近接ライゲーションアッセイを用いたショウジョウバエ幼虫のタンパク質間相互作用の検出

ウジョウバエの幼虫の体壁を考えてみましょう、運動ニューロンによって神経支配され、神経筋接合部またはNMJを形成する筋肉で構成されています。

NMJのシナプス後筋膜には、相互作用する膜結合タンパク質が含まれており、一次抗体で標識されています。

一本鎖オリゴヌクレオチドに結合した二次抗体を含む近接ライゲーションアッセイ(PLA)プローブを追加します。プローブが一次抗体に結合するまでインキュベートします。

結合していないプローブを洗い流します。

コネクタオリゴヌクレオチドおよびリガーゼ酵素を含むライゲーションバッファーとインキュベートします。

相互作用するタンパク質が近接しているため、コネクターのプローブへの結合が容易になります。次に、リガーゼがギャップを塞ぎ、環状DNAを作成します。

バインドされていないコネクタを洗い流します。

ローリングサークル増幅によって環状DNAを増幅するポリメラーゼを含む増幅溶液でインキュベートします。

蛍光色素タグ付き検出器は、増幅されたDNAにアニールし、興奮時に蛍光シグナルを生成します。

体壁をスライドに取り付けて、NMJでの蛍光標識タンパク質間相互作用を視覚化します。

アッセイを開始するには、PLAプローブ抗マウスマイナスとPLAプローブ抗ウサギプラスの両方の総量1〜5マイクロリットルで1〜5希釈液を体壁に加えます。摂氏37度で2時間インキュベートします。

洗浄バッファーAを使用して体壁を2回5分間洗浄した後、リガーゼ溶液に1〜40希釈液のリガーゼを加えます。摂氏37度で1時間インキュベートします。

インキュベーション後、洗浄バッファーAを使用して体壁を2回、それぞれ2分間洗浄してから、増幅溶液に1〜80希釈のポリメラーゼを加えます。摂氏37度で2時間インキュベートします。

イメージング用のサンプルを準備するには、洗浄バッファーBを使用して体壁を10分間2回洗浄します。次に、洗浄バッファーBの100倍希釈液を使用して、1分間最終洗浄を行います。数滴の取り付け液で体壁を少なくとも30分間平衡化します。

細い鉗子を使用して、キューティクルを下に向けて体壁をプラットフォームスライドに慎重に移します。取り付け液の一滴または二滴内に同じ方向に列に並べて配置します。気泡が発生しないように注意しながら、製剤の上に22ミリメートル×40ミリメートルのカバーガラスを置きます。次に、透明なマニキュアを使用してスライドを密閉します。