Name: 2Dと3D環境での神経前駆細胞の電界制御監督移行 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-02-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: 学ぶ 神経前駆細胞の電界誘導移行を2D培養と3D脊髄スライスモデルでタイムラプス記録する手法。カソード方向への細胞移動を可視化し、神経発生研究に応用可能です。

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この作品は、BSに王立協会URF助成UF051616、英国、欧州研究評議会STG助成金243261によってサポートされていました。 MZラボでの作業は、再生医療助成RB1-01417のカリフォルニア工科大学でサポートされています。

1。神経前駆細胞の分離<ol><li> E14-16マウスと冷たいDMEM/F12培地の場所から全体の脳を解剖する。 35ミリメートルのペトリ皿に解剖顕微鏡および転送の脳の下にあるすべての髄膜を除去します。 </li><li>機械的に組織の断片に脳を分離し、15 mlのチューブにそれらを転送するために微細な鉗子を使用し、破片を除去するために3分間800rpmでサンプルを遠心します。 </li><li> DMEM/F12含むbFGFおよびEGFを追加し、1 mlのピ​​ペットでひいて粉にする。 </li><li>単一の細胞懸濁液を得るために、セルストレーナーを介して細胞懸濁液を渡します。 </li><li> 2から5×10 4細胞/ mlのフラスコに細胞をプレートしてから、6日毎3日ごとに、通路の細胞を完全培地の変更を実行します。 </li><li>少なくとも5つの継代後、ダイジェストは単一の神経細胞にトリプシンとEDTAを使用してpoly-D-lysine/laminin-coated electrotactic室（2に後述するように調製した）上に成長。 、N2-サプリメントを含む成長培地を使用します。bFGFおよびEGFはすべての回でNPCの特性を維持します。 </li></ol> 2。 electrotactic室の準備<ol><li>ダイヤモンドペンを使用して半分にオートクレーブ処理22×22ミリメートルNo.1の厚さのカバーを割ってガラスの22×11ミリメートルストリップを準備します。 </li><li>接着でよくインテリア寸法22×10 mmの自立ガラスを作成します。一緒に4垂直に高真空用シリコーングリースを持つ22×11ミリメートルストリップを立っている。井戸は完全に一晩乾燥し、硬化することができます。 </li><li>次の日、シリコーングリースを使用して、100 mmの培養皿の底に、10 mmのギャップを残して互いに平行に、2つの22×11 mmのガラス板を取り付けます。センターに最も近いことが三方にグリースを皿の底に取り付けられたそれぞれの端に22×22 mmのカバースリップを配置することにより、これらのストリップとの間の領域、ではなく、を封印。 </li><li>カバー内部の壁はシードのために限られたスペースを作成するように、スリップの上にも、ステップ2.2で調製したガラスを配置しプレートの底に細胞。シリコーングリースの耐水すべての関節。その後順次、ポリ-D-リジンでコートこの狭い領域をラミニン：チャンバー内に1ミリリットルポリ-D-リジンを追加して、ポリ-D-リジンプレートの底にバインドできるようにするために5分間のままに、チャンバを洗う滅菌したPBSで2回、その後20μg/ mlを得、プレートの底をカバーするために使用する滅菌PBSにラミニンを薄める。一晩室温で残す。 </li><li>次の日、収穫細胞と1×104細胞を含む懸濁液1 mlを準備します。それは完全に乾燥空気、細胞懸濁液1ミリリットルに置き換えることができ、よくガラスからラミニンを削除します。添付ファイルを可能にするために4時間の最低37℃インキュベーターで皿を置きます。 </li><li>細胞が十分にコンフルエントになったらチャンバーからすべてのメディアを削除します。慎重によくガラスを削除します。シリコーングリース、オートクレーブ22×22 mmのカバーガラスで、慎重に取り付けることによって、細胞上の屋根を形成する2つの22×11 mmのストリップ間のブリッジ。乾燥を避けるために媒体の数滴を持つ細胞をカバーしています。 </li><li>室の屋根上の皿の一方の端から他に実行する2つの水密性シリコーングリースの障壁を作成することで、チャンバーの各端部に分離された媒体の貯水池を形成します。フロースルー1培地リザーバから他のを確保し、新鮮培地でチャンバーを記入してください。細胞の回復を可能にするために12時間インキュベーターに皿を返します。 </li></ol> 3。 electrotactic室への電界の印加<ol><li>二つの穴は、移行室の各貯水池の上に配置1をドリルで皿を覆うように蓋を準備します。 </li><li> 25mMのHEPES緩衝液を含む培地でチャンバー内にすべての媒体を交換して温度制御された撮像システムに皿を転送します。タイムラプス、マルチポジション記録のための実験パラメータを設定します。陰極と陽極であるように、チャンバーの位置を合わせますそれぞれ左右と上、EFベクトルが実行されるように水平に顕微鏡下に表示およびイメージングシステムに記録されます。 </li><li> Steinberg社のソリューション（58 mM塩化ナトリウム、0.67 mMの塩化カリウム、0.44 mMのカルシウム（NO 3）2·4H 2 0、1.3 mMのMgSO 4を 0.7 H 2 Oおよび4.6 mMのTrizma塩基、pH7.4）で2つのビーカーを記入してください。 2％（W ​​/で満たされた、あらかじめ用意したガラスの橋を（〜13センチ、直径〜3ミリメートルのガラス管と、ブンゼン炎で加熱することによりU字型に曲げ）を使用して、各媒体タンクに別々のビーカーを接続蓋の穴を通過v）のSteinberg's寒天ソリューションを提供しています。 Steinberg社のソリューションの各ビーカーに直流電源に接続されたAg / AgCl電極の電極を配置することによって電気回路を完成させます。 </li><li> 0とに切り替えるには、電源の電圧、ダイヤルを設定します。電圧計を使用して、電圧、ダイヤルを回しながらelectrotactic室の両端の電圧を測定し、実験的な要件に合わせて調整します。 </li><li>タイムラプス録画を開始します。培地交換を行い、時間ごと、必要に応じて、電圧を再調整します。必要に応じて新鮮な培地、薬物または化学物質は、貯水池に追加することができます。培地交換を実行するときに、2つのオプションは以下のように考えることができます。 <ol><li>オプション1番 - 一時的に休止タイムラプス録画をするには、慎重に、カバーの蓋を乱す避けるために、チャンバーからガラスブリッジを削除するには、新鮮な培地にすべての媒体を交換して静かに滅菌パスツールピペットを使用して、ガラスの橋を元に戻し、次に録音を再開します。 </li><li>オプションNo.2は - あるいは、カスタムも培地交換の目的に使用することができる4つの穴（2は、移行室の各貯水池の上に配置）とカバーの蓋を作りました。ガラスのブリッジ接続用の2つ、他の2つのメディアを変更する。オプション2は、培地交換時の干渉を受けずに連続記録することができます。 </li></ol></li></ol> 4。器官脊髄スライスの準備<ol><li>ラム解剖2週齢のC57 BL / 6マウスのAR脊髄。 </li><li>マッキルウェーン組織チョッパで500μmの厚さのセクションに脊髄のスライス。 </li><li>独立した解剖顕微鏡下でスライスはそのまま軸/矢脊髄構造を持つスライスを選択します。 </li><li>マトリゲルのタンパク質が生成するために自己集合するまで、30μlのマトリゲル、それらを配置するを含む35ミリメートルのペトリ皿のプレートスライスはできるだけ中心に近い、少なくとも30分間37℃5％CO 2インキュベーター内で、それらを維持する脊髄スライスの表面を覆う薄膜。それは完全に、別の30分、必要に応じて37℃でペトリ皿をインキュベートマトリゲルが組み立てされていることを確認することが非常に重要です。 </li><li>スライス上に直接メディアフローを回避するために、25mMのHEPES緩衝液と非常に穏やかになるように15から20パーセントのウシ胎児血清を含む4〜6ミリリットルDMEM/F-12培地を追加します。スライスが完全にウェルに露出した外植片の表面を残して、培地中に浸漬されていないことを確認空気。週2回培地を変更します。 </li></ol> 5。器官、脊髄スライスにヘキスト33342というラベルの付いたNPCの注入<ol><li> 1でNPC懸濁液を調製×10 6細胞/μlの。 </li><li> 30分間、5μMHoechst 33342で培地中の細胞懸濁液をプレインキュベートする。 </li><li>顕微鏡下で徐々に脊髄のスライスに懸濁液2μlを顕微注入するキャピラリーガラス管を使用しています。キャピラリーガラス管は、マトリゲル（顕微鏡下でピンク色の部分）を通過し、脊髄スライス（顕微鏡下で灰色の組織）の内部に到達していることを確認し、上で実行する細胞懸濁液を避けるために、少なくとも30秒間、脊髄スライスの内部に残る。インキュベーターに脊髄スライスを含むペトリ皿（37℃、5％CO 2）を入れ、一晩そのままにしておきます。 </li><li>次の日、に記載されているメソッドを使用してelectrotacticチャンバー内のヘキスト33342で標識されたNPCを（含まれている脊髄のスライスには500mV / mmのEFを適用する3）。 </li></ol> 6。代表的な結果 NPCは、彼らが陰極に向かって非常に指示細胞遊走（図1）を示した生理的な排出係数の範囲にさらされたとき。同じ観測はまた器官脊髄スライスを ex vivoモデルの単一細胞レベル、 生体内条件下で模倣し、3D環境（図2）で行われた。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3453/3453fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図1"> 図1。 NPCには、EFSの指示への移行を示しています 。排出係数にさらされたときのPCは陰極に向かって非常に向け移行を示し、赤線と青の矢印は細胞運動の軌跡と方向（）を表しています。 Bは、NPCの移行パスを示しています。バー：50μmである。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3453/3453fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="図2"> 図2。移植されたNPCは器官脊髄スライスのカソードに向け移行を示す

<ol><li>Huttenlocher, A., Horwitz, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound+healing+with+electric+potential%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Wound healing with electric potential.</a> N. Engl. J. Med. 356, 303-303 (2007).</li>
<li>McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+cell+behavior+electrically%3A+current+views+and+future+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Controlling cell behavior electrically: current views and future potential.</a> Physiol. Rev. 85, 943-943 (2005).</li>
<li>Borgens, R. B., Jaffe, L. F., Cohen, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+and+persistent+electrical+currents+enter+the+transected+lamprey+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Large and persistent electrical currents enter the transected lamprey spinal cord.</a> PNAS. 77, 1209-1209 (1980).</li>
<li>Shapiro, S., Borgens, R., Pascuzzi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oscillating+field+stimulation+for+complete+spinal+cord+injury+in+humans%3A+a+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg.+Spine%22%5BJournal%5D)">Oscillating field stimulation for complete spinal cord injury in humans: a phase 1 trial.</a> J. Neurosurg. Spine. 2, 3-3 (2005).</li>
<li>Zhao, M., Song, B., Pu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+signals+control+wound+healing+through+phosphatidylinositol-3-OH+kinase-gamma+and+PTEN%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical signals control wound healing through phosphatidylinositol-3-OH kinase-gamma and PTEN.</a> Nature. 442, 457-457 (2006).</li>
<li>Yao, L., Shanley, L., McCaig, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+applied+electric+fields+guide+migration+of+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Small applied electric fields guide migration of hippocampal neurons.</a> J. Cell. Physiol. 216, 527-527 (2008).</li>
<li>Li, L., El-Hayek, Y. H., Liu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct-current+electrical+field+guides+neuronal+stem%2Fprogenitor+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Direct-current electrical field guides neuronal stem/progenitor cell migration.</a> Stem Cells. 26, 2193-2193 (2008).</li>
<li>Meng, X., Arocena, M., Penninger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K+mediated+electrotaxis+of+embryonic+and+adult+neural+progenitor+cells+in+the+presence+of+growth+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">PI3K mediated electrotaxis of embryonic and adult neural progenitor cells in the presence of growth factors.</a> Exp. Neurol. 227, 210-210 (2011).</li>
<li>Bonnici, B., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+promote+neurite+extension+in+organotypic+spinal+cord+slice%3A+significance+for+cell+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil.+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy.</a> Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).</li>
<li>Shichinohe, H., Kuroda, S., Tsuji, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow+stromal+cells+promote+neurite+extension+in+organotypic+spinal+cord+slice%3A+significance+for+cell+transplantation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil.+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Bone marrow stromal cells promote neurite extension in organotypic spinal cord slice: significance for cell transplantation therapy.</a> Neurorehabil. Neural Repair. 22, 447-447 (2008).</li>
<li>Song, B., Gu, Y., Pu, j <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+direct+current+electric+fields+to+cells+and+tissues+in+vitro+and+modulation+of+wound+electric+field+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo.</a> Nature Protocol. 2, 1479-1479 (2007).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

我々が使用するプロトコルは、以前の研究5,11に基づいています。標準化された寸法精度のカスタム設計electrotacticチャンバー内で培養した細胞またはスライスに、寒天橋、Steinberg社のソリューション、及びAg / AgCl電極電極を介してEFを適用しながら、これらのメソッドを使用して、安定した文化や電流条件を維持することができる。チャンバーの深さが異なるサンプルに対応するために調整することができます11の厚さ、細胞の場合には、室の大きさは、しかし多くの細胞を収容するために変更することができます（例えば、ウェスタンブロット分析は、多くの細胞を必要とする）が必要です。我々は単一細胞レベルでの経時的記録を用いたin vivo で細胞を追跡することは技術的に可能ではありません手続きを可能にするためにこれらのメソッドを変更し、開発してきました。 EFSに対する細胞応答に関する先行研究の大半は、2D環境で実施されています。単一細胞レベルでのNPCのelectrotactic応答の in vivo研究では任意の生理学的関連...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> FGF-基本的な組換えヒト</td><td>インビトロジェン</td><td> PHG0026 </td><td> 20 ng / mLの</td></tr><tr><td> EGF遺伝子組換えヒト</td><td>インビトロジェン</td><td> PHG0311 </td><td> 20 ng / mLの</td></tr><tr><td> N2-サプリメント（100X）液体</td><td>インビトロジェン</td><td> 02048 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12培地（高グルコース） </td><td>インビトロジェン</td><td> 31330-095 </td><td></td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン</td><td>ミリポア</td><td> -003-E </td><td></td></tr><tr><td>ナチュラルマウスラミニン</td><td>インビトロジェン</td><td> 23017-015 </td><td></td></tr><tr><td>成長因子の減少基底膜マトリックス（マトリゲル） </td><td> BDバイオサイエンス</TD&gt; <td> 354230 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES緩衝液</td><td>ギブコ</td><td> 15630 </td><td></td></tr><tr><td>マッキルウェーン組織チョッパー</td><td>ミクル研究所エンジニアリングのCo株式会社</td><td> TC752-PD </td><td></td></tr><tr><td>ダウコーニング高真空用シリコーングリース</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> Z273554 </td><td></td></tr></tbody></table>

2dと3d環境での神経前駆細胞の電界制御監督移行

Electric Field-controlled Directed Migration of Neural Progenitor Cells in 2D and 3D Environments

内因性電界（EFS）は、生体内で自然に発生し、中枢神経系の1,2のことを含め、組織/臓器の開発と再生時に重要な役割を果たしている。これらの内因性排出係数は、細胞や組織の電気抵抗と組み合わせてイオン輸送の細胞調節によって生成されます。それが適用され、EF治療は、動物およびヒトにおける3,4 -脊髄損傷の機能的な修復を促進することが報告されている。特に、EF主導細胞遊走は、神経前駆細胞（NPCに）7,8を含む細胞の種類5,6、多種多様な、で実証されている。直流（DC）排出係数の適用は、ほとんどの研究室で一般的に使用可能なテクニックではありません。我々は以前5,11細胞や組織文化へのDCの排出係数の適用のための詳細なプロトコルを記述している。ここでは2Dを設定するには、計算された電界強度に基づいて、標準的な方法のデモビデオを提示dは3DはNPCのための環境、および2Dの単一細胞の成長条件、および3Dの器官脊髄スライスの両方でEFの刺激に対する細胞応答を調査する。 cytoarchitectonic組織の組織が ​​十分にこれらの培養9,10内に保存されているため、脊髄cordsliceは、移植後、NPC ex vivoでの動作を研究するための理想的な受信者の組織である。さらに、このex vivoでのモデルはまた、単一細胞レベルでの経時的記録を用いたin vivo で細胞を追跡することは技術的に可能ではありません手順をすることができます。それは、2D環境ではないだけでなく、 生体内環境では真似の3D器官の状態で細胞の挙動を評価することが決定的に重要である。このシステムは 、in vitro 及び ex vivo における単一細胞遊走の3Dトラッキングと組織又は器官培養にカバーガラスベースディッシュを用いた高分解能イメージングを可能にし、viで上に移動する前の中間ステップことができますVOのパラダイム。

このプロトコルは、細胞を追跡することができますカスタム設計electrotactic室で2Dと3D環境を確立するために使用されるメソッドを示しています<em&gt;生体/ ex vivoでの</em&gt;直流（DC）電界（EFS）を指示する走電性および他の細胞応答を調べるために、単一細胞レベルでの経時的記録を使用します。

2Dと3D環境での神経前駆細胞の電界制御監督移行

内因性電場（EF）は生体内で自然に発生しており、組織や器官の発達および再生において重要な役割を果たしています。これには、...の再生などが含まれます。

本手順の全体的な目的は、2D培養および3D ex vivoモデルにおける神経前駆細胞の遊走に対する印加電場の影響を記録することです。これは、まずin vitroで神経前駆細胞を単離および増殖させることで達成されます。次のステップは、神経前駆細胞の単一細胞懸濁液を調製することです。次に、2D培養の準備として、神経前駆細胞をカスタム設計の電場チャンバーに播種します。あるいは、3D ex vivoモデルの準備として、神経前駆細胞をhooks 3, 3, 3, 4, 2で標識し、脊髄切片オルガノタイプモデルに注入します。最終的に、電場チャンバーに電場を印加し、タイムラプス recordingを行うことで、2Dおよび3Dの両環境において前駆細胞が電場の陰極に向かって遊走することを示します。この手法の主な利点は、天然の環境に酷似した3D器官模倣モデルへの移植後における、個々の細胞の電界誘導移行をライブトラッキングするための新しい方法を提供することです。この方法は、脊髄切片に移植された神経幹細胞の移行に関する電気的手法の知見を提供できるだけでなく、脳切片モデルなどの他の小規模なシステムにも適用可能です。この手順を開始するには、オートクレーブ済みの22 by 22 millimeterのガラスを分割して、22 by 11 millimeterのストリップを準備します。ダイヤモンドペンを使用して、No.1厚さのカバーガラスを半分に切断します。次に、22 × 11 mmのガラスストリップ4枚を、高真空シリコングリスを用いて垂直に接着し、内寸22 × 10 mmの自立型ガラスウェルを作成します。ウェルをそのまま一晩放置し、完全に乾燥・硬化させてください。翌日、2枚の22 × 11 mmガラスストリップを、10 mmの間隔を空けて平行に配置し、シリコングリスを用いて100 mm培養ディッシュの底面に固定します。次に、シリコングリースを用いて22 by 22 millimeterのカバーガラスを貼り付け、これらのストリップ間の領域を密閉します。カバーガラスの上にガラスウェルを配置し、内壁で細胞を播種するための限定された空間を作成します。すべての接合部をシリコングリースで防水処理します。付随する論文に記載されている通り、この限定領域をポリリシンでコーティングした後、続いてラミニンでコーティングします。この手順では、E 14からE 16のマウスから脳を取り出し、冷やしたD-M-E-M-F 12基礎培地に置きます。次に、解剖顕微鏡下で髄膜を除去します。その後、脳を35 mmのペトリ皿に移します。微細ピンセットを用いて、脳を組織片に分散させます。次に、それらを15 mL遠心チューブに移します。サンプルを800 RPMで3分間遠心分離し、Dのデブリを除去します。次に、BFDFおよびDGFを含むA-D-M-E-M-F 12をサンプルに加えます。1 mLピペットを用いて、それらをトリチュレーション（混和）します。次に、セルストレーナーを用いて単一細胞懸濁液を得ます。細胞を1mLあたり20,000〜50,000個の密度でフラスコに播種します。その後、3日ごとに全量培地交換を行い、その際、細胞を1,300 RPMで5分間遠心分離します。上清を廃棄し、PTを新鮮な培地に懸濁させ、少なくとも5回、6日ごとに細胞をフラスコに戻します。NEUROSPHERESを15 mLチューブに移し、1,500 RPMで5分間遠心分離します。上清を廃棄してください。ペレットをtrypsin-EDTAで再懸濁し、単一細胞懸濁液を作成します。細胞数を測定する前に、10,000個の細胞を含む懸濁液を1 mL調製します。次に、ガラスウェルからラミニンを除去し、完全に乾燥させます。それを1 mLの細胞懸濁液に置換します。その後、細胞を接着させるため、ディッシュを37 °Cのインキュベーターに最低4時間置きます。細胞が十分にコンフルエントになったら、チャンバーから培地を除去します。ガラスを慎重に取り除きます。次に、シリコングリースを用いて、22×11 mmのストリップ2枚の間にオートクレーブ滅菌済みの22×22 mmガラスカバースリップを慎重に取り付け、細胞の上に屋根状の構造を形成します。乾燥を防ぐため、細胞に培地を数滴垂らして覆うことを忘れないでください。次に、ディッシュの一端から他端まで2つの水密性のシリコングリスバリアを作成し、チャンバーの両端に独立した培地リザーバーを形成します。チャンバーに新鮮な培地を満たし、一方の培地リザーバーからもう一方へ流れがあることを確認します。その後、細胞を回復させるため、ディッシュをインキュベーターに戻し、12時間静置します。次のステップでは、移行チャンバーの各リザーバーの上に1つずつ、計2つの穴を開けてディッシュを覆うための蓋を準備します。次に、チャンバー内の培地を25 millimeter hippies bufferを含む培養培地に交換します。その後、ディッシュを温度制御イメージングシステムに転送します。タイムラプスおよびマルチポジション記録の実験パラメータを設定します。顕微鏡での観察時およびイメージングシステムでの記録時に電界ベクトルが水平方向になるよう、カソードが左側、アノードが右側にくるようにチャンバーを配置します。次に、ビーカー2個に溶液を満たします。Steinberg溶液を用いて。あらかじめ2% Steinbergアガロース溶液で満たしたガラスブリッジを使用し、各培地リザーバーに個別のビーカーを接続します。次に、直流電源に接続された銀電極をSteinberg溶液の中に配置します。各ビーカーにおいて、電源の電圧ダイヤルをゼロに設定し、スイッチを入れます。電圧ダイヤルを回しながら、電圧計で電極室の両端の電圧を測定します。その後、実験要件に合わせて電圧を調整してください。その後、タイムラプス撮影を開始します。培地交換を行い、必要に応じて電圧を再調整してください。1時間ごとに、必要に応じて新鮮な培地、薬剤、または化学剤をリザーバーに追加してください。培地リザーバーのそれぞれの上に配置されるよう、培養皿の蓋に追加の穴を開けて使用します。このステップでは、生後2週齢のマウスの腰髄を摘出します。次に、解剖顕微鏡下でMachel-Wane組織チョッパーを用い、脊髄を500 micron厚の切片にスライスします。スライスを分離し、矢状面の軸方向の脊髄構造が維持されているものを選択します。次に、30 µLのMAゲルを入れた100 mmペトリ皿にスライスを配置します。できるだけ中心に近い位置に配置してください。それらを5%二酸化炭素インキュベーターにて37°Cで少なくとも30分間保持します。Matrigelタンパク質が自己集合して脊髄スライス表面を覆う薄膜を形成するためには、Matrigelが完全に集合していることが非常に重要です。必要に応じてシャーレを37°Cでさらに30分間インキュベートし、その後、25 mM HEPESバッファーおよび15～20%胎児牛血清を含むDMEM/F12培地を4～6 mL添加します。培地がスライスに直接流れるのを避けるため、非常に慎重に、スライスが培地に完全に浸からないようにし、ナスの表面が十分に空気に触れる状態にします。培地は週に2回交換してください。次に、神経前駆細胞懸濁液を5 µMのhooksを含む培地中でインキュベートします。30分間、3, 3, 3, 4, 2で保持します。顕微鏡下で、キャピラリーガラス管を用いて、懸濁液2 µLを脊髄スライスにマイクロインジェクションします。キャピラリーガラス管がMatrigelを通過し、脊髄スライスの内部に到達していることを慎重に確認してください。細胞の懸濁を防ぐため、ガラス管を脊髄スライス内に少なくとも 30 seconds 間保持します。その後、脊髄スライスを入れた Petri dish を 37 °C、5 % CO2 のインキュベーターに入れ、一晩培養します。翌日、脊髄スライスの周囲に電場形成チャンバーを構築し、500 mV/mm の電場を印加する前に、ラベル付けされた neurogenesis cells 3 3 3 4 2 フックを配置します。ここでは、電界にさらされた際に神経前駆細胞が陰極に向かって高度に指向性のある移動を示す様子が示されています。赤線は細胞移動の軌跡を、青い矢印は移動方向をそれぞれ表しています。また、こちらに移動経路のプロットを示します。ここでは、フック 3 3、3、4 2 でラベル付けされた神経前駆細胞を示しています。これらを、電場処理の開始時点で、器官培養脊髄スライスに移植しました。神経前駆細胞が陰極に向かって2.5時間方向性遊走した後、電場の極性を反転させました。電場の極性を変更することで、新しい陰極に向かって軸索の急激な方向転換が引き起こされました。脊髄スライス内に移植された神経前駆細胞の画像がこちらです。タイムラプス記録の終了時における、脊髄スライス内での移植神経前駆細胞の3D再構成図がここに示されています。Mass mastered。適切に開発された後であれば、この手法は2週間で完了させることができます。本手法により、細胞生物学分野の研究者が、電場への応答に対する2Dおよび3D培養システムにおける神経前駆細胞の遊走を探索し、応用することが可能になります。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

我々は、上皮成長因子受容体（EGFR）の過剰発現は、小説アガロースゲルベースの​​マイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞（NSC）の運動性を高めることを示している。この技術は、ヒト神経幹細胞などの細胞源が不足している他の哺乳動物細胞系、に容易に適応することができ、時間のターンアラウンドが重要です。...

アガロースゲルベースの​​マイクロ流体デバイスを用いた神経幹細胞運動の評価

このプロトコルでは、走電性の間に神経前駆細胞の転座に由来する成体脳のタイムラプスイメージングを可能にするために直流電界を印加することを許可するカスタムチャンバーを構築する方法を示します。...

外部から印加された直流電界における神経前駆細胞の移行動態の解析のための走電性アッセイ

このビデオは、細胞外マトリックスでコーティングされたマイクロ流体チップを使用して、電気刺激を通じて神経幹細胞と前駆細胞またはNPCを区別する方法を示しています。コーティングされた領域に播種して付着した後、NPCは成長し、直流を印加するとニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトへの分化が引き起こされます。...

電気刺激による神経幹細胞と前駆細胞の分化

我々は、様々な成長因子の存在下での腸溶神経堤細胞の遊走電位の正確な定量を可能にex vivoで細胞遊走アッセイを提示する。...

マウス腸の神経前駆細胞の定量細胞遊走アッセイ

神経芽細胞の遊走は、出生後の神経新生に重要なステップです。プロトコルは、ここに記載DNA /低分子ヘアピンRNA（shRNAは）ヌクレオおよびげっ歯類生後吻側遊走性流から単離された神経芽細胞を用いた3次元遊走アッセイを用いることにより、神経芽細胞遊走の候補調節因子の役割を調査するために使用することができる。...

神経芽細胞の移行を検討するために、げっ歯類神経芽細胞のクレオ<em&gt;インビトロ</em

私たちは、特注のガルバノタキシスチャンバー内で移動し、不死化された前立腺細胞に生理的な電場を適用する方法を提示します。この方法を使用して、2つの系統の非腫瘍形成性前立腺細胞が、フィールド内で異なる程度の移動方向性を示すことを示します。...

前立腺細胞の方向性のある移動を研究するためにカスタム設計された電気走チェンバースを利用

上皮から間葉への移行(EMT)は、癌が浸潤性になることを可能にします。EMTを調査するために、血清と酵素を欠いた神経幹細胞(NSC)ベースのinvitroモデルが記載されています。この標準化されたシステムにより、細胞遊走、遺伝子およびタンパク質発現の定量的および定性的な評価が可能になります。創薬に適したモデルです。...

創薬に適していEMT調査のための酵素および無血清神経幹細胞培養モデル

縦一直線に並べられたアストロ...

三次元組織配置に発達メカニズムを要約し、神経系の再生を容易にするアストロ サイト ネットワーク

本研究では、マイクロ流体系における直流(DC)パルス刺激によってのみ誘導される神経幹および前駆細胞(NPC)の分化に関するプロトコルを提示する。...

マイクロ流体デバイスにおける電界誘発神経前駆細胞分化

大脳皮質の発達中、ニューロンとグリア細胞は、心室の内側を覆う心室ゾーンで発生し、脳表面に向かって移動します。このプロセスには多くの遺伝子が関与しています。このプロトコルでは、移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージングの技術を紹介します。...

マウス胚脳切片における移動するニューロンとグリア前駆細胞のタイムラプスイメージング

学ぶ 神経前駆細胞の電界誘導移行を2D培養と3D脊髄スライスモデルでタイムラプス記録する手法。カソード方向への細胞移動を可視化し、神経発生研究に応用可能です。

2Dと3D環境での神経前駆細胞の電界制御監督移行

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