Name: タイムラプスビデオ顕微鏡を用いた細胞のランダムな移行の定量分析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 学ぶタイムラプス顕微鏡を用いた細胞のランダム移動の定量分析法。コラーゲンコート培養板で傷創を作り、リアルタイムで細胞の平均速度と変位を連続測定し、がん細胞の動態を評価する。

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著者らは、実験と初期支援するアマンダStruckhoffに感謝します。この作品は、NIH 5RO1CA115706からの助成金によってサポートされていました。

<ol><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+a+physically+integrated+molecular+process%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84, 359-369 (1996).</li>
<li>Ridley, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+migration%3A+integrating+signals+from+front+to+back%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell migration: integrating signals from front to back.</a> Science. 302, 1704-1709 (2003).</li>
<li>Petrie, R. J., Doyle, A. D., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Random+versus+directionally+persistent+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Random versus directionally persistent cell migration.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 538-549 (2009).</li>
<li>Valone, F. H., Austen, K. F., Goetzl, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+random+migration+of+human+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Modulation of the random migration of human platelets.</a> J. Clin. Invest. 54, 1100-1106 (1974).</li>
<li>Biehlmaier, O., Hehl, J., Csucs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquisition+speed+comparison+of+microscope+software+programs%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc.+Res.+Tech%22%5BJournal%5D)">Acquisition speed comparison of microscope software programs.</a> Microsc. Res. Tech. 74, 539-545 (2011).</li>
<li>Struckhoff, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+ROCK+in+tumor+cells+controls+CXCR4-driven+adhesion+events%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of ROCK in tumor cells controls CXCR4-driven adhesion events.</a> J. Cell. Sci. 123, 401-412 (2010).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophoton.+Internat%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophoton. Internat. 11, 36-42 (2004).</li>
<li>Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Tyl Hewitt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+collagen+and+fibronectin+in+neural+crest+cell+adhesion+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration.</a> Dev. Biol. 87, 259-266 (1981).</li>
<li>Albini, A., Sporn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumour+microenvironment+as+a+target+for+chemoprevention%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">The tumour microenvironment as a target for chemoprevention.</a> Nat. Rev. Cancer. 7, 139-147 (2007).</li>
<li>Yu, Y. P., Luo, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myopodin-mediated+suppression+of+prostate+cancer+cell+migration+involves+interaction+with+zyxin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer.+Res%22%5BJournal%5D)">Myopodin-mediated suppression of prostate cancer cell migration involves interaction with zyxin.</a> Cancer. Res. 66, 7414-7419 (2006).</li>
<li>Teng, T. S., Lin, B., Manser, E., Ng, D. C., Cao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stat3+promotes+directional+cell+migration+by+regulating+Rac1+activity+via+its+activator+betaPIX%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Stat3 promotes directional cell migration by regulating Rac1 activity via its activator betaPIX.</a> J. Cell. Sci. 122, 4150-4159 (2009).</li>
<li>Wozniak, M. A., Kwong, L., Chodniewicz, D., Klemke, R. L., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-Ras+controls+membrane+protrusion+and+cell+migration+through+the+spatial+regulation+of+Rac+and+Rho%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Biol.+Cell%22%5BJournal%5D)">R-Ras controls membrane protrusion and cell migration through the spatial regulation of Rac and Rho.</a> Mol. Biol. Cell. 16, 84-96 (2005).</li>
<li>Orr, A. W., Elzie, C. A., Kucik, D. F., Murphy-Ullrich, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombospondin+signaling+through+the+calreticulin%2FLDL+receptor-related+protein+co-complex+stimulates+random+and+directed+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Thrombospondin signaling through the calreticulin/LDL receptor-related protein co-complex stimulates random and directed cell migration.</a> J. Cell Sci. 116, 2917-2927 (2003).</li>
<li>Smith, A., Bracke, M., Leitinger, B., Porter, J. C., Hogg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LFA-1-induced+T+cell+migration+on+ICAM-1+involves+regulation+of+MLCK-mediated+attachment+and+ROCK-dependent+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">LFA-1-induced T cell migration on ICAM-1 involves regulation of MLCK-mediated attachment and ROCK-dependent detachment.</a> J. Cell Sci. 116, 3123-3133 (2003).</li>
</ol>

我々は、開示することは何もありません。

リアルタイムランダム遊走アッセイは、速度や変位などの細胞遊走パラメータを正確に、機密性の高い、分析を可能にします。このメソッドは、より定量的であるので、ポイントの測定値を終了するには、制限されていません。ので、細胞は血清を正常DMEM培地で監視され、それは無血清培地におけるより長いインキュベーションの悪影響を減らすことができます。それは細胞の遊走は、書式設定、したがって、このメソッドは、移行上の異なる基質の効果を検討するために使用することができる基層8でセルの連絡先を壊すに依存していることが示されている。 重要なステップの一つは、最適な移行を確保するため、37 5％℃、CO 2の温度を適切にコントロールが含まれます。アッセイは、希望する時点で渡り鳥の応答を監視するための柔軟性を可能にしますが、それは時間点の数を最適化することが必要な場合があります。たとえば、低い移行率を有するいくつかの細胞は、LOのために監視する必要がある場合がありますnger時間は、より高い移動率を有する細胞と比較されます。 <p class="jove_con...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント </td></tr><tr><td> DMEM </td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td> SH30243.01 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td>ジェミニバイオ製品</td><td> 100から106 </td><td></td></tr><tr><td> OPTI-MEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 31985-070 </td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン</td><td> BD </td><td> 354231 </td><td></td></tr><tr><td>ライブセル室＆自動XYステージコントローラを搭載した顕微鏡</td><td>オリンポス</td><td>オリンパス1X81 </td><td></td></tr><tr><td>環境制御室</td><td>ノイエ</td><td>ノイエ·ライブセル室</td><td>我々は、チャンバの上部を介して、適切な光学系のカスタム構築された長方形のガラス板の上を持っています。長方形の形状は、私たちのexperimenの多くで使用されるマルチウェルプレートに対応TS。 </td></tr><tr><td>自動XYステージ</td><td>前の</td><td>前のPROSCAN </td><td>これは、正確なリターンが時間経過顕微鏡時に選択したXY位置を乗算することができます。 </td></tr><tr><td>カメラ</td><td></td><td>浜松EMカメラC9100 </td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td>典型的には、このようなオリンパス顕微鏡などのベンダーから購入し</td><td>スライドブック5 </td><td></td></tr></tbody></table>

タイムラプスビデオ顕微鏡を用いた細胞のランダムな移行の定量分析

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

細胞遊走は、胚発生、組織修復、免疫システムの機能、および腫瘍浸潤1、2のために重要である動的なプロセスです。双方向の移行時に、細胞は細胞外の走化信号に応答して、基本的な運動機構が提供する本質的な手がかり3に対応して急速に移動します。細胞は、細胞が自分のローカル環境を探索することができ、低い固有の方向性を持っているときに、ランダムな移行が行われる。 細胞遊走は、初期応答セルに、複雑なプロセスである偏光を受けると移行2の方向に突起を拡張します。そのようなBoydenチャンバー遊走アッセイなどの移行を測定する従来の方法は、エンドポイントの結果としての移行を測定することができ体外で走化性を測定する簡単な方法です。しかし、このアプローチはどちらも個別の移行パラメータの測定を可能にしない。また、映像設備を許可しないセル移行時に受けることが形態学的変化のlization。 時間経過顕微鏡 - ここでは、私たちはビデオを使ってリアルタイムで移行する細胞を監視することができます方法を提示する。細胞の遊走および浸潤癌の特徴であるため、このメソッドは 、in vitro で癌細胞の遊走および浸潤を研究する上で適用されるものとします。血小板のランダムな移行は血小板機能4のパラメータの一つとして考えられてきた。したがって、このメソッドはまた、血小板の機能を勉強するのに役立つかもしれません。このアッセイは迅速で、信頼性、再現性という利点を有しており、細胞数の最適化を必要としません。セルのための生理学的に適切な条件を維持するために、顕微鏡はCO 2の供給と温度サーモスタットが装備されています。細胞運動は、定期的に顕微鏡に取り付けたカメラを使用して写真を撮ることによって監視されています。細胞遊走は、平均速度と測定することによって計算することができます。Slidebookソフトウェアによって計算されますverage変位、。

このメソッドは、実時間、速度、変位、速度など、さまざまな細胞への移行パラメータの定量的測定の細胞のモニタリングが可能になります。従来の方法とは異なり、このリアルタイムのアプローチは、エンドポイントの定量的な移行の測定値に基づいてされていません。代わりに監視し、継続的にさまざまなパラメータを計算することができます。

細胞遊走はダイナミックなプロセスであり、胚発生、組織修復、免疫系の機能、および腫瘍浸潤において重要である 1, 2。...の間、

本実験の全体的な目的は、ビデオタイムラプス顕微鏡を用いて、細胞の遊走をリアルタイムで定量的に測定することです。まず、6ウェル培養プレートにコラーゲンをコーティングし、そこに目的の細胞を低密度で播種します。次に、ピペットチップを用いてプレート上に傷（ウィンドウ）を作成し、細胞が遊走するための十分なスペースを確保します。次に、顕微鏡をセットアップし、温度制御システムを用いて一定の間隔で画像をキャプチャすることで、遊走する細胞をリアルタイムで継続的にモニタリングします。最終的に、パーティクルトラッキングプロトコルを用いて、試験群と対照群の細胞における平均速度と総変位の差を評価します。回避チャンバー遊走アッセイのような既存の手法に対する本手法の主な利点は、エンドポイントの定量的な遊走測定に基づかないことです。その代わりに、さまざまなパラメータを継続的にモニタリングし、算出することが可能になります。この手法は、特定の遺伝子や薬剤が腫瘍細胞の遊走にどのように影響するかなど、がん生物学分野における重要な疑問を解決するのに役立ちます。処置の2日前に、Opti-MEMで希釈したコラーゲン1.5 millilitersを6ウェル培養プレートの各ウェルに加え、処置の前日にプレートを4 °Cで一晩インキュベートします。目的の細胞を、ウェルあたり2 mLのFBS添加DMEMに再懸濁し、コラーゲンENCコートプレートの各ウェルに播種して、37°Cで一晩インキュベートします。処置当日、ピペットチップを用いて一晩培養した細胞に傷（創傷）を作り、PBSで各ウェルを洗浄して、傷によって生じた細胞片を除去します。洗浄済みのウェルにFBS添加DMEMを加え、顕微鏡下で清浄な創傷領域が形成されていることを確認します。顕微鏡カメラとライブセルイメージング装置の電源を入れ、プレートを顕微鏡ステージ上に配置します。プレートを新しいライブセル環境制御チャンバーで覆い、温度設定を37 °C、二酸化炭素濃度を5%に設定します。次に、メニューバーからスライドブックソフトウェアを開きます。円の中にFと書かれたボタンをクリックして、フォーカス制御を選択します。対物レンズボックスのドロップダウンウィンドウを使用して、対物レンズを指定します。フィルターセットボックスで、光路をIピースに向ける設定を選択します。明視野照明に適したフィルターを選択し、「Bright」を開きます。明視野シャッターを開きます。次に、ターレットで明視野フィルターを選択し、接眼レンズを通してサンプルを観察して、適切な視野を探し、サンプルに焦点を合わせます。その後、フィルターターレットを移動させて、光路をカメラに切り替えます。Slidebookソフトウェアで画像をキャプチャするには、[focus control]をクリックし、[XY]を選択して接眼レンズを通して異なる位置を選択し、[set point]をクリックして各位置を固定します。画像キャプチャを行う際は、画面上のカメラ画像を参考に手動でフォーカスを微調整し、次にフォーカスコントロールウィンドウのツールを使用してステージのZ位置を調整します。最適な結果を得るには、フォーカス合わせを容易にするため、プレートとの接点付近にある平坦な細胞突起に焦点を合わせてください。スライダーを使用して、フォーカス合わせに適した範囲に露光時間を調整します。複数のXY座標を選択した場合は、フォーカス制御を選択して各座標のフォーカスを調整します。次にXYを選択し、その後、ビジットポイントを選択します。Slidebookのメニューバーからカメラのアイコンを選択し、キャプチャタイプを選択してから、タイムラプスを選択して実験時間を設定します。ドロップダウンメニューから、あるタイムポイントの開始から次のタイムポイントの開始までの希望する遅延時間を入力します。インターバルフィールドでは、手動で入力された値に基づいて3番目のフィールドが自動的に計算されます。「multiple XY capture」の下で、XY位置が複数ある実験の場合は「multi-point list」を選択してください。最後に、保存するファイルに名前を付け、「capture control」に移動して「advanced」を選択し、「spool」を選択します。その後、各タイムポイントごとに「capture to memory」を行い、「save to spool file」で保存してください。まず、imageをクリックして開始します。スライドブックのメニューバーで、ドロップダウンメニューから「import」を選択し、「slide book spool」をクリックします。さまざまな領域およびタイムポイントの移行実験から生成された、目的のスライドブックファイルを選択します。最初のファイルを開き、メニューバーで「mask」を選択して、ドロップダウンメニューから「particle tracking protocol」を選択します。パーティクルトラッキングメニューから、「manual particle tracking protocol」を選択します。開始時間と終了時間を指定するウィンドウが表示されます。ランダム移動を解析するには、「mask」を選択し、次に「particle tracking protocol」を選択してください。さらに、オブジェクトの中心座標を決定するために、「center of area」を選択します。次に、「track」をクリックして続行します。ここで、変位や平均速度など、各パスについて必要な統計項目を選択します。ここに示すように、「calculate」をクリックして統計結果を表示します。速度として定量化したランダム移行解析の例をこのボックスに示します。ウィスカー図において、本実験では、腫瘍抑制遺伝子をノックダウンしたM-D-A-M-B 2 31細胞で平均速度の上昇が見られました。ここでの対照群であるM-D-A-M-B 2 31細胞と比較して、最初の図の細胞のランダム移行を細胞変位の観点から解析しました。改めて、全腫瘍抑制遺伝子ノックダウン群では、対照群のM-D-A-M-B 2 31と比較して細胞変位が増加していました。このタイムラプスビデオ顕微鏡動画では、対照群のMDA MB 2 31細胞をコラーゲン上に一晩播種しました。その後、ランダムな遊走中の画像を1時間間隔で計18時間撮影しました。時間の経過とともに、細胞が元の位置から離れて移動していく様子に注目してください。この動画では、コラーゲン上に一晩播種した後のテストM-D-A-M-B 2 31細胞の遊走を記録し、解析しています。前の動画のコントロール細胞と比較して、テスト細胞はより遊走性が高いことに留意してください。この手順に続き、細胞浸潤やdynasなどの他の手法を行うことで、がん転移の発生後における細胞の役割は何かといった追加の疑問を解明することができます。この技術は、細胞生物学分野の研究者が、単離したがん細胞株を用いて細胞遊走を探索するための道を開きました。

quantitative-analysis-random-migration-cells-using-time-lapse-video

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

一次元閉じ込められた微小環境における細胞の自発的な遊走を研究するための定量的方法が記載されている。この方法は、微細加工されたチャネルを利用し、単一の実験では、異なる条件下で多数の細胞の遊走を研​​究するために使用することができる。...

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レンズ無料のビデオ顕微鏡、付着性細胞培養の定量的解析

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