磁気活性化細胞選別法によるCD31⁺内皮前駆細胞の精製

脳微小血管内皮細胞の前駆体である内皮前駆細胞またはEPCの接着培養を取ります。

多能性幹細胞を分化させることによって得られた培養物は、表面マーカーCD31陽性のEPCと汚染されたCD31陰性細胞を含む。

解離試薬とインキュベートして細胞を分離し、ろ過して単一細胞懸濁液を得る。

培地を加えて酵素を中和し、遠心分離して上清を廃棄し、細胞をバッファーに再懸濁します。

ブロッキング試薬とインキュベートして細胞のFc受容体を阻害し、非特異的標識を防ぎます。

CD31に特異的な蛍光色素結合抗体を加え、インキュベートしてEPCを標識します。

結合していない抗体を遠心分離して廃棄します。蛍光色素に結合する1つの抗体を含む抗体複合体とインキュベートします。

ポリマーでコーティングされた磁性ナノ粒子を導入してインキュベートし、ナノ粒子が複合体の2番目の抗体に結合できるようにします。

磁場を使用して、ナノ粒子に結合した細胞を単離します。

標識されていないCD31陰性細胞を含む懸濁液を廃棄し、精製された細胞を培地に再懸濁します。CD31陽性EPCは、下流のアッセイの準備ができています。

内皮前駆細胞培養の5日目に、ウェルから培地を吸引し、各ウェルに1ミリリットルの解離試薬を加えます。プレートを摂氏37度で6〜8分間インキュベートします。マイクロピペットを使用して、細胞を解離および特異化し、次に、細胞懸濁液を40マイクロメートルの細胞ストレーナーに通し、10ミリリットルのDMEM / F-12培地を含む50ミリリットルのチューブにろ過します。

消化反応を止めるには、DMEM/F-12/10 10培地を50ミリリットルまで加えます。細胞を数えるために完全にピペットで10マイクロリットルを予約します。50ミリリットルのチューブを200 gで摂氏20〜25度で5分間遠心分離して、細胞をペレット化します。遠心分離後、上清を除去し、細胞ペレットを10ミリリットルのDMEM / F-12 / 10培地で再懸濁します。

細胞懸濁液を新鮮な15ミリリットルチューブに移します。200 gで摂氏20〜25度で5分間遠心分離し、細胞を再びペレット化します。次に、細胞ペレットをフローバッファー1に再懸濁します。次に、FcRブロッキング試薬を1対100の比率で加え、5分間インキュベートします。次に、1対200の比率で希釈したフルオレセインイソチオシアネートまたはFITC標識CD31抗体を加えます。

懸濁液を摂氏20〜25度の温度で暗所で30分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、10ミリリットルのフローバッファー1をサンプルに加え、フローサイトメトリー分析用に10マイクロリットルの懸濁液を予約して、CD31陽性細胞の割合を決定します。細胞を摂氏20〜25度で200gで5分間遠心分離します。遠心分離後、フローバッファー1溶液で細胞を再懸濁します。

次に、細胞懸濁液100マイクロリットルあたり5マイクロリットルのFITC選択カクテルを加えます。ピペッティングによって溶液を完全に混合し、摂氏20〜25度の温度で暗所で15分間インキュベートします。次に、細胞懸濁液100マイクロリットルあたり5マイクロリットルの磁性ナノ粒子を加えます。混合物をよくピペットで出し、摂氏20〜25度で暗所で10分間インキュベートします。

細胞懸濁液を5ミリリットルのフローサイトメトリーチューブに移し、フローバッファー1を加えて総容量2.5ミリリットルにします。次に、フローサイトメトリーチューブを磁石に5分間入れます。連続的な動きで、磁石を反転させ、FITC-CD31抗体非標識細胞を含む細胞懸濁液をデカントします。磁石とチューブを逆さまの位置に2〜3秒間維持してから、残りの液体を取り除きます。

チューブを直立位置に戻す前に、チューブの端にある液滴を吸引します。フローサイトメトリーチューブを磁石から取り出し、2.5ミリリットルのフローバッファー1を加えて、残りのCD31陽性細胞を洗浄します。細胞を上下に2〜3回静かにピペットで移動させ、再懸濁させます。次に、フローチューブを磁石に5分間入れます。

洗浄を少なくとも4回繰り返して、FITC-CD31非標識細胞をチューブから除去します。フローチューブを磁石から取り外し、精製されたCD31陽性細胞を所望の量の適切な培地で再懸濁します。懸濁液の2つの1マイクロリットルのアリコートを予約し、1つは細胞計数用に、もう1つはフローサイトメトリー分析を実行して、磁気活性化後の細胞選別サンプル中のCD31陽性細胞の純度を評価します。