HIV - 1コアのin vitroでの脱殻で

この手順の全体的な目標は、HIVの1つの原因のinvitroENCコーティングを実行することですこれは、最初にHIV1つの粒子を生成することによって達成されます。その後、変異体は超遠心分離によって濃縮されます。次のステップは、ショ糖勾配超遠心分離によって原因を特定することです。

最後に、HIV V 1 コーティング解除の速度論的アッセイが行われます。最終的に、結果は、Elizaによる口蓋と上清のca含有量の定量化を通じて、HIVの1つの原因の時間依存的なコーティング除去を示しています。この問題は、コード化における細胞因子の役割や、プロリン前のウイルス捕捉安定性に対する突然変異の影響など、HIVの1つの充填における重要な質問に答えるのに役立ちます。

感染性H HIV Vのバイオセーフティ施設で働くには、所属機関のバイオセーフティオフィスから許可を取得し、ガイドラインに従う必要があります。バイオセーフティ研究所で作業している間は、適切な取り扱いと注意を払う必要があります。このデモンストレーションでは、HIV OneプロウイルスDNAを持つ2 9 3 T細胞の一過性トランスフェクションにより、HIV One粒子が生成されます。

トランスフェクションの前日にリン酸カルシウムトランスフェクション法を用いて、以前に得られた2 9 3T細胞を培養し、それらをEDTAシード中の0.5%トリップを用いてプレートから分離し、変異体の作製のための6つの100ミリメートル培養皿の翌日、細胞単層は約25%の共生性であり、6つの細胞皿に対するトランスフェクションの準備ができているはずである。トランスフェクトするには、120マイクログラムのプロウイルスDNAを使用して、書面によるプロトコルに記載されているように、塩化カルシウムと最適な緩衝生理食塩水を含む混合物を調製し、得られた混合物の1ミリリットルを各皿の中心に滴下しながら、穏やかに渦巻いて混合します。摂氏35度と二酸化炭素3%に設定されたインキュベーターに皿を一晩置きます。

一晩インキュベートした後、培地を吸引し、5ミリリットルのPBSを穏やかに加え、次にPBSを吸引して5ミリリットルの新鮮な培地と交換します。この時点で、インキュベーター内で細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%でさらに24〜48時間培養します。次に、ウイルス粒子を含む培養液を回収し、50ミリリットルの円錐形遠心チューブに移します。

すべてのディッシュからS上清を混合した後、サンプルを遠心分離して細胞と破片をペレット化し、0.45ミクロンの細孔サイズのシリンジフィルターを使用してSUP被清液をろ過します。培養物の上清を置くことにより、HIV1フューリオンの濃縮を開始します。38.5ミリリットルのポリアラム遠心チューブ入り。

32, 000 RPMおよび4°Cで3時間ピペット遠心分離機を使用して、PBS中の20%スクロースを5ミリリットル含有するSUP被覆液を含むウイルスを穏やかに下敷きし、ウイルス粒子をペレット化します。チューブの底にあるペレットを乱さないように、SUPナタントを慎重に取り除きます。STEバッファーの1倍を0.5ミリリットルチューブに加えます。

サンプルを摂氏4度に1時間置き、ペレットを緩めます 1時間後、幅の広いボール1ミリリットルのピペットチップを使用して、数回静かに上下にピペッティングして、チューブの底からペレットを取り外します。次に、緩めたペレットを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。発泡しないように注意しながら、インキュベーション後にウイルスの小さな塊が分散するように、摂氏4度でさらに1〜3時間インキュベー

ウイルス懸濁液を数回ゆっくりと上下にピペットで動かします。最後に、懸濁液を8, 000 RPMで冷蔵マイクロフュージで1分間遠心分離し、残留塊を除去して12ミリリットルの線形30〜70%のスクロース勾配を調製します。20ミリリットルのグラジエントフォーマーを使用し、6ミリリットルの70%スクロース溶液を展望ポートに最も近い手前側に置きます。

次に、6ミリリットルの30%スクロース溶液を反対側に置きます。気泡がチャネルに閉じ込められていないことを確認してください。2つのチャンバーを自動密度フローグラディエントで接続します。

前者は、底部に1ミリリットルの85%ショ糖溶液を含む14.5ミリリットルのポリアーマー遠心分離管の底部から上部への勾配をポンプで送ります。グラディエントを摂氏4度で冷えるまで静かに置きます。グラジエントが冷えたら、ワイドボアの1ミリリットルのピペットチップを使用して、1%トリトン×100を含むSTEに0.25ミリリットルの15%スクロース溶液を穏やかに重ねます。

次に、STE中の0.25ミリリットルの7.5%スクロース溶液を穏やかに重ねます。レイヤーが混ざらないように注意してください。次に、0.5ミリリットルのウイルス懸濁液で勾配を穏やかに重ねます。

このステップは、下に敷設されたショ糖層の勾配と混合の乱れを避けるために慎重に実行する必要があります。次に、チューブをプレコ遠心分離機のバケツに入れます。遠心分離機の真空が250ミクロンに達したら、サンプルを32, 000 RPMで一晩中摂氏4度で遠心分離します。

遠心分離後、自動密度フローグラジエントフラクショネーターを使用して、グラジエントの上から下に1ミリリットルのフラクションを収集します。採取後すぐにチューブを氷の上に置きます。チューブの内容物を数回反転させて混合します。

次に、各画分を50マイクロリットル引き出して、e LSAまたは逆転写酵素活性アッセイによる定量化を行います。コーティングアッセイを行う前に、どの画分に無傷のHIV V1つの原因が含まれているかを決定し、書かれたプロトコルに記載されているようにアリコートを組み合わせます。懸濁液の粘度を下げ、ピペッティングエラーを最小限に抑えるために、STEバッファーの1倍を同量の冷たくしてHIVの原因のアリコートを事前に希釈します。

0.15ミリリットルの冷たく1倍のSTEバッファーを十分なマイクロ遠心チューブに追加し、試験する所望の時点とゼロ分制御を行います。STEバッファーにBSAを添加することで、原因がチューブの壁に付着するのを防ぐことができます。次に、原因の100マイクロリットルを、チューブを数回反転させて混合した各調製チューブにさらに希釈します。

1本のチューブを氷上に置いてゼロミニッツコントロールを行い、コーティング解除量の増加を決定します。サンプルの時間とともに。残りのチューブを摂氏37度の水浴に入れます。

チューブが少なくとも内部液体のレベルまでウォーターバスに浸されていることを確認してください。均一な温暖化を確保するために、サンプルを一定の間隔でインキュベートします。インキュベーション期間の終わりにチューブをフリックすることにより、チューブの内容物を定期的に穏やかに混合します。

チューブを氷に10分間置いて、コーティング解除プロセスを停止します。precoの遠心分離機の回転子の遠心分離機のサンプル管そして45、摂氏温度の20分間毎分000回転の制御。これにより、無傷の原因がペレット化されますが、原因のコーティング解除の結果として放出された遊離 ca は、遠心分離後も s 上清に残ります。

スナットを別々のチューブに移し、ペレットを再懸濁します。250マイクロリットルのEliにおいて、サンプル希釈剤は、書面によるプロトコルに記載されているように、P 24 Elizaを使用してペレットと上清の両方のCA含有量を定量化します。最後に、コーティング解除の程度は、上清中に存在するcaの割合を計算することによって取得できます。

原因を含む分数を決定するためのELIZAの結果の例を次に示します。12個の画分の値を加算して得られるP 24とも呼ばれる総caは、原因を含む8〜10個の画分を含む14.5マイクログラムでした。分数1または2には、常にP24が最も多く含まれており、これは遊離caを表し、原因とは関連付けられていません。

これに続いて、各画分ごとにP 24値が徐々に減少し、次に急激に増加し、最後にP 24値が急激に減少します。グラジエントをロードする際に適切な注意を払えば、ピークは常にフラクション10に近づくはずです。ここに示されているのは、HIVの原因のコーティング解除の動態を行うことによって得られる典型的な結果です。

このグラフは、野生型HIVのコーティング解除の時間依存的な増加を示しています。コーティング値の割合は、穿刺状に存在するcaの割合を計算することによって得られました。コーティング解除の基礎レベル、およびコーティング解除の速度は、原因のバッチによってわずかに異なる可能性があります。それにもかかわらず、このアッセイは再現性が高く、in vitroでのウイルス原因の安定性を決定するのに役立ちます。この手順に参加する際には、このアッセイの再現性がサンプルの適切な取り扱いに大きく依存することを覚えておくことが重要です。

HIV V one course以来、私たちのヒートラボでは、インキュベーション期間を除いて、アッセイ全体を通してサンプルを4度に保つことが重要です。