フィーダーフリーおよび化学的に定義された培養条件下でのヒト多能性幹細胞を用いた後神経節系交感神経ニューロンの効率的な分化

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞からの交感神経の誘導を可能にする。これらの細胞は、科学者が交感神経系に影響を与える人間の障害を研究することを可能にする。この技術は、高いスケーラブルな効率で分割されたフィーダーフリーの会合条件における交感神経の導出を可能にする。

それは20日で電気的に活性なニューロンをもたらす。この技術は、機能不全交感神経系に起因する疾患に適用することができ、また、疾患のモデル化、再生医療、および薬物スクリーニングに使用することができる。これらの細胞は、例えば心臓組織調節の研究のために、共培養系内の任意の組織を革新するためにin vitroを使用することができる。

ヒト多能性幹細胞培養が80~90%の合流度に達すると、明るい縁が滑らかな大きなコロニーが観察されるべきである。分裂の場合は、37°Cと5%の二酸化炭素で0.25モルEDTAの4ミリリットルで細胞を処理する前にPBSで培養を洗浄します。2分後、10ミリリットルのE8媒体でプレートを洗い流し、剥離した細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐形チューブに移します。

その後、新鮮なE8培地の9.5ミリリットルのアリコートに細胞の500マイクロリットルを転送します。そして、幹細胞を新しいビトロネクチンにプレートし、100ミリメートルの皿をコーティングしました。分化誘導の1日前に、6つのウェルプレートの適切な数を、ウェルあたり2ミリリットルの基基膜マトリックスでコーティングします。

そして、一晩摂氏4度でプレートを保管します。翌朝、プレートを室温まで温め、洗浄ごとに新鮮なPBSでヒト多能性幹細胞培養を2回分割する準備を整えた。2回目の洗浄後、浮遊するヒト多能性幹細胞を吸引し、採取した細胞を50ミリリットルのチューブに移す前に、細胞培養インキュベーターで15分間、0.5ミリモルEDTAの7ミリリットルで細胞を処理します。

PBSをチューブに均等に添加してEDTAを希釈し、遠心分離によって細胞を採取します。ペレットを01日分化培地の1ミリリットルで再懸濁してから、適切な量の培地を加えて会計処理を行います。細胞を1.25倍に10倍から5番目の細胞濃度/平方センチメートル濃度を、井戸当たりの分化培地のミリリットルに希釈します。

前に準備した各ウェルから6つのウェルプレートに全ての基質膜マトリックス溶液を吸引する。その後、各ウェルに2ミリリットルの細胞を播種し、細胞培養インキュベーターにプレートを置きます。翌朝、1日01分化培地を3ミリリットルで細胞に供給する。

分化の2日目に、ウェルあたり2日目から10日目の分化培地の3ミリリットルで細胞を供給し、1日おきに10日目まで細胞を供給する。神経堤細胞をスフェロイドに凝集させるために、10日目にPBSで細胞を洗浄する。そして、各井戸に解離媒体の2ミリリットルを追加します。

細胞培養インキュベーターで20分後、浮遊細胞を50ミリリットルの円錐状チューブに移し、新鮮なPBSでチューブ内の懸濁液の体積を50ミリリットルにします。遠心分離によって細胞を収集します。そして、ペレットを10〜14日の十分な体積でカウントするスフェロイド培地に再懸濁する。

計数後、10~14日のスフェロイド培地を用いて500マイクロリットル濃度当たり50~5番目の細胞に細胞を5倍に希釈する。そして、超低い取り付け24ウェルプレートの各井戸に細胞の500マイクロリットルをプレート。次に細胞を培養インキュベーターに戻す。

最小限のスフェロイド培養を誘導するために、培養の11日目に、10日から14日のスフェロイド培地を1ウェルあたり500マイクロリットル追加でニューラルクレストスフェロイドに供給する。12日目に、プレートを傾けて、プレートの片側に回転楕円体を蓄積します。そして、スフェロイドを吸引することなく、各ウェルからできるだけ多くの培地を慎重に吸引する。

その後、1日10〜14回のスフェロイド培地を1ミリリットルでスフェロイドを供給します。拡大されたスフェロイド培養を誘導するために、15日目に、10日から14日の1.5ミリリットルのスフェロイド培地を10〜14個のスフェロイド培地に供給し、1回当たり0.5マイクロモルレチノイン酸を添加する。次に、スフェロイドを細胞培養インキュベーターに戻す。

交感神経分化のために、14または28日目に、プレートを傾けてプレートの片側にスフェロイドを蓄積し、できるだけ多くの培地を慎重に吸引する。交感神経培地の1ミリリットルで細胞を供給します。大きなスフェロイド凝集体を小さなスフェロイドに分解するには、1ウェルあたり1ミリリットル以下の培地を添加し、スプフェロイドを5〜10回ピペットしてから分割します。

そして、以前に調製した24ウェルプレートから過剰なラミニンフィブロネクチンを除去する。24ウェルスフェロイド培養プレートの各ウェルから、新しくコーティングされた24ウェルプレートの4つの別々のウェルの間で、プレートを1ミリリットルのスフェロイドを分割します。各井戸に新鮮な交感神経培地の250マイクロリットルを追加します。

そして、細胞培養インキュベーターにプレートを置きます。翌朝、各ウェルの培地を0.125ミクロモルレチノイン酸を添加した交感神経培地1ミリリットルに置き換え、プレートを細胞培養インキュベーターに戻す。35日後、各ウェルの既存の培地の半分のみを新鮮な培地に慎重に置き換えることによってニューロンに餌を与える。

分化の前に、ヒト多能性幹細胞コロニーは、光沢のある滑らかなエッジで丸く、ほとんど分化しない必要があります。細胞は4日目から10日目まで神経堤マーカーSox10を発現する。神経堤細胞は、6日目から見える濃い暗い尾根に現れます。

これらの尾根はまたSox10を表現する。神経堤細胞の段階では、Sox10は細胞表面マーカーCD49Dと相関し、神経堤細胞をソートするために使用することができる。正のソートと未ソートの集団は、同様の方法で神経紋スフェロイドを生成しました。

負の並べ替えられた細胞は適切に凝集しませんが、丸くて滑らかな健康的なスフェロイドを生成せず、3〜4日以内に死ぬ。さらに、神経紋スフェロイドを14日目に比較すると、神経堤および交感神経前駆細胞マーカーに対する定量的な逆転写酵素PCRは、並べ替え細胞と未ソート細胞との間に有意な差異を検出できない。20日目または35日目に、それぞれの最小または拡張プロトコルは、付随するスフェロイドから放射状パターンで成長する神経イドを観察することができる。

ノルエピネフリンの合成と輸送に関連するマーカーは、この段階で発現され、Hox6は9つのトランク神経堤遺伝子を介して発現する。電気生理学的記録はまた20日目から神経活動を検出する。このような活性は、分化ニューロンの機能を調節する交感神経の自己受容体を標的とする薬物によって増強または抑制することができる。

人間の支持者自身は、差別化のゼロ日から健康的でなければなりません。薬理学的阻害剤または活性化剤は、正常または病理学的行動を理解するためにニューロンに追加することができる。この方法は、ヒトから交感神経の生検を容易に得ることが可能になったため、交感神経生物学と病理を研究するための新しい道を開く。