免疫組織化学による脳組織中の異常なプリオンタンパク質の検出

誤って折りたたまれたプリオンタンパク質凝集体を示す固定された哺乳類の脳切片を含むスライドを取ります。

プリオン凝集体の感染性を減らすために、切片をギ酸で処理します。

水和圧力チャンバー内で酸性緩衝液で処理します。高熱と酸性のpHは、固定誘導タンパク質架橋を切断し、抗原性エピトープのマスキングを解除します。

過酸化水素に浸漬して内因性ペルオキシダーゼを不活性化し、望ましくないバックグラウンド染色を防ぎます。

スライドをカバープレートに置き、組織の水分補給を維持するためにバッファーを追加します。

ブロッキング溶液を導入し、非特異的抗体結合を防ぎます。

プリオン凝集体に特異的な一次抗体を追加します。

結合していない抗体分子を除去します。一次抗体に結合するビオチン化二次抗体を導入します。

結合していない抗体分子を除去します。二次抗体のビオチンに結合するアビジンと複合体を形成したビオチン化ペルオキシダーゼ酵素を追加します。

ペルオキシダーゼが酸化して着色された製品になる発色基質を追加します。

顕微鏡を使用して、染色された凝集体を観察します。

組織切片を室温で98%ギ酸に30分間慎重に浸します。切片を水道水で5分間すすぎ、その後蒸留水で2回すすいでください。500ミリリットルの蒸留水で満たされた圧力チャンバー内のステンレス鋼の染色容器を使用して、10ミリモルのクエン酸緩衝液を摂氏98度で20分間前処理します。

品質管理のため、粘着性オートクレーブインジケーターテープの一部をバスケットに置き、温度と圧力を監視します。機器がプログラム時間と温度に達したことを示すアラームが示されたら、バスケットをスライドに浸します。次に、圧力チャンバーでプログラムを開始してポイント 2 を設定し、このプログラムの初期圧力と最終圧力を記録します。

内因性ペルオキシダーゼを不活性化するには、サンプル切片を含むスライドバスケットをメタノール中の3%過酸化水素の浴に30分間浸漬します。セクションを流水で5分間すすいでください。排出後、切片をトリス緩衝生理食塩水にさらに5分間浸漬します。免疫検出のために、各スライドをトリス緩衝生理食塩水で事前に湿らせた市販のカバープレートホルダーに置きます。

ティッシュ側がホルダーに面し、スライドエッジがホルダーの2つの下部ポイントと一致するようにして、気泡がないようにしてください。スライドホルダーアセンブリを親指と人差し指で持ちます。片方の指をサンプルスライドの上に置き、もう片方の指をホルダーの底に置きます。次に、アセンブリをシステムのギャラリーに配置します。

セットが適切に組み立てられていることを確認するには、サンプルスライドとホルダーの間のウェルにトリス緩衝生理食塩水をあふれないように充填します。この時点から、ホルダーとスライドの間に約80マイクロリットルのトリス緩衝生理食塩水を保持する必要があることを確認してください。セクションを乾燥させないでください。

一次抗体で処理する前に、スライドサンプルを二次抗体宿主と同じ種の20%正常血清でトリス緩衝生理食塩水中で30分間プレインキュベートすることにより、バックグラウンド染色を減少させます。切片を洗浄せずに、200マイクロリットルの一次抗体溶液をスライドホルダーセットの各ウェルに直接塗布し、室温で60分間インキュベートします。

切片を洗浄するには、ウェルをトリス緩衝生理食塩水で満たし、5分間待ちます。洗浄を2回繰り返します。次に、ビオチン化二次抗体をトリス緩衝生理食塩水中で1〜200濃度に希釈し、10%馬血清で希釈します。

処理するセクションの数に応じて、必要なボリュームを修復します。200マイクロリットルの二次抗体溶液をスライドホルダーセットの各ウェルに適用します。室温で30分間インキュベートした後、トリス緩衝生理食塩水洗浄を繰り返します。

アビジン-ビオチン複合体ペルオキシダーゼとのインキュベーションの場合は、使用の30分前に試薬を調製してください。スライドプレートホルダーの各ウェルに200マイクロリットルの溶液を塗布します。完了したら、プレートホルダーセットを室温で30分間インキュベートします。