マイクロ流体デバイスを用いた細胞のキャプチャ

私たちが準備したデバイスは、10個または20個のキットにパッケージ化されており、到着すると箱に入れて冷蔵で出荷され、キットには実行に必要なすべてのコンポーネントが含まれています。キットの実験は、室温にしておくことができるすべての注射器とバッファーを含むパケットです。また、この実験で従うプロトコルのコピーもあります。

また、冷蔵ボックスもあり、これには実際のデバイスと冷蔵が必要なすべてのランニングバッファーが入っています。通常、キットは10個または20個のグループでパッケージ化されます。使用しないときは、キットを冷蔵する必要があります。

各シリンジと各キットコンポーネントには慎重にラベルが付けられており、ラベルは私たちが従うプロトコルの表に対応しています。したがって、個々のステップでどのシリンジまたはキットコンポーネントを使用すべきかについて曖昧さはありません。デバイスを開梱し、生物学的安全キャビネットに入れた後、好中球を分離し、下流のゲノムアプリケーションのために溶解する手順を実行します。なぜなら、私たちが得た救命物は分離に使用されるか、細胞溶解物からRNAを抽出するためです。

そのため、私たちは、無菌的な意味だけでなく、環境中に通常存在するRNAもクリーンであることを確認したいと考えています。したがって、RNAを破壊する溶液ですべての領域とデバイスを拭き取ることが非常に重要です。そのため、通常、すべてのツールと作業面をRNA、SAPまたはRNAで拭き取ります。これは、多くのメーカーから入手できます。

このデバイスは、ヒートシールポーチにパッケージされています。各デバイスは、このバーコードを密封し、バーコード化しています。臨床サンプルを扱っている場合は、このバーコードをメモしておく必要があります。

そのため、デバイスは開封され、カバーが取り外され、ポンプの保持マニホールドデバイスに配置されます。私たちが使用する血液サンプルは全血のサンプルです。私たちはそれを標準的な1ミルBDシリンジに通します、そしてこれはシリンジ1とラベル付けされています。

通常、シリンジをパッケージから取り出し、キャップを慎重に血液チューブから外します。そして、700マイクロリットルまたは0.7ミルの血液を滴下し、その半分または350マイクロリットルを1.5ミルのチューブに注入します。感謝。そうすれば、あなたの血液をさらに処理するために渡すことができます。

あなたの、あなたの血液のチューブは通過することができますが、それでもデバイスが故障した場合に備えて、あなたはまだより多くの血液が残っています。さて、これからやろうとしていることは、血液が入った注射器を、この装置でチューブに接続されているこの針に装填することです。私たちは、マイクロ流体絶縁デバイスとともに、非常に優れたものになりたいと考えています。

気泡がデバイス内、デバイス内、またはデバイス誤動作しないように細心の注意を払いたいと思います。ですから、通常、私たちが行うことは、シリンジを取り、プランジャーを押し下げて液体をデバイスの上面に追加し、すべての液体を排出する前に完全に結合していることを確認します。私たちは停止し、注射器本体を針から慎重に取り外し、基本的に針の先端、または針のルアーコネクタをこの注射器に残っているバッファーで満たします。

私たちはそれを処分します。次に、血液の入った注射器を取り、このルアーハブに挿入します。血液がこぼれないように、気泡が入らないように注意してください。

シリンジの本体とチューブを保持しているケモを使用すると、血液がこぼれた場合に備えて使用することをお勧めします。シリンジをチューブハウジングまたはニードルに接続したら、コネクタにある可能性のある気泡を取り除くために、シリンジを数回鋭く叩きます。次に、このシリンジをシリンジポンプにロードし、次ににロードし、固定ネジで固定します。

シリンジポンプがオンになっており、すでに流量条件にプリセットされています。この血液を毎分30マイクロリットルで装置に流します。シリンジ本体がシリンジポンプにロードされたら、可動プランジャーアームのボタンを押して、プランジャーの上部に触れるまで下にスライドさせ、この先端から液体を押し出し始めます。

先端が鈍い、ステンレス製の針です。システムが準備されていることがわかったら、実行を押します。血液の流れを始めるには、ストップを押して止めてから、きれいな1.5ミルの遠心分離管またはフェンダーチューブを取り、慎重にプラグを抜きます。

1つだけ抜き、デバイスの1つのポートからチューブを抜きます。このチューブを抜いたら、1.5ミルのフェンダーチューブに挿入します。runを押して、血流を再開します。

そして、一滴の血液が見えると、ポンプを止めて、装置で開けたばかりの入口に挿入します。runを押して血流を開始し、タイマーを5分に設定します。私たちは、血液がすべてのチャンバーに均等に満たされ、デバイス内に明らかな気泡がないことを確認したいと考えています。

チャンバーへの流れを妨げている気泡がある場合は、ピンセットをペアにして、キャプチャチャンバーまたはキャプチャチャンバーから出る小さなチャネルにつながる小さなチャネルに沿って実行することができます。この装置はきれいに充填されているので、5分後、シリンジポンプのストップを押して血液の流れを止め、シリンジのクランプを緩めてシリンジポンプホルダーから取り出します。次に、ヌクレアーゼフリーPBSがロードされているシリンジ番号3を使用します 私たちは使用するつもりです、基本的には、再びデバイスの表面が気泡を避けるために結合していることを確認して、シリンジをタップして任意のものを作ります、任意の気泡がシリンジ本体の上部にあることを確認します。

シリンジポンプのアームを緩め、スリーミルシリンジをポンプに挿入します。それを締めてから、プランジャーをシリンジのプランジャーに接触するまで押し下げます。ランを押して、液体がデバイスをプライミングするのを待ち、ステンレス鋼の針の先端に液滴が見えるのを待ちます。

液滴が形成されているのが見えたら、ポンプを停止します。血液を取り出します、血液が入っているステンレス鋼の先端。ウォッシュバッファーを挿入し、ランを押します。

そして、これを5分間実行させます。そして、あなたはきれいなワイプを取り、ちょうどデバイスを介して洗浄バッファを実行する5分後、デバイスは任意の血液から完全にクリアされるべきであり、あなたは基本的に任意の赤い血液が残っていないことがわかるように、入口または出口にあるかもしれない血液の任意の少量を拭き取る必要があります。 デバイスがクリアに見えます。そこで、5分後には、ウォッシュバッファーの流動を停止します。

そして再び、シリンジポンプからシリンジを取り出します。1.5ミルのマイクロ遠心チューブを、フレキシブルアウトレットチューブにキャップします。そして、チューブ、マイクロ遠心分離機のチューブを慎重に持ち上げ、廃棄物チューブをデバイスから引き出します。

それをバイオハザードコンテナに捨てるつもりです。キットには新しいアウトレットチューブがあり、実際にはテフロンで作られています。それは再び、それにステンレス鋼の先端を持っています。

古いアウトレットチューブをこの新しいアウトレットチューブに交換します。そのアウトレットチューブをU字型またはV字型に曲げてみます。また、キットにはカヤシュレッダーカラムが付属しており、これはDNAをせん断し、基本的に細胞寿命を均質化します。

そこで、シュレッダーカラムの紫色のキャップを開き、アウトレットチューブをKayシュレッダーカラムに配置します。キットから2番の注射器を取り出しますが、これはRLTに使用することを示しています。これは、22ゲージの鈍い先端、ステンレス鋼を備えたシリンジに標準的なBD1ミルです。

それを使って、狂言から350マイクロリットルの標準RLTを装置に注入します。デバイスには約50マイクロリットルのデッドボリュームがあるため、RLTを注入したいのですが、RLTの後ろに空気のプラグを注入して、デバイスのデッドボリュームをカイシュレッダーカラムに放出します。そのためには、注射器を手に取り、350マイクロリットルの空気を引っ張り、次に350マイクロリットルまたは0.35ミルのRLTを吸い込み、RLTを注射器の底に置きます。

シリンジをひっくり返して空気を注入したいという誘惑に抵抗してください。空気は、すべてのRLTをKayシュレッダーカラムに確実に取り込むためにあります。洗浄バッファーからチューブを引き出します。

シリンジをRLTに挿入し、約30秒かけてRLTをデバイスにゆっくりと注入し、出口チューブが廃棄物をカイシュレッダーカラムに排出していることを確認します。デバイスに空気が注入され始めたら、プラマーを押し下げて、すべての液体がケイシュレッダーカラムに放出されるのを待ちます。私たちはケイシュレッダーコラムをcaし、15、000 RPMまたはベンチトップマイクロセンターヒューズの最大RPMでバランスを取りながらマイクロセンターフージで2分間回転させます。

そこで、カラムを2分間回転させた後、RLTに入ったサンプルを取り出し、付属のパープルキャップクライオバイアルの1つに入れます。臨床サンプルを扱っている場合は、これらのクライオバイアルをサンプリングし、実験の開始時にラベルを付けます。これがクライオバイアル中のライセートです。

このクライオバイアルは、すぐにマイナス80°CのACフリーザーに入れられ、出荷または後のRNA抽出のために保管されます。したがって、これは好中球の分離のための代替プロトコルです。RLTバッファーで細胞を溶解する代わりに、標準的な組織学的染色で細胞を染色します。

シミ。そこで、密封されたデバイスを袋から取り出し、再度開封し、デバイスにロット番号を書き留めて、ペトリ皿を置きます。ペトリ皿ホルダーに。

そのバッグシリンジ番号1から1ミルの注射器を取り出し、700マイクロリットルの血液を装填し、その半分を350マイクロリットルをエンドDPHチューブに注入します。それは脇に置いておきます。シリンジ4を手に取り、これにチューブをセットして選択し、血液をデバイスに注入します。

針の付け根をチューブの先端から化学的に保持します。シリンジ本体を外し、ルアーを充填します。アダプターは、そのシリンジをバッファリングして廃棄します。

ケムワイプを使用して、血液を含む注射器を針に挿入し、波及効果を収集します。シリンジを軽くたたいて、針とシリンジ本体の接続部にある気泡を取り除きます。シリンジをシリンジポンプに装填し、シリンジポンプの可動アームを押し下げてチューブをプライミングします。

デバイスの出口の1つであるキャプチャデバイスからチューブを外し、1.5ミルのアイノアチューブに入れます。そして、シリンジポンプでランを押して血液を流し始めます。ステンレス製の先端に血の滴ができるのを待ちます。

押す飛沫が形成されたら、その血液を軽くたたき、デバイスに挿入して実行を押します。次に、タイマーを5分に設定します。さて、デバイスを5分間流した後、シリンジポンプのストップを押してシリンジを解放します。

そして、そのシリンジを、洗浄バッファーが入った3ミルシリンジ(XPBS1つだけ)に交換します。繰り返しになりますが、デバイスの上部が結合していることを確認してから、血液またはプラスランを含む針先を取り外したいと思います。デバイスのプライミングを開始します。

液滴を形成し、それをデバイスに挿入し、入口または出口チューブで血液を軽くたたくと、洗浄ステップの後5分間それを流します。再度、シリンジポンプを停止し、シリンジをポンプホルダーから取り外します。標準的なGIM維持を行うには、まず細胞を固定し、100%メタノールを使用して脱水します。

そこで、私たちは、メタノールをあらかじめ装填した3ミルの注射器である注射器を持っています。ここでも、シリンジをプライミングし、メタノールが流れていることを確認し、シリンジポンプを停止してデバイスに挿入し、実行を押します。このメタノール溶液に2〜4分間固定します。

そこで、2〜4分間の固定とメタノールの後、ポンプを停止し、メタノールでシリンジを解放し、ここではシリンジ、シグマのeemサステイン標準eemサステインを含む3ミルシリンジを脱イオン水で1〜5希釈します。希釈した後、シリンジにロードし、シリンジの端に0.8ミクロンのフィルターを取り付けて、デバイスを詰まらせる可能性のある粒子をろ過します。5〜10分間染色します。

その後、Deion iの水ですすぎます。ですから、5分から10分後にシリンジポンプを停止し、シリンジと染色バッファーを脱イオン水を含むシリンジに交換します。基本的には、SAIの青色がデバイスから洗浄されたことを確認するまで洗い流します。余分なギムサステインがデバイスから洗い流されたら、洗浄液を停止します。

そして、私たちがやろうとしていることは、水注射器を入口から取り外すことです。次に、デバイスの出口チューブを取ります。そのチューブの最後にピンセットでつかみます。

これは柔軟なタイゴンチューブであり、デバイスの入口に戻します。これにより、デバイスが密閉され、細胞が水分を補給され、その形態が損なわれないように保たれます。次に、私の同僚であるJohn Hong Chang博士が、CDの4つの陽性リンパ球を分離し、その後、マイクロ流体デバイス内で直接免疫蛍光染色を行うための代替プロトコルを示します。

私の名前はShong Hongで、今日は、この段階でマイクロ流体デバイスでの細胞染色を実演し、マイクロフリック免疫親和性単離装置を使用して前例のない全血から血液細胞を特異的に分離する方法をすでに示しています。彼の目的のために、彼は細胞をシラミにし、それらの分離された細胞からタンパク質とDNAの含有量を取得したいと考えています。そうですね、私の研究では、細胞を採取し、細胞数を取得すること、例えば、全血からCD4細胞数を取得し、それを診断の指標として使用することに興味があります。

したがって、使用するデバイスはケンのデバイスと非常によく似ています。それは外側のP-D-M-S-Aストレートチャンバーで作られています。ジオメトリがわずかに異なるため、操作パラメータはわずかに異なりますが、一般的に全体的な操作手順は非常に似ています。

そこで、細胞の捕捉とリンスのすべてのステップをスキップして、細胞カウント手順の細胞染色ステップに直接ジャンプします。つまり、ここには、全血から細胞の半分がすでに取り込まれ、すでにPBSですすがれているデバイスがあります。そのため、出動細胞はすでにデバイスから洗い流されており、細胞の標識に特化して使用される抗体混合物を事前に準備し、デバイスに単離しました。

そのため、ここで使用した抗体濃度は、蛍光顕微鏡で非常に高い蛍光強度で細胞を染色するために最適化されています。したがって、手順は非常に簡単です。抗体溶液を充填したシリンジをシリンジポンプにセットし、流量が必要なパラメータに設定されていることを確認します。

次に、シリンジポンプを始動し、チューブの端を観察し、チューブ内に泡が入らないように、溶液がすでに出ていることを確認します。そして、細胞が捕捉されたマイクロ流体デバイスにチューブを差し込むことができます。つまり、抗体がデバイスに流れ込み、分離した細胞を染色するために、デバイス内では、ここでの流量は毎分5マイクロリットルを使用していますが、デバイスの形状によっては、目的に応じて使用したいフローパラメータが異なる可能性があります。

そして、抗体溶液の流入を5分間遅らせますが、これはmicrophoチャネル内のすべての溶液を置き換えるのに十分な量です。ですから、抗体注入後は流れを止めます。そこで、私たちは、マイクロチャネル内のすべての溶液を交換するために、毎分5マイクロリットルで抗体に5分間浮遊させます。

その後、流れを止め、デバイスをインキュベートして室温で30分間待ちます。したがって、これは、抗体が消光されないように、細胞が消光されることなく、細胞が染色抗体とインキュベートされている間に蛍光抗体が消光されるように、暗所で行う必要があります。そのため、通常15分から30分ほど染色した後、デバイスからチューブを抜き、抗体シリンジをバッファーシリンジに交換して、デバイスから未結合の抗体を洗い流します。

したがって、ここの洗浄液にはPBS溶液に1%BSAが含まれています。BSAは、表面上の抗体の非結合をブロックするために使用され、私たちも同じことを行います。そのため、まずシリンジポンプの流量を調整して、必要な流量であることを確認し、次にシリンジポンプを始動して、チューブから実際に液体が出ていることを確認してから、デバイスに差し込むようにします。

それを行う目的は、チューブに残ったような気泡が残らないことです。そのため、注入してもデバイスに気泡は入りません。そこで、チューブをデバイスに差し込んで、さらに5分間流すだけで、デバイスからのウォッシュアウト、つまり結合していない抗体をすべて交換します。

洗浄ステップの後、細胞を1%PFAで固定します。それを行う目的は、イメージングをすぐに実行できる場合、デバイスを数週間から数週間保存できるようにすることです。したがって、手順は非常に簡単です。

これは、私たちが以前に行ったことと似ています。シリンジをポンプにロードし、流量を希望の流量に調整してから、シリンジポンプを始動し、チューブをデバイスに差し込んで、細胞を固定するための固定剤であるパラフォームIDEソリューションを注入します。再び、約5分間流します。

そのため、PFAはデバイス内のすべてのバッファを置き換えて、デバイス内のすべてのセルを固定します。そのため、PFA固定ステップの後、PFAシリンジを取り外すだけで、デバイスはイメージングの準備が整います。場合によっては、細胞表面マーカー染色と重ね合わせるために核染色をしたい

そのため、最後にDPIを使用して核染色を行います。したがって、シリンジポンプの電源を入れてDPIをデバイスに流し込むだけで、DPIシリンジをロードします。したがって、今度は核がそれらの細胞で染色され、細胞の位置を示します。

そして、これは、DPI染色画像を後で表面マーカー染色と重ね合わせて、細胞がどこにあるかを示すことができます。したがって、DPI染色の最後に、LバンドDPI Pを緩衝液で再度洗い流す必要があります。したがって、繰り返しになりますが、1%BSAを含むPBSを使用して、アウトバウンドdpiを洗い流しています。

そして、操作は以前に行ったことと似ています。バッファーシリンジをデバイスに差し込むだけで、バッファーをデバイスに流し込み、未結合のdapを洗い流します。以上が、マイクロ流体デバイスで細胞を染色する手順全体です。

そして、すべての染色手順の後、デバイスはイメージングの準備が整います。また、PFA固定を行ったため、デバイスを数週間保存することもできます。画像撮影がすぐに行えなかった場合