人工レンチウイルスを用いたニューロンにおけるヒト多能性幹細胞分化

接着したヒト多能性幹細胞をトランスフェクション試薬中の操作レンチウイルスで処理します。

このウイルスは、抗生物質耐性の遺伝子と、テトラサイクリン応答性および調節要素によって制御される神経原性転写因子を持っています。

正に帯電したトランスフェクション試薬は、ウイルスの融合とその内容物の放出を促進します。

ウイルスRNAはDNAに逆転写して幹細胞DNAに組み込まれ、活性化タンパク質を産生する調節要素の発現を可能にします。

活性化タンパク質と複合体を形成するテトラサイクリン誘導体を含む基礎培地を加えます。

この複合体はテトラサイクリン応答性要素に結合し、遺伝子発現を促進し、幹細胞のニューロンへの分化を誘導する神経原性転写因子を産生します。

抗生物質を含む基礎培地を加えて、トランスフェクトされていない細胞を除去します。

細胞外マトリックスまたはECMを分解して細胞を放出するタンパク質分解酵素を含む剥離溶液で細胞を処理します。

酵素を除去し、成熟培地でECMコーティングされたウェルに細胞を再播種し、ニューロンの成熟を促進します。

分化誘導の2日前に、1ミリリットルの細胞剥離溶液を加え、室温で10分間インキュベートしてES細胞を分離します。細胞をチューブに移します。次に、ウェルを2ミリリットルの培地で洗浄し、同じチューブに加えます。細胞を300回gで5分間遠心分離します。次に、ペレットを培地に再懸濁し、細胞をマトリックスでコーティングされた6ウェルプレートに、ウェルあたり10〜5番目の細胞の1倍の座密度でプレーティングします。

翌日、Ngn2を発現するレンチウイルスとPuroRおよびテトラサイクリントランスアクチベーターを、新鮮なES細胞維持培地にポリブレンとともに加えます。0日目に、N2を添加し、モルフォゲンを含まないDMEM / F12培地に、ミリリットルあたり2マイクログラムのドキシサイクリンを追加します。初日に、新鮮なDMEM / F12とN2およびドキシサイクリンにピューロマイシンを1ミリリットルあたり1マイクログラムの最終濃度まで添加します。

形質導入された細胞をピューロマイシンで少なくとも24時間選択します。2日目に、分化ニューロンを細胞剥離溶液で分離し、マトリックス溶液でコーティングされた24ウェルプレートに再プレートします。ドキシサイクリンを含まないNBA / B27培地で維持します。細胞外マトリックスベースの溶液でコーティングされたプレート上で純粋に誘導されたニューロンを培養します。