ヒト多能性幹細胞からの節後交感神経細胞の生成

細胞外マトリックスでコーティングされたマイクロプレートを取り、分化培地に懸濁したヒト多能性幹細胞を加えます。

この培地には、細胞シグナル伝達経路に影響を与え、神経前駆細胞への分化を誘導するシグナル伝達分子が含まれています。

神経堤細胞(NCC)への分化を誘導するシグナル伝達分子を含む別の分化培地を導入し、神経細胞および非神経細胞の前駆体です。

酵素を加えてマトリックスを破壊し、それによって細胞を解離させます。

して酵素を中和し、遠心分離して上清を廃棄します。NCCをスフェロイド培地に再懸濁し、マイクロプレートに移します。

培地の成長因子と小分子はスフェロイド形成を誘導します。

交感神経前駆神経細胞への分化を促進するレチノイン酸を補給します。

交感神経ニューロン成熟培地中の接着タンパク質でコーティングされたマイクロプレートにスフェロイドを移し、スフェロイドの付着を引き起こします。

培地中の神経成長因子とレチノイン酸は、末梢神経系の一部であり、不随意プロセスを調節する神経節後交感神経細胞への成熟を促進します。

分化誘導の1日前に、適切な数の6ウェルプレートをウェルあたり2ミリリットルの基底膜マトリックスでコーティングし、プレートを摂氏4度で一晩保存します。翌朝、プレートを室温まで温め、すぐに分割できるヒト多能性幹細胞培養物を洗浄ごとに新鮮なPBSで2回洗浄します。

2回目の洗浄後、細胞培養インキュベーターで7ミリリットルの0.5ミリモルEDTAで15分間処理してから、浮遊ヒト多能性幹細胞を吸引し、採取した細胞を50ミリリットルのチューブに移します。

同量のPBSをチューブに加えてEDTAを希釈し、遠心分離によって細胞を収集します。ペレットを1ミリリットルの01日分化培地に再懸濁します。計数のために適切な量の培地を追加する前に、ウェルあたり2ミリリットルの分化培地で細胞を1平方センチメートルあたり1.25 x 10⁵細胞の濃度に希釈します。

事前に調製した6ウェルプレートの各ウェルからすべての基底膜マトリックス溶液を吸引します。次に、各ウェルに2ミリリットルの細胞を播種し、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。翌朝、ウェルあたり3ミリリットルの01日目の分化培地を細胞に供給します。

分化の2日目に、ウェルあたり3ミリリットルの2〜10日目の分化培地を細胞に供給します。次に、10日目まで1日おきに細胞に栄養を与えます。神経堤細胞をスフェロイドに凝集させるには、10日目に細胞をPBSで洗浄し、各ウェルに2ミリリットルの解離培地を加えます。細胞培養インキュベーターで20分間後、浮遊細胞を50ミリリットルの円錐形チューブに移し、チューブ内の懸濁液の量を新鮮なPBSで50ミリリットルにします。

遠心分離によって細胞を収集し、ペレットを計数のために十分な量の10〜14日目のスフェロイド培地に再懸濁します。カウント後、10〜14日目のスフェロイド培地を使用して細胞を500マイクロリットルあたり5 x 10⁵細胞に希釈し、500マイクロリットルの細胞を超低付着24ウェルプレートの各ウェルにプレートします。次に、細胞を細胞培養インキュベーターに戻します。

最小限のスフェロイド培養を誘導するために、培養の11日目に、ウェルあたり10〜14日目のスフェロイド培地のさらに500マイクロリットルを神経堤スフェロイドに供給します。12日目に、プレートを傾けてプレートの片側にスフェロイドを蓄積し、スフェロイドを吸引せずに各ウェルからできるだけ多くの培地を慎重に吸引します。次に、ウェルあたり10〜14日目のスフェロイド培地1ミリリットルをスフェロイドに供給します。

15日目に拡張スフェロイド培養を誘導するには、ウェルあたり0.5マイクロモルのレチノイン酸を添加した1.5ミリリットルの10〜14日目のスフェロイド培地をスフェロイドに供給します。次に、スフェロイドを細胞培養インキュベーターに戻します。

14日目または28日目の交感神経細胞の分化のために、プレートを傾けてプレートの片側にスフェロイドを蓄積し、できるだけ多くの培地を慎重に吸引します。1ミリリットルの交感神経ニューロン培地を細胞に供給します。

大きなスフェロイド凝集体を小さなスフェロイドに分解するには、ウェルあたり1ミリリットル以下の培地を追加し、スフェロイドを5〜10回ピペットで分割します。

そして、事前に準備した24ウェルプレートから余分なラミニンフィブロネクチンを除去します。24ウェルスフェロイド培養プレート上の各ウェルから1ミリリットルのスフェロイドを、新しくコーティングされた24ウェルプレートの4つの別々のウェルに分割します。250マイクロリットルの新鮮な交感神経ニューロン培地を各ウェルに加え、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。翌朝、各ウェルの培地を0.125マイクロモルレチノイン酸を添加した1ミリリットルの交感神経ニューロン培地と交換し、プレートを細胞培養インキュベーターに戻します。35日目以降、各ウェルの既存の培地の半分だけを新鮮な培地に慎重に交換することにより、ニューロンに栄養を与えます。