ビオチン誘導体を用いた標的表面タンパク質のインターナリゼーションの評価

マウス皮質星状細胞を切断可能なビオチン誘導体で処理します。

低温でインキュベートして、タンパク質の内在化を防ぎ、標的表面タンパク質へのビオチンの付着を促進します。

洗浄して温かい培地を加え、インキュベートしてビオチン化タンパク質の内在化を誘導します。

洗浄し、膜不透過性還元剤で処理し、内在化していないビオチンを切断します。

急冷試薬を加えて反応を止めて洗浄します。

細胞を採取し、遠心分離します。上清を取り除きます。

溶解バッファーを加えて細胞を溶解し、非ビオチン化および内在化したビオチン化タンパク質を放出します。

遠心分離機で細胞破片をペレット化します。

タンパク質を含む上清を回収し、ストレプトアビジン-アガロースビーズを加え、混合してビオチン化タンパク質を捕捉します。

遠心分離してビーズをペレット化し、上清を廃棄します。

ローディングバッファーを加え、加熱して変性させ、ビーズからタンパク質を放出します。

タンパク質をゲル上で流し、ブロッティングメンブレンに移します。

一次抗体と二次抗体を使用して検出し、異なるタンパク質バンドを視覚化し、タンパク質の内在化が成功したことを確認します。

まず、インキュベーターからアストロサイト培養物を取り出し、培地を吸引します。次に、4ミリリットルの冷やしたCM-PBSで細胞を3回洗浄し、砕いた氷の上に皿を置きます。CM-PBSを吸引し、3ミリリットルのビオチンバッファーを各皿にピペットで入れます。皿を数回前後に傾けて緩衝液が十分に分散されていることを確認し、氷の上に30分間放置します。

次に、ビオチンバッファーを吸引し、5ミリリットルの温かい培地と交換します。1つの培養皿を摂氏37度で15分間インキュベートし、2番目の培養皿を同じ温度で30分間インキュベートします。摂氏4度の別の皿を0分サンプルとして残します。

インキュベーション期間の終了時に、培地を廃棄し、4ミリリットルの冷却CM-PBSで細胞を3回洗浄します。その後、CM-PBSを吸引し、6ミリリットルの還元バッファーを細胞上にピペットで移し、サンプルを氷上に15分間放置します。

次に、培地を6ミリリットルの新鮮な還元バッファーと交換し、サンプルを氷上にさらに15分間置きます。

還元バッファーに含まれるグルタチオンが細胞表面に残っているビオチン部分を切断するため、このステップは重要です。これにより、内在化されたタンパク質のみがバイアスされ、標識されます。

その後、還元液を取り出し、6ミリリットルの急冷バッファーと交換します。サンプルを氷上にさらに15分間放置し、焼入れステップをもう一度繰り返します。次に、急冷バッファーを廃棄し、4ミリリットルの冷却PBSで細胞を3回洗浄します。

CM-PBSを吸引し、セルリフターを使用して細胞を1ミリリットルの冷却PBSに削り取り、懸濁