Name: フィーダーフリーおよび化学的に定義された培養条件下でのヒト多能性幹細胞を用いた後神経節系交感神経ニューロンの効率的な分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: 学ぶヒト多能性幹細胞から後神経節系交感神経ニューロンを効率的に分化させるフィーダーフリー培養法。20日で電気活性を持つニューロンが得られ、自律神経障害の病態モデリングや創薬スクリーニングに応用可能です。

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ハイジ・ウルリッヒスの原稿の批判的な読み取りと編集に感謝します。

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<li>Saito-Diaz, K., Zeltner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling%2C+cell+therapy+and+drug+discovery+in+genetic+autonomic+disorders%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Autonomic+Research%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells for disease modeling, cell therapy and drug discovery in genetic autonomic disorders: a review.</a> Clinical Autonomic Research. 29 (4), 367-384 (2019).</li>
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著者らは開示するものは何もない。

我々は最近、2つのレビューを発表し、1つは、疾患モデリング31のためのhPSC由来のsymNの使用を議論し、利用可能な分化プロトコル22の詳細な比較を行った。そこで、興味のある研究者がsymNを作ることに成功するために、現在のプロトコルのトラブルシューティングに焦点を当てます。分化プロセス全体の間、一貫したデータと健康な分化細胞を得るためには、すべての段階での汚染を慎重に制御する必要があります。定期的なhPSCの維持では、マイコプラズマのテストは隔週または毎月行われるべきである。細胞の並べ替えが10日目に行われる場合、任意の培地への抗生物質の添加が非常に奨励される。また、分化を開始する前と後に細胞の形態を確認することも重要です。ここでは、いくつかの重要なチェックポイントを提案します(図6A)。まず、分化の準備ができている理想的なhPSCコロニーは、小さなスパイクを持つ明るく滑らかなエッジを持っている必要があります。歯車のようなスパイクを持つコロニーは区別し始めており、使用すべきではあ...

神経節後交感神経ニューロン(symN)は自律神経系(ANS)に属し、意識から独立した身体の恒常性の応答および調節において複数の重要な役割を果たしています。例えば、ストレスはsymNを刺激し、心拍数、血圧、発汗の増加につながる戦いや飛行応答を呼び起こします。SymNは、遺伝学、毒性/傷害、または他の疾患の仲間として、複数のヒト障害に影響を受けます。遺伝的神経障害の一例は、小児期障害家族性自律神経障害(FD)であり、symNの重度の調節不変が自律神経障害を引き起こし、発汗、皮膚のしみ、嘔吐発作、高血圧、および不安1によって明らかである。毒性の一例は化学療法治療であり、自律神経細胞に毒性の副作用があると報告されている2.自律神経性脱化および超内腎症は、パーキンソン病または高血圧性腎疾患,3,4などの疾患に併生したり、併生したりすることが知られている。このように、疾患の文脈におけるsymN生物学や欠陥のメカニズムを研究し、理解できることは、新しい効果的な治療法の探索に有益である。
解剖 学 末梢神経系は、感覚と自律神経分裂に分岐します。感覚神経系の感覚神経は痛みや触覚の原因ですが、ANSはすべての臓器から脳への情報を中継する責任があります。ANSは腸神経系に分かれており、胃腸管を内面化し、リラクゼーションに重要な副交感神経系、および器官の活性化/調節に重要な交感神経系(SNS)に分かれています。SNSは、2ニューロンシステム5を適応させる。脊髄の前神経節交感神経軸索は、神経節後のsymN細胞体が位置する交感神経節に最初に投影される。これらのニューロンは、その後、体内のすべての臓器の標的組織を内側に向けるために長い投影を送信します。前ガングリオン性ニューロンによって伝達される信号はコリン作動性であるのに対し、ポストガングlionic symNはアドレナリン性であり、したがってノルエピネフリン(NE)を主な神経伝達物質として発現する。コリン作動性であるポストガンリオニック、交感神経ニューロンの顕著な例外はほとんどありません, 血管を内在するものを含みます.アドレナリン性ポストガングLION細胞は、酵素であるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)、芳香族L-アミノ酸デカルボキシラーゼ(AAAD)、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼ(DBH)、モノアミンオキシダーゼ(MAO-A)を発現し、NEの生成と代謝を担います。さらに、NE循環性トランスポーターおよび/または受容体αアドレナリン受容体(ADRA2)、βアドレナリン受容体(ADR2B)、ノルエピネフリントランスポーター(NET1)、およびベスキュリモノアミントランスポーター(VMAT1/2)を発現する。
開発 胚発生時にsymNは神経堤(NC)に由来し、神経管とエクトダーム6を重ね合わせ、メラノサイト、骨芽細胞、椎細胞細胞、グリア、腸腸ニューロン、感覚ニューロン、自律神経ニューロン7を含む複数の細胞系統に分化することができる。神経堤細胞(NCC)は、胚を通るいくつかの経路を取る高度に回遊性細胞である。NCの開発の初期のこの段階では、細胞はマーカーSNAIL1 / 2、FOXD3、およびSOX10898、9、10、1110,11を表します。,移行ルートと、それらが採用する軸方向の位置によって、それらが開発される NC サブタイプが決まります。これらのNCサブタイプは、その特定のHOX遺伝子発現によって区別することができる:頭蓋NCCはHOX遺伝子を発現しない、迷走NCCはHOX 1-5を発現し、トランクNCCはHOX 6–9を発現し、仙骨NCCはHOX 10-1112を発現する。その中でも、トランク NCC は symN の主なソースとして認識されます。SymN前駆体は、転写因子MASH1/ASCL113を発現し、これは、PHOX2B14およびINSM115の発現を促進する。15転写因子のGATAファミリーは、後期交感神経発達中に発現される。GATA2 と GATA3 は symN で表現され、DBH16がアクティブになります。転写因子 HAND2 は、DBH および TH17の発現および維持のためにも重要です。
HPSC(例えば、胚性および誘導多能性幹細胞)は、発達パラダイムを再現し、種々のヒト障害の疾患モデリングに使用できるsymNを生成する強力なツール18である。したがって、hPSCからsymNを生成する際には、発達ガイドラインに従い、分化プロセスに沿って適切なマーカーの発現を評価することが重要です。
以前の symN プロトコル これまでに hPSC19,20,,21から symN の生成を報告した研究グループはほとんどありません。20これらのプロトコルを相互に直接比較し、我々のプロトコルは、最近22を見直した。2016年23年には、symN文字を持つ自律神経細胞の生成のための分化プロトコルを発表しました(図1A)。このプロトコルは、未分化hPSCと細胞分化の両方で使用されたKSRベースの培地を使用しました。さらに、hPSCはマウス胚性線維芽細胞(MEFフィーダー細胞)上に維持された。我々は、障害23をモデル化するためにFD患者からこのプロトコルとPSCを採用しました.2019年には、この古いプロトコル24のより詳細なバージョンを説明しました。要約すると、神経運命は、最初の2日間でTGF-βおよびBMPシグナル伝達を遮断するために二重SMAD阻害25によって誘導された。CHIR99021を用いたWNT活性化は、神経前駆物質をNC細胞に昇格させた。11日目、細胞はCD49D++またはSOX10+集団26、23に対してFACSによってソートされ、23約40%のNC生成効率をもたらした。+したがって、分化の次のステップのための効率と純度を確保するためにソートが必要であった。NccはFGF2とCHIRの併用処理により、スフェロイドとして維持および増幅された。4日後、メンテナンスのNCスフェロイドをメッキし、BDNF、GDNF、およびNGFを与え、symN成熟を終了した。これらのsymNはASCL1、TH、DBH、およびPHOX2Aなどの強力なsymNマーカーを発現したが、ニコチン性アセチルコリン受容体(CHRNA3/CHRNB4)および小胞輸送体(VMAT1/2)の発現を含む、より成熟したsymNのマーカーは、70日後の分化後も低かった。このプロトコルのHOX遺伝子は正式に試験されておらず、細胞の電気生理学的活性を含む成熟した神経特性は検証されなかった。
ここでは、symN を生成するための最適化されたプロトコルを示します (図 1B)。HPSC は、エッセンシャル 8 (E8) メディア27を使用して、ビトロネクチン (VTN) コーティングされた皿のフィーダーフリー条件で維持されます。分化媒体の式は各段階で修正されており、NC母集団28の割合を増加させる。symN成熟はCD49D+/SOX10+ソートまたはソートされていないバルクNCC集団で行うことができます。どちらも30日目までに高レベルのsymNマーカー表現を示す。さらに、このプロトコルで生成されたsymNは、電気生理学的記録およびsymN活性化剤および阻害剤化合物を用いた治療に応答する。

<table><tbody><tr><td>100 mm細胞培養ディッシュ</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>15 mL円錐組織培養チューブ</td><td>VWR/Corning</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル組織培養プレート</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル超低アタッチメントプレート</td><td>Corning</td><td>07 200 601 and 07 200 602</td><td></td></tr><tr><td>5% CO2/20% O2組織培養インキュベーター</td><td>Thermo Fisher/Lifeテクノロジー</td><td>Heracell VIOS 160i</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 円錐形組織培養チューブ</td><td>VWR/Corning</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル組織培養プレート</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovation Cell Technologies</td><td>AT104500</td><td>細胞解離溶液</td></tr><tr><td>抗AP2a抗体</td><td>Abcam</td><td>ab108311</td><td>宿主:ウサギ; 1:400</td></tr><tr><td>希釈抗Ascl1抗体</td><td>BD Pharmingen</td><td>556604</td><td>宿主:マウスIgG1; 1:200</td></tr>希釈 <tr><td>抗CD49D抗体</td><td>BioLegend</td><td>304313</td><td>宿主:マウスIgG1; 5 &mu;100 &mu;l volume</td></tr><tr><td>抗CD49D抗体(アイソタイプ)</td><td>BioLegend</td><td>400125</td><td>宿主:マウスIgG1; 5 &mu;100 &mu;l 容量</td></tr><tr><td>DAPI色素</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>1:1000 希釈</td></tr><tr><td>抗DBH抗体</td><td>Immunostar</td><td>22806</td><td>宿主:ウサギ 1:500</td></tr>希釈 <tr><td>抗GFP抗体</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td>宿主:鶏 1:1000</td></tr>希釈 <tr><td>抗HOXC9抗体</td><td>Abcam</td><td>ab50839</td><td>宿主:マウス 1:100</td></tr>希釈 <tr><td>抗NET1</td>抗体 <td>Mab</td><td>NET17-1</td><td>宿主:マウス、1:1000希釈抗</td></tr><tr><td>PRPH抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-377093/H0112</td><td>宿主:マウスIgG2a、1:200</td></tr>希釈 <tr><td>抗SOX10抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-365692</td><td>宿主:マウスIgG1、1:100</td></tr>希釈 <tr><td>抗TH抗体</td><td>Pel-Freez</td><td>P40101- 150</td><td>宿主:ウサギ、1:500</td></tr>希釈 <tr><td>アスコルビン酸</td><td>Σ</td><td>A8960-5G</td><td>ストック濃度:100 mM</td></tr><tr><td>B27サプリメント</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>12587-010</td><td>ストック濃度:50x</td></tr><tr><td>BDNF</td><td>R&D Systems</td><td>248-BD</td><td>ストック濃度: 10 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R&D Systems</td><td>314-BP</td><td>ストック濃度: 6 mM</td></tr><tr><td>セルカウンター</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>Countess II</td><td></td></tr><tr><td>セルカウンティングチャンバースライド</td><td>Invitrogen</td><td>C10312</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>57021&5424R</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>R&D Systems</td><td>4423</td><td>ストック濃度:6 mM</td></tr><tr><td>クライオバイアル</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>375353</td><td></td></tr><tr><td>dbcAMP</td><td>Sigma</td><td>D0627</td><td>ストック濃度:100 mM</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>10829-018</td><td>ストック濃度:1x</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>11330-057</td><td>ストック濃度:1x</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>サーモフィッシャー/ライフテクノロジーズ</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>E6 中</td><td>型 gibco</td><td>A15165-01</td><td></td></tr><tr><td>E8 中</td><td>型 gibco</td><td>A15169-01</td><td>原液濃度: 1x</td></tr><tr><td>E8 supplement</td><td>gibco</td><td>A15171-01</td><td>原液濃度: 50x</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>ED2SS</td><td>原液濃度: 0.5 M</td></tr><tr><td>電気生理学プレート(AXION cytoview MEA96)</td><td>Axion BioSystems</td><td>M768-tMEA-96W</td><td></td></tr><tr><td>FACSマシン</td><td>Beckman Coulter</td><td>CytoFLEX(FACS用)</td><td></td></tr><tr><td>FACSマシン</td><td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios EQ(ソーティング用)</td><td></td></tr><tr><td>FACSチューブ(青色フィルターキャップ)</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FACSチューブ(白色キャップ)</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>PeproTech</td><td>450</td><td>ストック濃度: 10 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Geltrex</td><td>Invitrogen</td><td>A1413202</td><td>基底膜マトリックス;ストック濃度:100x</td></tr><tr><td>hPSCs</td><td>Thomson et al., (1998)</td><td>WA09</td><td></td></tr><tr><td>hPSCs</td><td>Oh et al. (2016)</td><td>H9-PHOX2B::eGFP</td><td></td></tr><tr><td>Human fibronectin (FN)</td><td>VWR/Corning</td><td>47743-654</td><td>ストック濃度:1 mg/mL</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Thermo Fisher/Gibco</td><td>25030-081</td><td>ストック濃度:200 mM</td></tr><tr><td>LNタンク</td><td>カスタムバイオジェニックシステム</td><td>V-1500AB</td><td></td></tr><tr><td>MEAリーダー</td><td>アクシオン・バイオシステムズ</td><td>・マエストロ・プロ</td><td></td></tr><tr><td>マウス・ラミニンI(LM)</td><td>R&D Systems</td><td>3400-010-01</td><td>ストック濃度:1 mg/mL</td></tr><tr><td>N2 サプリメント</td><td>Thermo Fisher/Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>ストック濃度:100x</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>gibco</td><td>21103-049</td><td>ストック濃度:1x</td></tr><tr><td>NGF</td><td>PeproTech</td><td>450-01</td><td>ストック濃度:25 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-136</td><td>ストック濃度:1x</td></tr><tr><td>ポリ-L-オルニチン臭化水素酸塩 (PO)</td><td>Sigma</td><td>P3655</td><td>ストック濃度:15 mg/mL</td></tr><tr><td>プリモシン (抗生物質)</td><td>InvivoGen</td><td>ANTPM1</td><td>ストック濃度:50 mg/mL</td></tr><tr><td>qPCR マシン</td><td>バイオ・ラッド ラボラトリーズ</td><td>C1000 タッチ</td><td></td></tr><tr><td>qPCR プレート</td><td>バイオ・ラッド ラボラトリーズ</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>組換え FGF2</td><td>R&D Systems</td><td>233-FB/CF</td><td>ストック濃度: 10 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>ストック濃度:1 mM</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Tocris/R&D Systems</td><td>1614</td><td>ストック濃度:10 mM</td></tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>コーニング</td><td>MT-25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>ビトロネクチン (VTN)</td><td>サーモフィッシャー/ライフテクノロジー</td>ズ <td>A14700</td><td>ストック濃度:0.5 mg/mL</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>VWR/コーニング</td><td>706308</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>R&D Systems</td><td>1254</td><td>ストック濃度:10 mM</td></tr></tbody></table>

フィーダーフリーおよび化学的に定義された培養条件下でのヒト多能性幹細胞を用いた後神経節系交感神経ニューロンの効率的な分化

Efficient Differentiation of Postganglionic Sympathetic Neurons using Human Pluripotent Stem Cells under Feeder-free and Chemically Defined Culture Conditions

ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、疾患のモデル化やヒト胚発生の研究に役立つツールとなっています。我々は以前、自律神経障害患者に適用された交感神経を有する自律神経ニューロンの誘導のための分化プロトコルを提示した。しかし、このプロトコルは、ノックアウト血清置換(KSR)およびフィーダーベースの培養条件に基づいて構築され、高い分化効率を確保するために、細胞のソートが必要であった。これらの要因は、高い変動性、高コスト、および低い再現性を引き起こします。また、成熟した交感神経特性は、電気的活性を含めて、検証されていない。ここでは、PSC培養と分化がフィーダーフリーで化学的に定義された培養条件で行われる最適化されたプロトコルを提示する。幹神経堤を識別する遺伝子マーカーが同定される。ポストガンリオニック交感神経ニューロンへのさらなる分化は、細胞のソートを必要とせずに20日後に達成される。電気生理学的記録は、機能的ニューロン同一性をさらに示す。我々の分化されたニューロンから検出された発火はニコチンによって増強され、アドレナリン受容体拮抗薬プロプラノロールによって抑制することができる。このプロトコルにおける中間交感神経前駆物質は、最大2週間のニューラルスフェロイドとして維持することができ、培養の拡大を可能にする。要約すると、私たちの更新された交感神経分化プロトコルは、以前のバージョンと比較して、高い分化効率、より良い再現性、より柔軟性、およびより良い神経成熟を示しています。このプロトコルは、自律神経系に影響を与える人間の障害を研究するために必要な細胞を研究者に提供します。

このプロトコルでは、hPSC から symN を生成する方法について説明します。ここで示した培養条件は、以前に公開されたプロトコル23,24 (図 1A) からフィーダーフリーで化学的に定義された条件まで改善されました (図 1B)。2 つのオプションがあり、1 つは 20 日以内に symN を作成し、もう 1 つは NCC を 2 週間拡張して、さらに多くのセルを生成して symN に分化することができます (図 1B、オプション 1、および 2)。
分化されたセルの symN 特性を適切にモニターするために、PHOX2B-eGFP WA09 レポーターラインと親 WA09 PSC 回線19.すべての分化は、少なくとも1つの通路の後に独立...

本プロトコルでは、ヒト多能性幹細胞からの神経節後交感神経ニューロンの生成に対する安定した、高効率な分化戦略を説明する。このモデルは、複数の自律神経障害の研究の使用のためにニューロンを利用可能にします.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have become a powerful tool for disease modeling and the study of human embryonic development in vitro. We previously ...

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞からの交感神経の誘導を可能にする。これらの細胞は、科学者が交感神経系に影響を与える人間の障害を研究することを可能にする。この技術は、高いスケーラブルな効率で分割されたフィーダーフリーの会合条件における交感神経の導出を可能にする。それは20日で電気的に活性なニューロンをもたらす。この技術は、機能不全交感神経系に起因する疾患に適用することができ、また、疾患のモデル化、再生医療、および薬物スクリーニングに使用することができる。これらの細胞は、例えば心臓組織調節の研究のために、共培養系内の任意の組織を革新するためにin vitroを使用することができる。ヒト多能性幹細胞培養が80~90%の合流度に達すると、明るい縁が滑らかな大きなコロニーが観察されるべきである。分裂の場合は、37°Cと5%の二酸化炭素で0.25モルEDTAの4ミリリットルで細胞を処理する前にPBSで培養を洗浄します。2分後、10ミリリットルのE8媒体でプレートを洗い流し、剥離した細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐形チューブに移します。その後、新鮮なE8培地の9.5ミリリットルのアリコートに細胞の500マイクロリットルを転送します。そして、幹細胞を新しいビトロネクチンにプレートし、100ミリメートルの皿をコーティングしました。分化誘導の1日前に、6つのウェルプレートの適切な数を、ウェルあたり2ミリリットルの基基膜マトリックスでコーティングします。そして、一晩摂氏4度でプレートを保管します。翌朝、プレートを室温まで温め、洗浄ごとに新鮮なPBSでヒト多能性幹細胞培養を2回分割する準備を整えた。2回目の洗浄後、浮遊するヒト多能性幹細胞を吸引し、採取した細胞を50ミリリットルのチューブに移す前に、細胞培養インキュベーターで15分間、0.5ミリモルEDTAの7ミリリットルで細胞を処理します。PBSをチューブに均等に添加してEDTAを希釈し、遠心分離によって細胞を採取します。ペレットを01日分化培地の1ミリリットルで再懸濁してから、適切な量の培地を加えて会計処理を行います。細胞を1.25倍に10倍から5番目の細胞濃度/平方センチメートル濃度を、井戸当たりの分化培地のミリリットルに希釈します。前に準備した各ウェルから6つのウェルプレートに全ての基質膜マトリックス溶液を吸引する。その後、各ウェルに2ミリリットルの細胞を播種し、細胞培養インキュベーターにプレートを置きます。翌朝、1日01分化培地を3ミリリットルで細胞に供給する。分化の2日目に、ウェルあたり2日目から10日目の分化培地の3ミリリットルで細胞を供給し、1日おきに10日目まで細胞を供給する。神経堤細胞をスフェロイドに凝集させるために、10日目にPBSで細胞を洗浄する。そして、各井戸に解離媒体の2ミリリットルを追加します。細胞培養インキュベーターで20分後、浮遊細胞を50ミリリットルの円錐状チューブに移し、新鮮なPBSでチューブ内の懸濁液の体積を50ミリリットルにします。遠心分離によって細胞を収集します。そして、ペレットを10〜14日の十分な体積でカウントするスフェロイド培地に再懸濁する。計数後、10~14日のスフェロイド培地を用いて500マイクロリットル濃度当たり50~5番目の細胞に細胞を5倍に希釈する。そして、超低い取り付け24ウェルプレートの各井戸に細胞の500マイクロリットルをプレート。次に細胞を培養インキュベーターに戻す。最小限のスフェロイド培養を誘導するために、培養の11日目に、10日から14日のスフェロイド培地を1ウェルあたり500マイクロリットル追加でニューラルクレストスフェロイドに供給する。12日目に、プレートを傾けて、プレートの片側に回転楕円体を蓄積します。そして、スフェロイドを吸引することなく、各ウェルからできるだけ多くの培地を慎重に吸引する。その後、1日10〜14回のスフェロイド培地を1ミリリットルでスフェロイドを供給します。拡大されたスフェロイド培養を誘導するために、15日目に、10日から14日の1.5ミリリットルのスフェロイド培地を10〜14個のスフェロイド培地に供給し、1回当たり0.5マイクロモルレチノイン酸を添加する。次に、スフェロイドを細胞培養インキュベーターに戻す。交感神経分化のために、14または28日目に、プレートを傾けてプレートの片側にスフェロイドを蓄積し、できるだけ多くの培地を慎重に吸引する。交感神経培地の1ミリリットルで細胞を供給します。大きなスフェロイド凝集体を小さなスフェロイドに分解するには、1ウェルあたり1ミリリットル以下の培地を添加し、スプフェロイドを5〜10回ピペットしてから分割します。そして、以前に調製した24ウェルプレートから過剰なラミニンフィブロネクチンを除去する。24ウェルスフェロイド培養プレートの各ウェルから、新しくコーティングされた24ウェルプレートの4つの別々のウェルの間で、プレートを1ミリリットルのスフェロイドを分割します。各井戸に新鮮な交感神経培地の250マイクロリットルを追加します。そして、細胞培養インキュベーターにプレートを置きます。翌朝、各ウェルの培地を0.125ミクロモルレチノイン酸を添加した交感神経培地1ミリリットルに置き換え、プレートを細胞培養インキュベーターに戻す。35日後、各ウェルの既存の培地の半分のみを新鮮な培地に慎重に置き換えることによってニューロンに餌を与える。分化の前に、ヒト多能性幹細胞コロニーは、光沢のある滑らかなエッジで丸く、ほとんど分化しない必要があります。細胞は4日目から10日目まで神経堤マーカーSox10を発現する。神経堤細胞は、6日目から見える濃い暗い尾根に現れます。これらの尾根はまたSox10を表現する。神経堤細胞の段階では、Sox10は細胞表面マーカーCD49Dと相関し、神経堤細胞をソートするために使用することができる。正のソートと未ソートの集団は、同様の方法で神経紋スフェロイドを生成しました。負の並べ替えられた細胞は適切に凝集しませんが、丸くて滑らかな健康的なスフェロイドを生成せず、3〜4日以内に死ぬ。さらに、神経紋スフェロイドを14日目に比較すると、神経堤および交感神経前駆細胞マーカーに対する定量的な逆転写酵素PCRは、並べ替え細胞と未ソート細胞との間に有意な差異を検出できない。20日目または35日目に、それぞれの最小または拡張プロトコルは、付随するスフェロイドから放射状パターンで成長する神経イドを観察することができる。ノルエピネフリンの合成と輸送に関連するマーカーは、この段階で発現され、Hox6は9つのトランク神経堤遺伝子を介して発現する。電気生理学的記録はまた20日目から神経活動を検出する。このような活性は、分化ニューロンの機能を調節する交感神経の自己受容体を標的とする薬物によって増強または抑制することができる。人間の支持者自身は、差別化のゼロ日から健康的でなければなりません。薬理学的阻害剤または活性化剤は、正常または病理学的行動を理解するためにニューロンに追加することができる。この方法は、ヒトから交感神経の生検を容易に得ることが可能になったため、交感神経生物学と病理を研究するための新しい道を開く。

efficient-differentiation-postganglionic-sympathetic-neurons-using

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

私たちは、人間の神経前駆細胞の大量供給と神経修復のための開発CNSにおける神経細胞の種類の導出を可能にする低分子化合物、と定義された条件の下で維持さ多能性ヒト胚性幹細胞から直接、神経芽細胞の誘導のためのプロトコルを確立している。...

小分子の誘導と多能性ヒト胚性幹細胞からヒト神経前駆細胞と神経細胞の効率的な導出

多能性ヒト幹細胞の神経分化（hPSCs）のためのプロトコルは、多くの場合、時間がかかり、実質的な細胞培養のスキルを必要とします。ここでは、制御された方法で人間の神経細胞の、簡便、迅速、かつ効率的に生成できるように、multititreプレートフォーマットへの小分子ベースの分化手順を適応している。...

Multititreプレートフォーマットでヒト多能性幹細胞から神経細胞の迅速かつ効率的な生成

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ヒト多能性幹細胞からの節後交感神経細胞の生成

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非トランスジェニックおよびトランスジェニックヒト多能性幹細胞の神経前駆細胞への分化

このビデオでは、ヒトiPS細胞を運動ニューロンに分化させる過程を紹介しています。その根拠は、特定の転写因子を発現するように遺伝子改変されたiPS細胞を利用することにあります。この抗生物質をドキシサイクリンを含む培地で培養すると、転写因子の発現が引き起こされ、運動ニューロン前駆細胞へのiPS細胞の分化が促進されます。最終的に、前駆細胞をニューロン培地で培養して、成熟した機能的な運動ニューロンを生成します。...

人工ヒト人工多能性幹細胞の機能的運動ニューロンへの分化

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ヒト多能性幹細胞からドーパミン作動性ニューロンの分化を監督

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三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

このプロトコルは、以前にインビトロで神経前駆体から数週間分化していたヒト幹細胞由来ニューロンを再中断および培養するための詳細な手順を説明する。この手順は、光顕微鏡検査および高含有量スクリーニングと互換性のある形式で、神経伝達物、シナプス、および後期発現ニューロンマーカーのイメージングベースのアッセイを容易にします。...

ニューウトジェネシスとシナプス成熟の高含有量スクリーニングに対するヒト多能性幹細胞由来ニューロンの分化後再形成

ここで提示するプロトコルは、ヒト胚性幹細胞の単細胞培養の生成とその後の神経前駆細胞への分化のためのプロトコルである。プロトコルは、シンプルで堅牢でスケーラブルで、薬物スクリーニングや再生医療用途に適しています。...

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

ヒト誘導多能性由来のアストロサイトとニューロンおよびそれらの共培養を電気生理学的記録のために脊髄に分化させる方法を記載する。...

領域特異的ヒト多能性幹細胞由来アストロサイトおよびニューロンを用いたALSモデリングのための電気生理学的基盤の確立

ヒト多能性幹細胞(hPSC)から腸神経系(ENS)系統を導出することで、ENSの発生と疾患を研究し、再生医療で使用するためのスケーラブルな細胞源を提供します。ここでは、化学的に定義された培養条件を使用してhPSCから腸管ニューロンを誘導するための詳細な in vitro...

ヒト多能性幹細胞からの腸管神経系系統の分化

学ぶヒト多能性幹細胞から後神経節系交感神経ニューロンを効率的に分化させるフィーダーフリー培養法。20日で電気活性を持つニューロンが得られ、自律神経障害の病態モデリングや創薬スクリーニングに応用可能です。

フィーダーフリーおよび化学的に定義された培養条件下でのヒト多能性幹細胞を用いた後神経節系交感神経ニューロンの効率的な分化

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