実験コントロールとベクターのみのコントロールの両方で溶媒の濃度は同じである必要があることに注意してください。たとえば、DMSO で 1 マイクロリットル/ミルの IBT を使用している場合、ベクトル コントロールとして 1 マイクロリットル/ミルの DMSL のみも使用する必要があります。ウイルスを添加した直後に、この図に示すように、目的の治療用および制御化合物を含む50マイクロリットルの感染培地を各ウェルに加えます。

各化合物はTripp VとPLVを3重に使用して試験され、ウイルスごとにビヒクル制御が三重に実行されることに注意してください。摂氏37度のインキュベーターと5%の二酸化炭素で18時間インキュベートします。翌日、各ウェルにすでに存在する感染培地に100マイクロリットルの8%パラホルムアルデヒドを加えて細胞を固定し、プレートを室温で15分間インキュベートし、光から保護します。

2 x または 8% パラホルムアルデヒドを感染培地に直接添加すると、未固定のウイルスが廃棄物皿に直接反転した場合に発生する可能性のあるウイルスのエアロゾル化を防ぐことができます。15分が経過したら、プレートを廃皿に反転させて固定液を取り除きます。次に、100マイクロリットルの室温PBSを追加し、光学的に透明な接着フィルムでプレートを密封します。

プレートがすぐに読み取れない場合は、摂氏4度で保管してください。密封されたプレートを読み取る前に、結露による分光光度計の測定値の歪みを防ぐために、必ず室温に戻してください。ウイルスの増殖を定量化するには、分光光度計を使用して終点蛍光を測定します。

各チャンネルの最適化されたゲイン設定を使用して、ウェルごとに4つの測定を行います。このビデオで使用されている TAN Infinite M 1000 Pro プレートリーダーは、生の蛍光測定値を Microsoft Excel ファイルにエクスポートします。読み取り値が取得されたら、生データをMicrosoftExcelで開きます。

次に、それをコピーしてGraphPadプリズムに貼り付けます。Prismの結果シートは、Tripp vおよびPLVウェルの複製の平均を決定します。次に、各処理の平均 Tripp V 値から平均 PLV 値を減算します。

反復実験との比較を容易にするために、バックグラウンド減算データを車両のみのトリップ v ウェルズで除算してデータを正規化します。実験を複数回繰り返したら、一元配置分散分析または一元配置NOVA検定と多重比較事後検定を実行して、いずれかの処理がDMSO処理と有意に異なるかどうかを判断します。キネティックアッセイを実行する各チャネルで細胞に感染し、試験化合物を適用するには、5%の二酸化炭素を添加せずに適切なpHを維持するための緩衝培地を使用することが特に重要です。

プレートを粘着フィルムで密封した後、プレートリーダーチャンバーに37°Cに平衡させて置きます。プレートを摂氏37度に一貫して保つには、特別な注意を払う必要があります。これにより、過度の細胞ストレスや結露を防ぐことができます。

プレートリーダーのゲインを手動で設定して、後の時点の飽和を防ぎます。感染後8〜24時間、1時間ごとの測定値を取得し、正常化します。エンドポイントアッセイに関しては、前述のエンドポイントアッセイと同様の方法を使用して、個々の時点の統計的有意性を分析できます。

阻害点を比較するために、TPVまたはPLVワクチンに感染したヒーラ細胞を、ポックスウイルス阻害剤、Aris、CIBT、Rifampicin、およびST2の存在下で増殖させた46。今回は、DNA複製阻害薬aeeの存在下で感染したコントロール細胞でウイルス増殖中の緑、赤、青のフルオロフォーが連続的に発現する様子をラプス動画でご覧いただけます。初期の緑色のフルオロ4は以前と同様に生成されますが、赤色と青色の蛍光の中間および後期の産生は起こりません。

分光法による定量分析では、早期遺伝子発現は210%増加しましたが、IBTの存在下でC細胞を感染させた細胞では、中期および後期の発現が不足することが示されました。リードスルー転写は、ST2 46およびリファンピシンの存在下で感染した細胞の中間および後期発現レベルが24.7%および2.9%であった。これらは、ビリオンの組み立ておよび成熟中の後期遺伝子発現を阻害する対照群と有意差はなかった。これらの結果は、これらの化合物の作用機序の理解と一致しており、Trip Vレポーターウイルスを使用して、未知の化合物に対するウイルス阻害の特異的な段階を同定できることを示唆しています。

この手順を試行するときは、適切なコントロールを含めることを忘れないでください。これにより、結果を適切に正規化できるだけでなく、実験化合物の潜在的なメカニズムを特定することもできます。ワクシニアウイルスの取り扱いは非常に危険であることを忘れないでください、常に適切な個人用保護具を着用し、推奨されるBSLに従ってください。

2つの封じ込め技術。