タイムラプスビデオ顕微鏡を用いた細胞のランダムな移行の定量分析

次の実験の全体的な目標は、ビデオタイムラプス顕微鏡を使用して、細胞の移動をリアルタイムで定量的に測定することです。これは、最初に6ウェル培養プレートをコラーゲンでコーティングし、次に目的の細胞をコーティングしたプレートにまばらに播種することによって達成されます。第2ステップとして、ピペットチップを使用してプレートに傷を作り、移行のための十分なスペースを確保します。

次に、顕微鏡をセットアップし、温度制御システムを使用して一定の間隔で画像をキャプチャすることで、移動する細胞をリアルタイムで連続的に監視できます。最終的に、粒子追跡プロトコルは、テスト細胞と制御細胞の平均速度と総変位の違いを評価するために使用されます。この手法の主な利点は、回避型チャンバー移動アッセイのような既存の方法よりも優れている点は、エンドポイントの定量的移動測定に基づいていないことです。

代わりに、さまざまなパラメータを継続的に監視および計算できます。この方法は、特定の遺伝子や薬物が腫瘍細胞の移動にどのように影響するかなど、がん生物学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。処置の2日前に、Opti培地で希釈した1.5ミリリットルのコラーゲンを6ウェル培養プレートの各ウェルに加え、処置の1日前にプレートを摂氏4度で一晩インキュベートします。

目的の細胞をウェルあたり2ミリリットルのDMEMとFBSに再懸濁し、細胞をコラーゲンENCコーティングプレートの各ウェルに移し、細胞を摂氏37度で一晩インキュベートします。施術当日。ピペットチップを使用して一晩培養した細胞に傷を付け、それぞれをPBSでよく洗浄して、傷の結果として形成された破片を取り除きます。

すすぎたウェルにDMEMとFBSを添加し、顕微鏡できれいな創傷空間ができたことを確認します。顕微鏡カメラと生細胞イメージング装置の電源を入れた後、プレートを顕微鏡ステージの上に置きます。新しいライブセル環境制御チャンバーでプレートを覆い、サーモスタットを摂氏37度に、二酸化炭素を5%に設定しますメニューバーでスライドブックソフトウェアを開きます。

フォーカスコントロールを選択するには、円のボタン内のFをクリックします。対物レンズボックスで、ドロップダウンウィンドウを使用して対物レンズを定義しますフィルターセットボックスで、光路をIピースに向ける設定を選択します。Bright Field Illumination(明視野照明)に適切なフィルターを選択し、[Open Bright(ブライトを開く)]をクリックします。

を開けて、明視野シャッターを開けます。次に、タレットの明視野フィルターを選択し、接眼レンズを通してサンプルを表示して、適切なフィールドを見つけ、サンプルに焦点を合わせます。次に、フィルタータレットを動かしてカメラへの光路を変更します スライドブックソフトウェアで画像キャプチャを行うには、フォーカスコントロールをクリックしてXYを選択し、Iピースを介してさまざまな位置を選択し、次にセットポイントをクリックして各位置にロックします。

画像キャプチャの場合は、画面に表示されるカメラ画像のフォーカスを手動で微調整し、フォーカスコントロールウィンドウのツールを使用してステージのZ位置を調整します。最良の結果を得るには、プレートとの接触部近くの平らな細胞突起に焦点を合わせて、ピント合わせを補助します。スライダーを使用して、ピントを合わせるのに適した範囲に露出時間を調整します。

複数のXY位置が選択されている場合は、フォーカスコントロールを選択して、個々の位置ごとにフォーカスを調整します。次に xy、次に訪問ポイント。スライドブックで、メニューバーからカメラのグラフィックを選択し、キャプチャタイプを選択し、タイムラプスを選択して実験の時間の長さを選択します。

ドロップダウンメニューから、1つの時点の開始から次の時点の開始までの希望の遅延を入力します。インターバルフィールドでは、手動で入力した値から3番目のフィールドが自動的に計算されます。「Multiple XY capture」で、複数の XY 位置を持つ実験の「Multi-Point List」を選択します。

最後に、ファイルを保存するファイルに名前を付け、キャプチャ制御に移動して[詳細設定]、[スプール]の順に選択します。次に、メモリにキャプチャし、各時点の後にスプールファイルに保存します。まず、画像をクリックしてください。

スライドブックのメニューバーで、ドロップダウンメニューから[インポート]を選択し、[スライドブックスプール]をクリックします。移行実験から生成された、さまざまなフィールドと時点の目的のスライドブック ファイルを選択します。最初のファイルを開き、メニューバーでマスクを選択し、ドロップダウンメニューからパーティクルトラッキングプロトコルを選択します。

パーティクルトラッキングメニューで、手動パーティクルトラッキングプロトコルを選択します。開始時刻と終了時刻を示すウィンドウが表示されます ランダムマイグレーションを分析するには、マスクを選択し、次に粒子追跡プロトコルを選択します。ここでも、オブジェクトの中心の座標を決定するには、領域の中心を選択します。

次に、[追跡して続行]をクリックします。次に、変位や平均速度など、各パスに必要な統計を選択します。次に示すように、[計算] をクリックして統計を表示します。

このボックスには、速度の観点から定量化されたランダム移行分析の例が示されています。ウィスカーズグラフでは、この実験では、腫瘍抑制遺伝子をノックダウンしたM-D-A-M-B 2 31細胞で平均速度の増加が見られました。ここでの対照M-D-A-M-B 2 31細胞と比較して、最初の図からの細胞のランダム移動を細胞変位の観点から分析した。

ここでも、全腫瘍抑制遺伝子ノックダウン群は、対照のM-D-A-M-B 2 31と比較して細胞置換が増加した。この時間経過ビデオ顕微鏡動画制御で細胞をMDA MB2 31細胞にコラーゲン上に一晩座らせた。その後、画像は 1 時間間隔で、ランダム移行中に合計 18 時間撮影されました。

セルが時間の経過とともに元の位置から離れる様子に注意してください。この動画では、コラーゲンに一晩播種した後の試験M-D-A-M-B 2 31細胞の移動を記録し、分析しました。テストセルは、前のムービーのコントロールセルと比較して移動性が高いことに注意してください。

この手順に続いて、細胞浸潤やダイナなどの他の方法を実行して、次のような追加の質問に答えることができます 癌転移における細胞の役割は何ですか その開発後?この技術は、細胞生物学の分野の研究者が単離されたがん細胞株を使用して細胞遊走を研究する道を開きました。