2Dと3D環境での神経前駆細胞の電界制御監督移行

この手順の全体的な目標は、2D培養モデルおよび3Dex vivoモデルにおける神経前駆細胞の遊走に対する印加電界の影響を記録することです。これは、まずニューロン神経前駆細胞をin vitroで単離し、増殖させることによって達成されます。第2のステップは、神経前駆細胞の単一細胞懸濁液を調製することです。

次に、2D培養調製のために、神経前駆細胞をカスタム設計の電気戦術チャンバーに播種します。あるいは、3D ex vivoモデル調製のために、神経前駆細胞をフック3、3、3、4、2で標識し、脊髄切片器官型モデルに注入する。最終的に、電界がエレクトロチャンバーに印加され、タイムラプス記録が行われて、前駆細胞が2D環境と3D環境の両方で電界のカソードに向かって移動することを示します。

この技術の主な利点は、自然環境によく似た3D器官型モデルへの移植後の個々の細胞の電界誘発移動をライブトラッキングするための新しい方法を提供することです。この方法は、脊髄スライスに移植された神経内膜細胞の移動を電気技術にインセットするだけでなく、脳スライスが小さくモデル化される他のシステムにも適用できます。この手順を開始するには、オートクレーブを22ミリメートルで分割して、22 x 11ミリメートルのガラス片を準備します。

ナンバーワンの厚さのカバーは、ダイヤモンドペンを使用して半分に滑ります。次に、4つを垂直に接着し、22 x 11ミリメートルのストリップを高真空シリコーングリースと一緒に立たせて、内部寸法22 x 10ミリメートルの自立型ガラスウェルを作成し、ウェルを完全に乾燥させて一晩で硬化させます。翌日、22 x 11ミリメートルのガラスストリップを2枚平行に取り付け、シリコングリースを使用して100ミリメートルの培養皿の底面に10ミリメートルの隙間を残します。

次に、22 x 22 mmのカバースリップをシリコングリースで取り付けて、これらのストリップ間の領域を密封します。ガラスをカバースリップにしっかりと置き、内壁が細胞を播種するための限られたスペースを作り出すようにします。すべてのジョイントをシリコングリースで防水します。

この限られた領域をポリデリシンで順番にコーティングし、続いて添付の原稿に記載されているようにラミニンをコーティングします。この手順では、E 14マウスからE 16マウスの脳を採取し、それらを冷冷D-M-E-M-F 12基礎培地に入れる。次に、解剖顕微鏡で髄膜を取り除きます。

その後、脳を35ミリメートルのシャーレに移します。細い鉗子を使用して、脳を組織の断片に解離します。次に、それらを15ミリリットルのチューブ遠心分離機に移します。

800 RPMで3分間サンプルを採取し、Dの破片を除去します。次に、サンプルにBFDFとDGFを含むA-D-M-E-M-F 12。Tritrateは1ミリリットルのピペットでそれらを食べました。

次に、セルストレーナーで単一細胞懸濁液を取得します。細胞をミリリットルあたり20, 000〜50, 000細胞でフラスコにプレートします。次に、3日ごとに完全な培地交換を行い、これには細胞を1, 300RPMで5分間遠心分離することが含まれます。

仰臥位のResusを廃棄し、PTを新鮮な培地に懸濁し、少なくとも5日後に細胞をフラスコに戻します。NEUROSPHERESを15ミリリットルのチューブ遠心分離機に移し、1, 500 RPMで5分間。supinateを捨てます。

EDTAのトリップでペレットを再懸濁して、単一細胞懸濁液を生成します。細胞数を測定する前に、10, 000個の細胞を含む1ミリリットルの懸濁液を調製します。次に、ガラスからラミニンをしっかりと取り除き、完全に乾かします。

1ミリリットルの細胞懸濁液と交換してください。その後、ディッシュを摂氏37度のインキュベーターに最低4時間置いて、アタッチメントを確保します。細胞が十分に調和したら、培地をチャンバーから取り出します。

ガラスを慎重に取り外します。次に、オートクレーブ22 x 22ミリメートルのガラスカバーをシリコングリースで2 22 x 11ミリメートルのストリップの間に滑り込ませて、セルの上に屋根を形成します。乾燥を避けるために、細胞を数滴の培地で覆うことを忘れないでください。

次に、皿の一方の端からもう一方の端まで走る2つの防水シリコーングリースバリアを作成することにより、チャンバーの両端に分離された媒体リザーバーを形成します。チャンバーに新鮮な媒体を充填し、一方の媒体リザーバーから別の媒体リザーバーへの流れを確保します。その後、細胞の回復を可能にするために、皿をインキュベーターに12時間戻します。

次のステップでは、移動チャンバーの各リザーバーに1つずつ配置された2つの穴を開けて、皿を覆う蓋を準備します。次に、チャンバー内の培地を25ミリメートルのヒッピーバッファーを含む培養培地と交換します。その後、皿を温度制御されたイメージングシステムに移します。

タイムラプスとマルチポジション録画の実験パラメータを設定します。カソードとアノードがそれぞれ左右に来るようにチャンバーを位置合わせして、電界ベクトルが顕微鏡で見てイメージングシステムに記録されるように水平に流れるようにします。次に、2つのビーカーを満たします。

スタインバーグのソリューションで。2%Steinbergの寒天溶液で満たされた事前に準備されたガラスブリッジを使用して、各培地リザーバーに別々のビーカーを接続します。次に、DC電源に接続された銀電極をSteinbergソリューションに配置します。

各ビーカーで、電圧を設定しますtage電源のダイヤルをゼロにして、スイッチを入れます。電圧ダイヤルを上げながら、電圧計でエレクトロタクティクスチャンバー全体の電圧を測定します。次に、実験要件に合わせて電圧を調整します。

その後、タイムラプス録画を開始します。媒体の変更を行い、必要に応じて電圧を再調整します。1時間ごとに、必要に応じて、新鮮で中程度の薬剤または化学薬品をリザーバーに追加できます。

培養皿の蓋に開けられた追加の穴を使用して、各培地リザーバーの上に1つずつ配置します。このステップでは、2週齢のマウスの腰椎を解剖します。次に、解剖顕微鏡下でmachel wane組織チョッパーを使用して、脊髄を500ミクロンの厚さのセクションにスライスします。

スライスを分離し、矢状軸脊髄構造が損なわれていないものを選択します。次に、30マイクロリットルのMAゲルを含む100ミリメートルのシャーレにスライスをプレートします。できるだけ中心に近づけて配置します。

5%二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度に少なくとも30分間維持します。マトリゲルタンパク質が自己組織化するためには、脊髄切片の表面を覆う薄膜を生成するために、マトリゲルが完全に組み立てられていることが非常に重要です。必要に応じて、ペトリ皿を摂氏37度でさらに30分間インキュベートし、次に25ミリモルのハイス緩衝液と15〜20%のウシ胎児血清を含む4〜6ミリリットルのD-M-E-M-F 12培地を追加します。

ミディアムがスライスに直接流れないように非常に穏やかに、スライスが完全にミディアムに沈んでしまわないようにし、ナスの表面を空気に十分にさらしたままにします。媒体は週に2回交換します。次に、神経前駆細胞懸濁液を5マイクロモルフックで培地にインキュベートします。

3、3、3、4、2を30分間。顕微鏡下で、毛細管ガラス管を使用して、脊髄切片に2マイクロリットルの懸濁液をマイクロ注入します。毛細管ガラス管がマトリゲルを通過し、脊髄切片の内側に到達することをゆっくりと確認します。

細胞の懸濁を避けるために、ガラス管を脊髄スライスの内側に少なくとも30秒間保持します。ひっくり返してから、脊髄スライスが入ったシャーレを摂氏37度のインキュベーターに5セントの二酸化炭素を入れて一晩置きます。翌日、脊髄切片の周囲に、500ミリボルト/ミリメートルの電界を印加する前に、3 3 3 4 2標識された神経新生細胞を含む電気戦術チャンバーを構築します。

ここでは、神経前駆細胞は電場にさらされると陰極に向かって高度に指向性のある移動を示し、赤い線と青い矢印はそれぞれ細胞の移動の軌跡と方向を表しています。そして、示されている移行パスのプロットを次に示します。これがフック3、3、3、4、2で標識された神経前駆細胞です。

それらは、電場治療の開始点で器官型脊髄切片に移植されました。神経前駆細胞がカソードに向かって2.5時間方向に移動した後、電界の極性が逆転しました。電界の極性が変化すると、新しいカソードへのaxxisの急激な反転が引き起こされました。

これは、脊髄切片内に移植された神経前駆細胞の画像です。タイムラプス録画の最後に、脊髄切片内に移植された神経前駆細胞の3D再構築がここに示されている。マスマスタリング。

この手法は、開発後に適切に実行されれば、2週間で実行できます。この技術は、細胞生物学の分野の研究者が、2Dおよび3D培養システムにおける神経増殖細胞の移動を探求し、電場に適用するための道を開くものです。