Name: 遺伝子発現のすべての段階でウイルス機能を定量化するためのワクレポーターウイルス (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-15T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: 学ぶ 三重蛍光レポーターワクチニアウイルスを用いて、化学処理がウイルス遺伝子発現のどの段階に影響を与えるかを同定する方法です。蛍光測定により複製段階をリアルタイムで解析し、抗ウイルス化合物の作用機序を解明します。

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我々は、ST-246を提供するためのSIGA Technologies社（オレゴン州、OR）に感謝します。 DKRは、ボストン大学（5T32AI 7309）への免疫学のNIHの訓練助成金によってサポートされていました。この作品は、P41 086180、NIH RO1AI1096159-01、および（JHC）はRO3によって部分的にサポートされていました。

1。プレート細胞<ol><li>プレートからHeLa細胞を解離し、約2.0×10 5細胞/ mlに増殖培地（DMEM、2mMのL-過剰、10％FBS）中に希釈する。黒壁、透明な平底96ウェルプレート（20,000細胞/ウェル）に100μl/ウェルを分注する。 </li><li> +5％のCO 2、37℃のインキュベーターでコンフルエントになるまで24時間細胞をインキュベートします。 </li></ol> 2。細胞に感染<ol><li>ウイルスを希釈し、細胞に感染する。 <ol><li>解凍TRPV（トリプルウイルス;早期金星、中間mCherry、後期TagBFP）とPLV（プロモーターのない金星）は、蛍光ウイルス、5分間超音波処理を使用して脱凝集。あるいは、粗ウイルスストックの感染培地中0.25 mg / mlのトリプシンと1:1で混合し、30分間37℃でインキュベートすることができる。 </li><li> 37℃の感染培地（DMEM、2mMのL-GLUT、2％FBS）中の粗ウイルスストックを希釈する。高MOI感染症（10 PFU /細胞）の場合は、ミリリットル5×10 4と仮定すると、1.0×10 7 PFU /にウイルスストックを希釈細胞/ウェルおよび50μlの接種量。 TRPVおよび各治療に固有のバックグラウンド蛍光を考慮してPLVと同じ治療のための別の3複製ウェルに各処理について3反復ウェルに感染する計画。 </li><li>感染培地に50μl/ウェルに希釈したウイルスを加えることによってウェルに感染。これは、時間= 0時間後に感染（0 HPI）として定義されています。 </li></ol></li><li>感染培地に所望の治療化合物を希釈する。すべての処置のための単一2Xマスターミックスの希釈液を作り、井戸を複製するために適用されるべきである（ 例えば 50μlのそれぞれに6 96ウェル350μlの総量）。 <ol><li>感染培地に実験化合物を希釈する。 </li><li>車両制御溶媒（ 例えば 、PBS、DMSO）は、感染培地に希釈します。注：実験化合物に適用されるように、車両制御用溶媒の同様の最終濃度を使用すべきである（ 例えば、あなたのIBTストックはDMSOで製造し、最終concentratioで使用される場合1μLのNSは/ mlの場合、車両制御などの1μL/ ml）を単独で、DMSOを使用しています。 </li><li>感染培地に制御する化合物を希釈する。推奨制御化合物としては、β-セミカルバゾン（IBT）イサチン3.6μM（1μg/ ml）を1-β-D-アラビノフラノシルシトシン（AraCの）、50μMの（11.7μg/ ml）を、60μM（50μg/ ml）をリファンピシンを、または5μM（1.9μg/ ml）を、ST-246 8,15,16。期待される効果のための代表的な結果を参照してください。注意：これはよく、すでにボリュームに1:1の比率で添加されるので、2倍（2倍）所望の最終濃度この希釈を作る。 </li></ol></li><li>すぐにウイルスを添加した後に、ステップ2.2に希釈したように、所望の治療とコントロールを含む50μlの感染培地を追加します。注意：初期段階の式の前に阻害についてアッセイするために、化合物は、いずれの希釈ウイルス接種（ステップ2.1.2）に直接追加することができますか（ステップ2.1.3の前に）感染する前に宿主細胞。 </li><li> 37＆＃で6月24日時間インキュベートする176;インキュベーター+ C、5％CO 2。 </li></ol> 3。細胞を固定<ol><li>各ウェルに、既に感染培地に100μlの8％パラホルムアルデヒドを添加することにより、細胞を固定。光から保護して室温で15分間インキュベートする。注意：これは、高力価のメディアが固定前に直接廃棄物皿に反転している場合に発生する可能性の感染性ワクのエアロゾル化を防ぐために、感染のメディアに直接2X PFA（8％）を追加することをお勧めします。 </li><li>廃棄物の皿にプレートを反転させて固定液を除去します。 </li><li>室温100μlのPBSを追加。 </li><li>光学的に透明な接着フィルムでプレートを密封する。注：すぐに読み出されていない場合、プレートを4℃で保存することができる。分光光度計の測定値を歪ま結露を防ぐために、読む前に室温にシールしたプレートを返すようにしてください。 </li></ol> 4。ウイルスの増殖を定量化<ol><li> 、金星のために515:53​​0でmCherryため587:610をエンドポイント蛍光を測定し、415:457 FまたはTagBFP（励起：NM発光波長）。 4つの測定は、各チャネルの最適化された利得設定を用いて、ウェル当たり平均化されるべきである。注：適切な発光波長は、プレートリーダーの特定のモデル、フィルタ特性に応じて異なっていてもよい。これは、各チャネルのTRPVおよびPLV間の最大差がある点を決定するために、発光波長スキャンを実行することによって経験的に決定することができる。 </li><li>実験間の比較を容易にするために生データを正規化する。 <ol><li>各チャンネル毎に、複製TRPVおよびPLVウェルの平均を決定する。 </li><li>それぞれの治療のための平均TRPV感染実験測定からの平均PLV感染背景測定値を減算します。 </li><li>よく車専用の値によって各バックグラウンドを差し引いた値で割って、データを正規化します。 </li><li>実験は複数回、一元配置分散分析（一元配置ANOVA）試験および複数cと繰り返された後omparisonポストテストは、治療のいずれかが各チャネルのビヒクルのみの治療統計学的に有意な差を反映しているかどうかを決定するために行うことができる。 </li></ol></li></ol> 5代替プロトコル：キネティックプレートアッセイ<ol><li>処理（ステップ2.3）を添加して、すべての手順を実行します。 </li><li> 37℃に平衡化プレートリーダーチャンバ内の接着フィルムと場所とシールプレート注：特別な注意は、過度の細胞ストレスおよび結露を防ぐために、一貫して37℃でプレートを維持するために注意する必要があります。動的アッセイのために、5％のCO 2を添加せずに適切なpHを維持する緩衝培地（炭酸水素ナトリウムおよびHEPES）を使用することが特に重要である。 </li><li>後の時点での飽和を防ぐために、手動でプレートリーダーゲインを設定する。注：正確な利得の最適化は、同様の条件下で、エンドポイントアッセイを行うことによって得ることができる。 </li><li> 8月24日HPI 1時間ごとの測定値を取得し、シミを使用して正規化エンドポイントアッセイ（ステップ4.2）のように、LARの手順。 </li><li>個々の時点は、前述の終点アッセイと同様の方法を用いて統計的有意性について分析することができる。 </li></ol>

<ol><li>Yen, J., Golan, R., Rubins, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vaccinia+virus+infection+%26+temporal+analysis+of+virus+gene+expression%3A+part+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Vaccinia virus infection & temporal analysis of virus gene expression: part 1.</a> J Vis Exp. 26 (26), (2009).</li>
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</ol>

著者らは、開示することは何もないし、何の特許は、ウイルスやスクリーニング法のために保留されていません。

ここでは、ウイルス複製の再現可能な、リアルタイムのフィードバック対策を提供し、多段ワクシニアウイルスレポーター（TRPV）の実際の使用を記載している。明確に定義されたポックスウイルス阻害剤を使用することにより、我々はTRPVは、各阻害剤の作用機序を理解と一致した様式で応答することを示すことができた。 TRPVウイルスはウイルスステージの進行に関する最も包括的な情報を提供するが、二段（IREV、LREV）および単段（EV、IV、LV）ウイルスは、最適なタンパク質折り畳みを利用して、同様に使用することができる、安定性、金星フルオロフォアの優れた信号対雑音比。 このプロトコルにおける概念実証アッセイは、単純な、ハイスループットプレートアッセイにおいて知られているポックスウイルスの阻害剤によってもたらさウイルス遺伝子発現のステージを同定することの実現可能性を示している。このアッセイは、迅速に、包括的スクリーニングを完了するために拡張することができる未知の化合物ライブラリーのも同様。ウイルスは、ウイルスのライフサイクルの任意の段階を遮断...

伝統的に、ウイルス発現は、分子生物学技術（ 例えばノーザンブロッティング、ウェスタンブロッティング、マイクロアレイハイブリダイゼーション、 等 ）1を用いて研究されている。これらの方法は個々のmRNAまたはタンパク質の発現の変化を分類に関する詳細な情報を提供することができるが、これらは典型的には、リアルタイムのハイスループットプロセスに適していない。ポックスウイルスを扱うとき蛍光ベースのレポーターを使用して別のアプローチは、以前適用されている。しかし、その開発と使用法は様々な目的が動機とされています。いくつかのそのような方法は、組換えウイルスの2,3の選択のために設計した。これらの技術は、適切な取り込みおよび組換えワクシニアクローンからの外因性DNAの発現の際に、EGFPを発現する。同様に、いくつかのワク株は、安定的に、可溶性EGFPを発現しているか、ネイティブのワクシニアプロモーター下で発現GFPタグタンパク質は、広く使用されてきた。これらは代表値であるICALLYは、ウイルス侵入および複製抗体ベースの中和アッセイ中に、化学阻害、または抗ウイルス効果4-6との比較を定量化するために使用される。これらのウイルスは有用であることが証明されてきたが、これらは曖昧なため、単一の初期/後期ウイルスプロモーターのそれらの使用に阻害の点についての詳細な情報を提供する能力が制限されている。以前の方法はまた、次善の信号対雑音特性を有するEGFPタンパク質の使用を行った。 によるポックスウイルスの複製およびウイルス遺伝子発現のリアルタイムの変化をアッセイするために利用できる既存のツールの欠如が複雑であるため、我々は、単一および複数段レポーターウイルス7,8一式を開発した。以前の刊行物に記載されるように、これらのウイルスは、感染の初期、中間、または後期段階の間に一つ、二つ、または天然のワクシニアプロモーターから三スペクトル的に異なる蛍光タンパク質を発現する。これらのウイルスは、私たちすることができます蛍光顕微鏡を用いてウイルス複製の進行の指標としてオピニオン、それらは、ハイスループットプレート·アンド·リーダーベースのアッセイのために等しく良好に適している。これらのウイルスは、同等の力価が7に到達するために同様の速度論で成長し、野生型ウイルスの代わりに使いやすい。これらのウイルスの計画と作成中に、多くの注意が発現の変化（金星、mCherryとTagBFP）への迅速なフィードバックと信頼性の定量化を容易にするために、優れたフォールディング効率の高い信号対バックグラウンド特性を持つ蛍光プローブを選択する際に撮影された。さらに、ウイルスプロモーターの組み合わせがあいまいとは対照的に、高忠実度、明確な段階特異的発現、早期（C11Rプロモーター）のすべての範囲についての情報を提供して、中間体（G8Rプロモーター）と後期（F17Rプロモーター）の遺伝子発現を生成するものを選択し、初期/後期プロモーター。 これらのウイルスはINVEためのツールと​​して使用することができる原型ポックスウイルス、ワクシニアウイルスのライフサイクルをstigating。多くはまだ研究の長い歴史にもかかわらず、宿主 - ウイルス相互作用に関する知られていない。ワクは免疫調節され、拮抗ホストその多くは200以上のユニークなタンパク質を産生する、複雑です。感染時に、ワクシニアウイルスは、直ちに初期のmRNA転写を開始する。これはビリオン中にパッケージングウイルスゲノム上にロードされ、その後の感染れるまで一時停止状態に保持されたRNAポリメラーゼおよび転写因子によって促進される。この初期の発現は、主に宿主の免疫系（のmRNA脱キャップは、dsRNAの隔離、およびデコイ受容体タンパク質だけでなく、アポトーシスの阻害剤、ストレス応答、およびToll、イリノイ、およびNF-κBシグナル伝達）とゲノム複製の抑制に必要なタンパク質を生成します。初期発現はまた、中間体発現に必要な転写因子を生成する。中間表現は、​​後期転写因子の発現を含む。この発現カスケードは、成熟したワクシニアウイルス粒子の完全なアセンブリのために必要な感染症の後期段階の間の構造的および酵素的ウイルスタンパク質の産生をもたらす。 蛍光レポーターウイルスの私達のセットはポックスウイルス生物学の理解でなされるべき急速な進歩を可能にします。ウイルス学の分野で最も一般的で時間のかかる方法の一つは、増殖アッセイである。これは、典型的には、細胞に感染する感染細胞を溶解することによって治療、収穫ウイルスの系列を制定し、プラークアッセイにより得られたウイルス力価を定量することを含む。ここに記載のレポーターウイルスを使用して、容易にアッセイと並行して行う多数の処置の間で比較することができるウイルス増殖のリアルタイム測定を可能にする。我々は、試薬のセットは、薬物治療、RNAiをkに応じて、ウイルス遺伝子発現の変化を同定するための様々なプロトコルで使用される予見nockdown、又は宿主範囲制限。 また、この方法は、関心のある、具体的に定義されたターゲットのステージのためのハイスループット抗ウイルス薬物スクリーニングを可能にこれまで利用可能なより大きなスケールでの高内容分析を可能にします。ポックスウイルス感染症と戦うために、多数の潜在的な治療は同定されているが、唯一のFDAは、ポックスウイルス感染を治療するための有効な療法を承認した非環状ヌクレオシドホスホネート、シドフォビル、およびワク免疫グロブリン9,10での処理である。 1977 11における天然痘の撲滅にもかかわらず、ポックスウイルスは、人間の健康12に重大な脅威のまま。天然痘ウイルスに対する広範なワクチン接種の中止は、他のポックスウイルス13に対する感受性の増加につながっている。たとえば、以前にワクチン接種により保護されて中央アフリカの領域はサル痘ウイルス感染14の急増を経験している。重大な懸念もされている天然痘ウイルスの意図的なリリースに潜在感受性に関して提起。により現在利用可能な限られた治療に対する、新規な治療法の開発が急務とされている。これらのレポーターウイルスは、ウイルス複製の特定の段階を阻害するための迅速かつハイスループットな小分子阻害剤のスクリーニングを可能にする。阻害のない現在標的ウイルス発現段階を標的阻害剤の同定は、効力の増加との併用療法の開発を容易にする。 多くの各段の遺伝子発現の変化を観察することによってワクシニア細胞生物学について収集することができる。化学的または感染宿主細胞の遺伝子操作による減衰は、典型的には減少し、ウイルス力価で表現される。しかし、ウイルス発現カスケードの各段階の変化を比較することによって、人は、ウイルス適応度がどのようにインパクトのより完全な理解を得ることができる特定の治療によって編これらのデータは、従来のウイルス力価の出力とよく相関するが、より詳細な機構的情報だけでなく、高いスループット能力7を提供することが示されている。

<table><tbody><tr><td>ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum - Optima, Heat Inactivated (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S12450H</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine, (L-glut)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>96 Well Flat Clear Bottom Black Polystyrene TC-Treated Microplates</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>384ウェルフラットクリアボトムブラックポリスチレンTC処理マイクロプレート</td><td>コーニング</td><td>3712</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン、2X、滅菌、照射済み</td><td>Worthington Biochemical Corp.</td><td>TRLVMF</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド、細胞培養 (DMSO)</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB03091</td><td></td></tr><tr><td>1-&beta;-D-Arabinofuranosylcytosine&nbsp;(AraC)、MW= 280 g/mol</td><td>SigmaAldrich Co</td><td>C6645</td><td></td></tr><tr><td>イサチン &ベータ; -チオセミカルバゾン (IBT)、MW= 234 g/mol</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>NC9075202</td><td></td></tr><tr><td>リファンピシン、MW= 823 g/mol</td><td>SigmaAldrich Co</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>ST-246、MW= 376 g/mol</td><td>SIGA Labs、Corvallis、または</td><td></td><td></td></tr><tr><td>8% パラホルムアルデヒド (ホルムアルデヒド) 水溶液</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>157-8</td><td></td></tr><tr><td>TempPlate RT 光学的に透明なフィルム</td><td>USA Scientific</td><td>2978-2700</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM 還元血清中</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr></tbody></table>

遺伝子発現のすべての段階でウイルス機能を定量化するためのワクレポーターウイルス

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

ポックスウイルスは、サル痘、軟属腫contagiousum、およびContagaloウイルスのような積極的なヒト病原体が含まれる二本鎖DNAウイルスのファミリーである。家族はまた、天然痘ウイルス、痘瘡が含まれています。原因ポックスウイルス複製の複雑さのために、多くの疑問がまだ彼らの遺伝子発現戦略に関する残る。この記事では、ハイスループットフォーマットでウイルス遺伝子発現の単一および複数のステージのリアルタイム測定を可能にする組換えワクシニアウイルスの概念および使用を記載している。これは、ウイルス複製の3段階のそれぞれのためのレポーターとしてスペクトルが異なる蛍光タンパク質を使用することで有効になっています。段階特異的発現パターンを維持しながら、これらのウイルスは、プレートベースのアッセイおよびウイルス増殖および複製の顕微鏡観察を可能にする、高い信号対雑音比を提供する。これらのツールは、ウイルス検出、ウイルス - 宿主相互作用の研究、および進化の生物のための用途がありますでれっと。

これらのウイルスの典型的な使用法の一例として、三重蛍光レポーターウイルスは、いくつかの明確に定義されたポックスウイルス阻害剤の阻害の点を比較した。 HeLa細胞を、黒色壁透明平底96ウェルプレートを処理し、一晩培養し、組織培養にプレーティングした。プレートマップ（ 図1）に詳述されるように、またはプロモーターのないビーナス（PLV）、コンフルエントな単層を三重レポーターウイルス（ 表1 TRPV）のいずれかを用いて、10の感染多重度（MOI）で感染させた。治療を含む感染培地を0.1％DMSOの最終濃度を得るために添加し、3.6μM（1μg/ ml）をのAra​​C、50μM（11.7μg/ ml）をIBT、5μM（1.9μg/ ml）を、ST-246、または60μM三重で（50μg/ ml）をリファンピシン。全てのストックをDMSO中1μlの/ mlで使用した阻害するので、0.1％DMSOをビヒクル対照として使用した。プレートは37℃incubatoに戻したR 18 HPI時まで。細胞をすべてのウェルに100μl...

我々は、スペクトル的に別個のレポーターフルオロフォアの段階特異的発現を介して、ウイルス感染および遺伝子発現のリアルタイム測定を可能にする蛍光レポーターワクシニアウイルスの使用を記載している。我々の詳細を正確にウイルス複製を阻害する小分子に応答して影響される段階を識別するためのプレートベースの方法。

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

本手順の全体的な目的は、化学的処理によってウイルス遺伝子発現が影響を受ける段階を特定することです。そのために、組織培養細胞を播種し、コンフルエントになるまでインキュベートします。その後、細胞にトリプルレポーター・ワクシニアウイルスまたはコントロールのプロモーター欠損ウイルスを感染させます。次に、処理化合物を添加し、ウイルス遺伝子発現の全段階が完了するように細胞を18時間インキュベートします。その後、プレートリーダーを用いて得られた蛍光強度を測定します。最終的に、実験化合物によって引き起こされた発現の相対的な変化を示す結果を得ることができます。単一の蛍光融合タンパク質を発現するウイルスによる感染と比較して、本手法の主な利点は、一連のウイルスを用いることで、特定の治療薬がウイルスライフサイクルのどの段階で作用しているかについてより多くの情報が得られ、その作用機序に関する知見が得られることです。この方法はウイルス感染の阻害剤を特定するために利用できるだけでなく、非許容細胞株やRNAiスクリーンにおいてウイルス複製がどの段階まで完了したかを検出することにも利用でき、感染に必要な細胞因子の特定が可能です。本プロトコルでは、単一のワクシニアウイルスの二本鎖ゲノムに、スペクトルの異なる3種類の蛍光タンパク質を組み込んだトリプルウイルス（TrpV）マルチステージレポーターウイルスを使用します。これらのフルオロフォアは、それぞれ明確に定義されたステージ特異的プロモーターによって制御されています。Venusの早期発現にはC 11 Rプロモーター、m-cherryの発現には中間プロモーターであるG eight R、そしてtag BFPの後期発現にはF 17 Rプロモーターが用いられています。これにより、感染過程においてVenus、m-Cherry、tag BFPが順次発現します。コントロールとして、プロモーターを欠いたウイルスを使用します。PLVにはTrpVと同様のVenus構築物が含まれていますが、機能的な転写プロモーターは保持していません。まず、10 cmディッシュで培養したHeLa細胞を剥離させます。細胞を増殖培地で約2.0 × 10⁵ cells/mLまで希釈します。次に、黒色壁・透明底の96ウェルプレートの各ウェルに100 µLずつ分注します。細胞を37 °C、5% CO₂インキュベーター内で、コンフルエントになるまで24時間培養します。ウイルスを希釈するために、TrpVおよびPLVを37 °Cのウォーターバスで解凍し、その後、5分間超音波処理して凝集を解消します。次に、37 °Cに予熱した感染培地を用いて、ウイルスストックを1.0 × 10⁷ PFU/mLに希釈します。細胞に感染させるため、各ウェルの増殖培地を50 µLの希釈ウイルスに置換します。各処理について、TrpVを感染させた3つの複製ウェルと、PLVを感染させた別の3つの複製ウェルを用意し、各処理に特有のバックグラウンド蛍光を考慮します。これを感染後0時間として定義します。例えば、50 µLずつ分注する場合、96ウェルプレートの6ウェル分として350 µL作製します。各化合物は、ウェル内の接種液量に加えて添加されるため、最終濃度の2倍に希釈してください。次に、各処理条件について、実験用化合物またはPBSやDMSOなどの溶媒コントロールを、全複製分プラス1分に必要な量の感染培地で希釈し、2倍濃度のマスターミックスを作製します。実験群とベクターのみのコントロール群の両方で、溶媒の濃度を同一にする必要があることに注意してください。例えば、DMSOで1 µL/mLのIBTを使用する場合、ベクターコントロールとしても1 µL/mLのDMSO単独を使用する必要があります。ウイルスの添加直後に、この図に示すように、目的の処理化合物およびコントロール化合物を含む感染培地50 µLを各ウェルに添加します。各化合物についてTrpVおよびPLVを用いて3連（triplicate）で試験し、また各ウイルスに対してビークルコントロールを3連で実施することに注意してください。37 °C、5% CO2インキュベーター内で18時間インキュベートします。翌日、各ウェルにすでに入っている感染培地に8%パラホルムアルデヒドを100 µL加えて、細胞を固定します。プレートを室温で15分間、遮光してインキュベートします。2×または8%パラホルムアルデヒドを感染培地に直接添加することで、固定していないウイルスをそのまま廃棄容器に逆転させて捨てた場合に起こりうるウイルスのエアロゾル化を防ぎます。15分経過後、プレートを廃棄容器に逆転させて固定液を除去します。次に、室温のPBSを100 µL添加し、光学的に透明な接着フィルムでプレートを密封します。プレートをすぐに測定しない場合は、4°Cで保存してください。分光光度計の測定値が結露によって歪むのを防ぐため、密閉したプレートを測定前に必ず室温に戻してください。ウイルスの増殖量を定量するために、分光光度計を用いてエンドポイント蛍光を測定します。各チャンネルに対して最適化したゲイン設定を用い、1ウェルあたり4回の測定を行います。本ビデオで使用しているTECAN Infinite M 1000 Proプレートリーダーは、蛍光の生測定値をMicrosoft Excelファイルに書き出します。読み取りが完了した後、Microsoft Excelで生データを開いてください。次に、それをGraphPad Prismの結果シートにコピーして貼り付けます。Prismで、TrpVおよびPLVの複製ウェルの平均値を算出します。その後、各処理について、TrpVの平均値からPLVの平均値を差し引きます。複製実験との比較を容易にするため、バックグラウンドを差し引いたデータを、ビークルのみを添加したTrpVウェルの値で除して正規化します。実験を数回繰り返した後、各チャネルにおいて、いずれかの処理がDMSO処理と有意に異なるかどうかを判定するために、一元配置分散分析（one-way ANOVA）および多重比較ポストテストを実施します。キネティックアッセイを行う場合は、前述と同様に細胞に感染させ、試験化合物を添加します。この際、5%二酸化炭素を添加せずに適切なpHを維持するために、緩衝培地を使用することが特に重要です。プレートを粘着フィルムで密封した後、37 °Cに調整されたプレートリーダーのチャンバーに設置します。プレートを常に37 °Cに維持するように十分注意してください。これにより、不要な細胞ストレスや結露を防ぐことができます。後のタイムポイントでの飽和を防ぐため、プレートリーダーのゲインを手動で設定します。感染後8時間から24時間まで1時間ごとに測定を行い、エンドポイントアッセイと同様に正規化します。個々のタイムポイントについては、前述のエンドポイントアッセイと同様の方法を用いて統計的有意性を解析できます。阻害点を比較するため、TrpVまたはPLVワクシニアウイルスを感染させたHeLa細胞を、天然痘ウイルス阻害剤であるAraC、IBT、リファンピシン、およびST 246の存在下で培養しました。このタイムラプス動画は、対照細胞におけるウイルス増殖中の緑色、赤色、青色の蛍光タンパク質の連続的な発現を示しています。DNA複製阻害剤であるAraCの存在下で感染させた場合、初期の緑色蛍光は従来通りに産生されますが、中・後期における赤色および青色蛍光の産生は起こりません。分光光度法による定量分析の結果、araC処理した細胞では早期遺伝子の発現が210%増加したが、中期および後期の発現は見られなかった。リードスルー転写を促進すると考えられているIBT存在下で感染させた細胞では、中期および後期の発現レベルは対照群の24.7%および2.9%であった。ビリオンの構築および成熟過程における後期遺伝子発現以降を阻害するST246およびリファンピシン存在下で感染させた細胞は、対照群と有意な差はなかった。これらの結果は、これらの化合物の既知の作用機序と一致しており、TrpVリポーターウイルスが未知の化合物のウイルス阻害の特定段階を特定するために利用可能であることを示唆している。この手順を行う際は、適切なコントロール（対照）を含めることが重要です。これにより、結果を適切に正規化できるだけでなく、実験用化合物の潜在的なメカニズムを特定することも可能になります。ワクシニアウイルスを扱うことは極めて危険であるため、常に適切な個人用保護具を着用し、推奨されるBSL-2封じ込め技術に従ってください。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

HeLa細胞と宿主とウイルスの遺伝子発現の解析のワクシニア感染のためのプロトコル。...

ワクシニアウイルス感染とウイルスの遺伝子発現の時間的解析：その1

ワクシニアウイルス感染とウイルスの遺伝子発現の時間的解析：その2

HeLa細胞と宿主とウイルスの遺伝子発現の解析のワクシニア感染のためのプロトコル。パート3は、蛍光色素のアミノアリルカップリングにより、両方のホストとウイルスのサンプルから増幅されたRNAを標識するプロセスを説明します。...

ワクシニアウイルス感染とウイルスの遺伝子発現の時間的解析：その3

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に関与する宿主因子のためのRNAiスクリーニングワク</em使用して>ウイルス感染ショウジョウバエセル

Source: Chang, X., et al. Preparation of Pseudo-Typed H5 Avian Influenza Viruses with Calcium Phosphate Transfection Method and Measurement of Antibody Neutralizing Activity. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates a luciferase-based assay to quantify pseudovirus infection in epithelial cells. The pseudovirus encodes the luciferase gene, which is expressed in infected cells. After washing, and cells are incubated with lysis buffer at an ultra-low temperature, and then thawed to induce lysis.

Assessing Pseudovirus Infection Using Luciferase Reporter Assay

このビデオは、組換えHBVレポーターシステムを介してB型肝炎ウイルス(HBV)感染を検出するin...

ウイルス感染検出のためのin vitro組換えウイルスレポーターシステム

このビデオは、ポックスウイルス感染細胞の翻訳制御を研究するためのアッセイを示しています。非感染細胞とウイルス感染細胞に、ホタルルシフェラーゼ(Fluc)およびレニラルシフェラーゼ(Rluc)をコードするmRNAを同時トランスフェクトし、Fluc mRNAには5'ポリ(A)リーダー配列が含まれていました。溶解した細胞に生物発光基質を添加した後、両方のルシフェラーゼからのシグナルを測定して、リーダー配列によって付与されるウイルス感染細胞におけるFluc...

ポックスウイルス感染細胞における翻訳制御を研究するためのルシフェラーゼレポーターアッセイ

一過性の支配的選択の方法を使用して蛍光タグ付きタンパク質を同時に発現する組換えワクシニアウイルスの生成のための迅速かつモジュール的なプロトコルがここに記載されている。...

蛍光タグ付きワクシニアウイルスタンパク質の効率的な生成のための方法論

In vitro 転写された RNA ベースのルシフェラーゼを使用してポックスウイルスに感染した細胞で mRNA 翻訳調節を研究するためのプロトコールを提示します。このアッセイは、5 '-非翻訳領域 (UTR) および 3 '-UTR を含む、mRNA...

インビトロ転写される RNA ベースのルシフェラーゼをレポーターアッセイで、ポックスウイルス感染細胞における翻訳調節を研究する

このプロトコルは、インビボでSARS-CoV-2感染を研究するために必要な二次的アプローチの必要性を克服するために、K18...

レポーター発現組換えSARS-CoV-2を用いたK18 hACE2トランスジェニックマウスにおけるウイルス感染のライブイメージングと定量

アデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターゲノムコピーの正確な定量は重要ですが、標準化されたプロトコルはまだ確立されていません。このプロトコールでは、精製されたAAVサンプルを調製し、デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応(dd_PCR)を実施してウイルスゲノムの力価を確実に定量するための検証済みの方法について説明します。...

デジタル液滴ポリメラーゼ連鎖反応による精製ベクターサンプル中のアデノ随伴ウイルスゲノムの定量(英語)

学ぶ 三重蛍光レポーターワクチニアウイルスを用いて、化学処理がウイルス遺伝子発現のどの段階に影響を与えるかを同定する方法です。蛍光測定により複製段階をリアルタイムで解析し、抗ウイルス化合物の作用機序を解明します。

遺伝子発現のすべての段階でウイルス機能を定量化するためのワクレポーターウイルス

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