多電極アレイを用いた脊髄切片間の機能的接続の再生の研究

多電極アレイ(MEA)を実体顕微鏡下のシャーレに入れます。MEAは、2つの別々のゾーンを持つグリッドに配置された電極で構成されています。

MEAに血漿を一滴加えます。ラット胚から得られた2つの脊髄スライスを、腹側を向かい合わせに配置します。

トロンビン溶液を導入し、血漿と混合し、インキュベートします。トロンビンは血漿凝固を引き起こし、MEA へのスライスの接着を促進する生物学的足場を作成します。

栄養培地を加え、攪拌下でインキュベートし、スライス間の細胞接続の形成を促進し、それらの融合を引き起こします。

実体顕微鏡下で、スライス間の組織接続を切断して病変を導入します。栄養培地を加えてインキュベートします。

インキュベーション中、ニューロンは病変全体で成長してスライスを接続します。

記録チャンバーを使用して、両方の脊髄スライスからの電気的活動を記録し、再生された機能的接続を評価します。

微小電極アレイをコーティングしたペトリ皿を実体顕微鏡下に置きます。アレイに焦点を合わせ、6マイクロリットルのチキンプラズマ液滴を電極アレイの中央に配置します。小さなへらを使用して、腹側を向かい合わせにして 2 つの脊髄切片を血漿液滴に慎重にスライドさせます。

次に、鶏の血漿液滴の周りに8マイクロリットルのトロンビンを加えます。次に、ピペットチップを使用して、鶏の血漿とトロンビンの混合物を注意深く混合し、広げます。鶏の血漿とトロンビンの混合物が粘りすぎて凝固し始める直前に、余分な液体を吸引します。次に、シャーレに蓋をし、加湿チャンバーに入れます。チャンバーを摂氏37度のインキュベーター内に約1時間置きます。

インキュベーション後、10マイクロリットルの栄養培地をサンプルに慎重に加えます。ペトリ皿に蓋をし、さらに45分間インキュベーターに戻します。次に、多電極アレイ培養アセンブリのそれぞれをローラーチューブに入れ、3ミリリットルの栄養培地を加えます。ふたをしっかりと閉め、ローラーチューブをローラードラムに入れます。ドラムを摂氏37度のインキュベーター内で1〜2 RPMで回転させます。

菌ゴム先端鉗子を使用して、多電極アレイ培養アセンブリをローラーチューブから取り外し、実体顕微鏡下でペトリ皿に入れます。組織に焦点を合わせ、2つのスライスが融合していることを確認します。

次に、アセンブリを安定させ、組織スライスに近い多電極アレイの溝にメスの刃を置きます。メスをかなり水平に持ち、メスのハンドルを持ち上げますが、メスの刃が根元から先端に転がり、溝を覆う組織を切断するようにメスの刃をアレイの溝に留めます。必要に応じて、25ゲージの針先で残存組織の接続を切断します。溝内の領域でのみ作業し、柔らかいエッジには触れないでください。

多電極アレイ培養アセンブリをローラーチューブに戻し、3ミリリットルの新鮮な栄養培地を培養物に加えます。次に、ローラーチューブを摂氏37度のインキュベーター内のローラードラムに戻します。

多電極アレイ培養アセンブリを記録チャンバーに取り付け、約500マイクロリットルの細胞外溶液をアレイに適用します。次に、アセンブリを顕微鏡に取り付けます。システムが安定するまで10分間待ってから、各活動検出電極からの基本的な自発活動を10分間記録します。