蛍光トレーシングによるマウス網膜神経節細胞サブタイプの同定

蛍光標識網膜神経節細胞(RGC)を持つトランスジェニックマウスから単離した網膜組織を記録チャンバーに入れます。

視覚情報はRGCに中継され、その軸索は視神経を介して脳に伝達します。

RGCサブタイプは、網膜内層内の亜層に層状に層状になる樹状突起の分岐パターンによって区別されます。

網膜組織を平らにし、組織アンカーを使用して固定します。

チャンバーを顕微鏡ステージに移し、酸素化溶液を灌流してRGCの生存率を維持します。

赤外線照明を使用して、蛍光RGCを識別します。

蛍光トレーサーを含むピペットをRGCに配置します。

目詰まりを防ぐために陽圧をかけます。

負圧に切り替え、膜をピペットに引き込んでシールを形成します。

吸引を加えて膜を破裂させ、樹状突起へのトレーサーの拡散を促進する全細胞構成を確立します。

樹状突起の形態と層別化を観察して、RGCサブタイプを特定します。

酸素化された細胞外溶液で網膜を洗浄し、プラスチックトランスファーピペットでガラス底記録チャンバーに移します。その後、鉗子を使用して、感光層を下に向けて組織を慎重に平らにします。ピペットを使用して余分な液体を取り除きます。そして、ナイロンメッシュのプラチナリングを使用して組織を固定します。次に、酸素を含んだ細胞外溶液をチャンバーに満たし、顕微鏡ステージに取り付けます。毎分2〜4ミリリットルの酸素化細胞外溶液で組織を灌流します。

この手順の準備をするために、マイクロピペットプーラーを使用して電気生理学的記録のためにいくつかのガラスマイクロピペットを引っ張ります。IR-DIC光学系を使用して神経節細胞層を観察します。次に、約480ナノメートルで落射蛍光を使用してGFPと神経節細胞を同定します。次に、DIC内の細胞内溶液で満たされたピペットを見つけます。わずかな正圧を加え、アンプの電圧オフセットをゼロ

いて、GFP陽性セルのガラスマイクロピペットを下げ、テスト電圧コマンドステップを適用してシール抵抗を監視します。負圧は、ピペットと細胞膜の間にギガオームシールを形成する必要があります。安定したシールを形成した後、短時間の負圧パルスを加えて膜を破裂させ、細胞全体へのアクセスを取得します。細胞の樹状突起が蛍光トレーサーで満たされるまで1〜2分待ちます。