2光子蛍光寿命イメージング顕微鏡を用いたマウスのプロテインキナーゼA活性の可視化

運動皮質の上に頭蓋窓を持つ麻酔をかけたマウスをトレッドミルに固定します。

マウスは皮質ニューロンでプロテインキナーゼ-Aレポーターを発現します。

トレッドミルを2光子FLIM対物レンズの下に配置します。

対物レンズと頭蓋窓の間に水滴を追加します。

マウスを目覚めさせ、トレッドミルに慣れさせます。

明視野照明を使用して、イメージング領域を特定します。顕微鏡の筐体を閉じて、外部の光を遮断します。

イメージングパラメータを設定し、トレッドミルの回転を開始して移動を誘発し、イメージングを開始します。

強制的な移動によりPKAが活性化され、レポーターがリン酸化され、ドナーとアクセプターの蛍光色素が近づきます。

顕微鏡は赤外線レーザーを照射し、ドナーを励起してエネルギーをアクセプターに伝達し、ドナーの蛍光寿命を短縮します。

移動が停止すると、PKA とレポーターは不活性状態に戻り、エネルギー伝達が減少し、ドナーの蛍光寿命が長くなります。

画像を分析して、安静時と移動中の皮質 PKA レベルを比較します。

頭蓋窓の設置から少なくとも2週間後、2光子励起レーザーの波長を960ナノメートルに設定し、麻酔をかけた実験マウスのつま先ピンチに対する反応の欠如を確認します。麻酔をかけたマウスを電動トレッドミルに置き、マウスのヘッドプレートをトレッドミルセットアップのヘッドプレートホルダーに取り付けます。頭蓋窓カバーガラスの表面を70%エタノールで洗浄し、電動トレッドミルを2pFLIM対物レンズの下に置きます。

対物レンズの頭蓋窓カバーガラスの間に蒸留水を一滴垂らし、マウスを目覚めさせ、トレッドミルと顕微鏡の環境に少なくとも10分間慣れさせます。落射照明下で注入位置に移動し、明視野下で基準特徴を文書化して、その後のイメージングセッション中に同じ関心領域のイメージングを支援します。

落射光源のスイッチを切ります。2pFLIM顕微鏡リグの筐体を同封します。2pFLIM顕微鏡光電子増倍管をアクティブにするには、ハードウェアコマンド電圧制御をオンにします。Zスタック2pFLIM画像を取得するには、画像サイズを128 x 128ピクセルに設定します。スキャン速度は1行あたり2ミリ秒、視野はフレーム内の90〜100マイクロメートル、平均3フレームです。

準備とハードウェア構成に基づいてイメージング設定を調整します。そして、取得した画像をFLIMビューで検査します。必要に応じて、視野の縮小、スキャン速度の低下、レーザー出力の増加、平均化するフレーム数の増加を使用して、積分フォトン数を増やし、寿命推定誤差を減らします。

関心領域ごとに十分な光子を必ず取得してください。視野内の正の体細胞の実行可能な統合写真数は、約1,000〜10,000光子です。

画像が最適化されたら、トレッドミルで 15 速で少なくとも 0 分間、一定の間隔でベ