遺伝子発現のすべての段階でウイルス機能を定量化するためのワクレポーターウイルス

本手順の全体的な目的は、化学的処理によってウイルス遺伝子発現が影響を受ける段階を特定することです。そのために、組織培養細胞を播種し、コンフルエントになるまでインキュベートします。その後、細胞にトリプルレポーター・ワクシニアウイルスまたはコントロールのプロモーター欠損ウイルスを感染させます。

次に、処理化合物を添加し、ウイルス遺伝子発現の全段階が完了するように細胞を18時間インキュベートします。その後、プレートリーダーを用いて得られた蛍光強度を測定します。最終的に、実験化合物によって引き起こされた発現の相対的な変化を示す結果を得ることができます。

単一の蛍光融合タンパク質を発現するウイルスによる感染と比較して、本手法の主な利点は、一連のウイルスを用いることで、特定の治療薬がウイルスライフサイクルのどの段階で作用しているかについてより多くの情報が得られ、その作用機序に関する知見が得られることです。この方法はウイルス感染の阻害剤を特定するために利用できるだけでなく、非許容細胞株やRNAiスクリーンにおいてウイルス複製がどの段階まで完了したかを検出することにも利用でき、感染に必要な細胞因子の特定が可能です。本プロトコルでは、単一のワクシニアウイルスの二本鎖ゲノムに、スペクトルの異なる3種類の蛍光タンパク質を組み込んだトリプルウイルス（TrpV）マルチステージレポーターウイルスを使用します。

これらのフルオロフォアは、それぞれ明確に定義されたステージ特異的プロモーターによって制御されています。Venusの早期発現にはC 11 Rプロモーター、m-cherryの発現には中間プロモーターであるG eight R、そしてtag BFPの後期発現にはF 17 Rプロモーターが用いられています。これにより、感染過程においてVenus、m-Cherry、tag BFPが順次発現します。

コントロールとして、プロモーターを欠いたウイルスを使用します。PLVにはTrpVと同様のVenus構築物が含まれていますが、機能的な転写プロモーターは保持していません。

まず、10 cmディッシュで培養したHeLa細胞を剥離させます。細胞を増殖培地で約2.0 × 10⁵ cells/mLまで希釈します。次に、黒色壁・透明底の96ウェルプレートの各ウェルに100 µLずつ分注します。細胞を37 °C、5% CO₂インキュベーター内で、コンフルエントになるまで24時間培養します。ウイルスを希釈するために、TrpVおよびPLVを37 °Cのウォーターバスで解凍し、その後、5分間超音波処理して凝集を解消します。次に、37 °Cに予熱した感染培地を用いて、ウイルスストックを1.0 × 10⁷ PFU/mLに希釈します。

細胞に感染させるため、各ウェルの増殖培地を50 µLの希釈ウイルスに置換します。各処理について、TrpVを感染させた3つの複製ウェルと、PLVを感染させた別の3つの複製ウェルを用意し、各処理に特有のバックグラウンド蛍光を考慮します。これを感染後0時間として定義します。例えば、50 µLずつ分注する場合、96ウェルプレートの6ウェル分として350 µL作製します。各化合物は、ウェル内の接種液量に加えて添加されるため、最終濃度の2倍に希釈してください。次に、各処理条件について、実験用化合物またはPBSやDMSOなどの溶媒コントロールを、全複製分プラス1分に必要な量の感染培地で希釈し、2倍濃度のマスターミックスを作製します。実験群とベクターのみのコントロール群の両方で、溶媒の濃度を同一にする必要があることに注意してください。例えば、DMSOで1 µL/mLのIBTを使用する場合、ベクターコントロールとしても1 µL/mLのDMSO単独を使用する必要があります。ウイルスの添加直後に、この図に示すように、目的の処理化合物およびコントロール化合物を含む感染培地50 µLを各ウェルに添加します。

各化合物についてTrpVおよびPLVを用いて3連（triplicate）で試験し、また各ウイルスに対してビークルコントロールを3連で実施することに注意してください。

37 °C、5% CO2インキュベーター内で18時間インキュベートします。翌日、各ウェルにすでに入っている感染培地に8%パラホルムアルデヒドを100 µL加えて、細胞を固定します。プレートを室温で15分間、遮光してインキュベートします。

2×または8%パラホルムアルデヒドを感染培地に直接添加することで、固定していないウイルスをそのまま廃棄容器に逆転させて捨てた場合に起こりうるウイルスのエアロゾル化を防ぎます。15分経過後、プレートを廃棄容器に逆転させて固定液を除去します。次に、室温のPBSを100 µL添加し、光学的に透明な接着フィルムでプレートを密封します。

プレートをすぐに測定しない場合は、4°Cで保存してください。分光光度計の測定値が結露によって歪むのを防ぐため、密閉したプレートを測定前に必ず室温に戻してください。

ウイルスの増殖量を定量するために、分光光度計を用いてエンドポイント蛍光を測定します。各チャンネルに対して最適化したゲイン設定を用い、1ウェルあたり4回の測定を行います。本ビデオで使用しているTECAN Infinite M 1000 Proプレートリーダーは、蛍光の生測定値をMicrosoft Excelファイルに書き出します。読み取りが完了した後、Microsoft Excelで生データを開いてください。

次に、それをGraphPad Prismの結果シートにコピーして貼り付けます。Prismで、TrpVおよびPLVの複製ウェルの平均値を算出します。その後、各処理について、TrpVの平均値からPLVの平均値を差し引きます。複製実験との比較を容易にするため、バックグラウンドを差し引いたデータを、ビークルのみを添加したTrpVウェルの値で除して正規化します。実験を数回繰り返した後、各チャネルにおいて、いずれかの処理がDMSO処理と有意に異なるかどうかを判定するために、一元配置分散分析（one-way ANOVA）および多重比較ポストテストを実施します。キネティックアッセイを行う場合は、前述と同様に細胞に感染させ、試験化合物を添加します。この際、5%二酸化炭素を添加せずに適切なpHを維持するために、緩衝培地を使用することが特に重要です。

プレートを粘着フィルムで密封した後、37 °Cに調整されたプレートリーダーのチャンバーに設置します。プレートを常に37 °Cに維持するように十分注意してください。これにより、不要な細胞ストレスや結露を防ぐことができます。

後のタイムポイントでの飽和を防ぐため、プレートリーダーのゲインを手動で設定します。感染後8時間から24時間まで1時間ごとに測定を行い、エンドポイントアッセイと同様に正規化します。個々のタイムポイントについては、前述のエンドポイントアッセイと同様の方法を用いて統計的有意性を解析できます。

阻害点を比較するため、TrpVまたはPLVワクシニアウイルスを感染させたHeLa細胞を、天然痘ウイルス阻害剤であるAraC、IBT、リファンピシン、およびST 246の存在下で培養しました。このタイムラプス動画は、対照細胞におけるウイルス増殖中の緑色、赤色、青色の蛍光タンパク質の連続的な発現を示しています。DNA複製阻害剤であるAraCの存在下で感染させた場合、初期の緑色蛍光は従来通りに産生されますが、中・後期における赤色および青色蛍光の産生は起こりません。

分光光度法による定量分析の結果、araC処理した細胞では早期遺伝子の発現が210%増加したが、中期および後期の発現は見られなかった。リードスルー転写を促進すると考えられているIBT存在下で感染させた細胞では、中期および後期の発現レベルは対照群の24.7%および2.9%であった。ビリオンの構築および成熟過程における後期遺伝子発現以降を阻害するST246およびリファンピシン存在下で感染させた細胞は、対照群と有意な差はなかった。これらの結果は、これらの化合物の既知の作用機序と一致しており、TrpVリポーターウイルスが未知の化合物のウイルス阻害の特定段階を特定するために利用可能であることを示唆している。

この手順を行う際は、適切なコントロール（対照）を含めることが重要です。これにより、結果を適切に正規化できるだけでなく、実験用化合物の潜在的なメカニズムを特定することも可能になります。ワクシニアウイルスを扱うことは極めて危険であるため、常に適切な個人用保護具を着用し、推奨されるBSL-2封じ込め技術に従ってください。