Name: 運動ニューロンにマウス胚性幹細胞の効率的な分化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 学ぼう、マウス胚性幹細胞から運動ニューロンへの効率的な分化プロトコル。この方法は神経系マーカー発現を用いて確認され、運動ニューロン疾患や脊髄性筋萎縮症の研究に応用可能です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この原稿は2011年5月26日に亡くなった博士Wenlan王の記憶に捧げられています。我々は寛大に本研究で用いたHBG3 MES細胞を提供するために博士はダグラスA.カーに感謝します。この作品は、ヌムールによって資金を供給され、研究資源のナショナルセンター（NCRR）、およびセンターをサポートするNCRRからCOBRE助成賞（5 P20 RR020173-05）のINBREプログラムの下で助成金（2 RR016472-10）子供たちは、ウィルミントン、デラウェア州、アメリカ合衆国のためにアルフレッドI.デュポン病院で小児研究。

1。ステップ1：マウス胚性幹（MES）細胞培養（タイミング：3日間） 1。めっきの主マウス胎児線維芽細胞（PMEF） <ol><li> PMEF接着のためにゼラチンでコート4 100 mmの組織培養皿。各ディッシュに0.1％ゼラチン溶液（StemCell Technologies）を8 mlを加え、室温で30分間インキュベートする。 </li><li>料理からゼラチンの過剰を削除します。お皿を洗わない。 </li><li>約が含まれているマイトマイシンC不活化PMEF（ミリポア社製）1バイアルに希釈する。 5×10 6 PMEFメディアの40ミリリットルに細胞（ 表1のレシピを参照）および4 100 mmの組織培養皿上にプレート。 PMEFは、MES細胞のフィーダー層を提供しています。 </li><li> PMEFは、MESの細胞培養を追加する前に、少なくとも一日に播種する必要があります。 PMEFは、めっき後1週間まで使用することができます。 </li></ol> 2。メッキMES細胞運動ニューロンにMES細胞の分化の効率を監視するには、我々はHBG3、運動ニューロン特異的プロモーターの制御下Hb9 eGFPを発現するトランスジェニックマウス由来のES細胞株を使用していました。 <ol><li>霜37℃の水浴でHBG3 MES細胞の1バイアル（約1×10 7、博士ダグラスカー、ジョンズ·ホプキンス大学によって寄贈されました）。 15 mlのチューブにES培地（ 表1に示すレシピを参照してください）5 mlを加え、5分間800rpmで細胞をスピンダウンする。 </li><li>は10 ng / mlの最終濃度で新しく追加された白血病抑制因子（LIF）とESのメディアを20mlの上清を吸引し、再懸濁しMES細胞。注：LIFは、使用日に追加されるべきであり、未分化状態のMES細胞を維持する必要があります。 </li><li>各皿にPMEFから10ミリリットルPMEFメディアを取り出して、それぞれの皿にHBG3 ES細胞懸濁液10mlを追加します。 </li><li>メッキ後24時間は、MESの細胞は、サイズが図1Bに矢印で示されたコロニーに似た小さなコロニーを形成しています。メッキ後72時間、コローニサイズのESの増加は、多くは直径が約100μm（ 図1B、矢印で示される）である。これらの細胞は、分化のための準備が整いました。メディアは、細胞の増殖を維持するために、毎日交換する必要があります。 </li></ol> 2。ステップ2：神経誘導（タイミング：2日間） 運動ニューロンにMES細胞の分化を誘導するために、MES細胞はPMEFから分離し、懸濁液の環境で栽培する必要があります。ゼラチンコートしたフラスコをMES細胞からPMEFを区切るために使用されています。 <ol><li> MESのコロニーは、神経誘導（分化0日として定義される）、室温で30分間0.1％ゼラチン（18ミリリットル/フラスコ）でコート2 T150フラスコの準備ができていると、余分なゼラチンを削除し、1X PBSで三回洗浄するとき。注：各100mmディッシュの文化はPMEFを分離する1つのT150-ゼラチンコートしたフラスコが必要になります。 </li><li>慎重に緩く接続されたコロニーを取り除くために、ないことを確認し、吸引して、メディアを削除します。 10ミリリットルのPBSを簡単に追加LYし、洗浄ステップを完了するために吸引して除去します。 </li><li> PMEFからMES細胞を分離するために、トリプシン/ EDTA（3ミリリットル/皿、StemCell Technologies）を0.25％を追加して、プレートからの幹細胞とPMEFデタッチされるまで37℃で3〜5分間インキュベートする。コロニー（約15-20倍）を破るには、上下LIFおよびピペット細胞なしで15ミリリットル新鮮なESのメディアを追加します。その後、0.1％ゼラチンでコーティングされたT150フラスコに追加して、37℃で30分間インキュベート℃、 ES細胞は、フローティングでなければなりませんしながらインキュベートした後、PMEFはゼラチン表面に添付しなければなりません。 50 mlチューブに浮遊MES細胞を収集します。 </li><li> （ 表1のレシピを参照してください）神経分化培地の10ml中に800回転と再懸濁した細胞でスピンダウンする。 </li><li>血球計算板を用いて細胞数をカウントし、プレート100 mmの細菌または懸濁液を培養皿の上に約2×10 6 MES細胞。これらのプレートは、懸濁培養の成長を許可し、胚様体（EBS）の形成を推進しています。 </li><li>差異にる1日目は、MESの細胞は光学顕微鏡下に表示されている小さな浮遊凝集体（EBS）を形成する。任意のキャリーPMEFは皿に添付してください。 3分間低速（500 rpm）で15 mlのチューブと遠心分離機に懸濁細胞とメディアを転送します。慎重に培地を吸引除去する、新たな細菌の皿にプレートの細胞をペレット化しEBSに新鮮な神経分化培地10mlを追加し、。メディアの補充に加えて、このステップは、前のステップから引き継がれ、任意のPMEFを削除します。 </li><li>分化2日目に、EBは運動ニューロンに誘発される準備が整いました。 </li></ol> 3。ステップ3：運動ニューロン仕様（タイミング：5日間） <ol><li>分化2日目、スワール培養皿上で、15 mlチューブにメディアとEBSを転送します。 EBを重力（〜10分）または3分間低速（500 rpm）で遠心分離によって沈殿しましょう​​。 </li><li> （レシピを参照してくださいにおける運動ニューロンの分化の10ミリリットル（MND）培地で注意深く再懸濁したEB培​​地を吸引<strong&gt;表1）。プレートのEB新しい細菌の皿の中で、5日間毎日メディアを変更します。 </li><li>直径200μmの強力なGFPシグナル（ 図1C）を発現すべき-分化7日目に、EBは約150である必要があります。これらのEBはpoly-DL-ornithine/lamininコーティングされた料理やカバースリップの上に分離し、めっきする準備が整いました。 </li></ol> 4。ステップ4：Poly-DL-ornithine/lamininコーティングカバーガラスの調製（タイミング：2日間） 二日EBS（分化5日目にIE）を解離する前に、poly-DL-ornithine/laminin-coatedカバースリップを準備します。 <ol><li>場所24ウェルプレートの底部に12mmの円形のカバー（ワーナー·インスツルメンツ）。 10Xストック溶液（1 mg / ml）を取得するには25mgを25ミリリットルのポリ-DL-オルニチン（Sigma-Aldrich）を、滅菌蒸留水（D 2 H 2 O）を溶解する。するときに使用する準備ができて、コンセントを取得するために、D 2、H 2 Oでポリ-DL-オルニチンの1/10希釈を作る100μg/ mlの比。一晩4℃、24ウェルプレートとインキュベートの各ウェル℃に0.5ミリリットルを追加します。 </li><li>次の日（分化6日目）、吸引ポリ-DL-オルニチンおよび組織培養フード内プレートとカバースリップは、空気乾燥させます。 D 2 H 2 Oで三回プレートのウェルを洗浄します。別の時間空気乾燥してみましょう。 </li><li> 100×ストック溶液（200μg/ mlの）を作るために氷冷した1×PBS 5 mlに1 mgのマウスラミニン（ミリポア社製）を溶解する。するときに使用する準備ができて、アイス冷1X PBS（2μgのラミニン/ ml）を1/100希釈してください。 0.5ミリリットルを追加/ウェル4の24ウェルプレートとインキュベート℃、一晩のために。細胞を播種する前に、過剰なラミニンを削除する必要があり、井戸は、1X PBS 2回すすいだ。カバースリップは、MND培地（0.5ミリリットル/ウェル）に格納することができます。 </li></ol> 5。ステップ5：軸索伸長（タイミング：2日間） <ol><li>分化7日目に、（約3分）を15 mlのチューブにEBを収集し、EBを解決することができます。吸引メディアと再秒PBSでuspendのEB。 EBを解決し、その後PBSを吸引することができます。このステップを3回繰り返します。穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートし、EBSにアキュマックス（ミリポア社製）1mlを追加します。その後、EBを覆う過剰ACCUMAXを吸引除去する。 </li><li> EBを解除するには、MNDの培地3mlを追加します。 EBを混乱させる1ミリリットルエッペンドルフピペット（ブルーチップ）を使用して、ピペットを上下に20回。室温で2分間インキュベートします。単一細胞懸濁液を得るために、セルストレーナーキャップ（BDファルコン）で12x75 mmのチューブに細胞懸濁液を転送します。単一細胞の収率を豊かにするようにフィルターに保持され、残りの塊と細胞とは、この解離のステップを繰り返します。最終的に単一の細胞懸濁液は、6ミリリットルになります。 </li><li>穏やかに、この単一の細胞懸濁液を混合し、血球計算板を用いて細胞をカウントします。 ml当たり2×10 5細胞の密度にMND培地（10各BDNFのng / mlで、GDNF、CNTF、およびNT-3添加）に細胞を希釈します。 POを含む24ウェルプレートに細胞懸濁液（0.5ミリリットル/ウェル）を追加ly-DL-ornithine/lamininコーティングしたカバーガラス（上記のように事前に準備された）。分化した細胞は、培養中の2日間（ 図1D）の後に長い神経突起を拡張します。 </li></ol> 6。代表的な結果 図1Aは、プロトコルの概要を示します。ステップ1では、MESの細胞がPMEFで栽培されており、自発的な分化を防止するためにLIFを添加した。一般に、未分化のMESコロニーは円形、コンパクトであり、明らかにエッジを定義しています。コロニーは互いに接触していない。典型的には、MESの細胞は、1:4の比毎に2〜3日で分割する必要があります。しかし、個々の細胞株は、異なる速度で成長し、スプリット比は、経験的に決定する必要があります。 図1Bの矢印は3日間PMEFフィーダー層上で培養後、MES細胞の典型的な外観を示しています。これらのコロニーは大きく（直径50〜100μmの）まだラウンドと定義された優位性を維持だ。この段階ではコロニーは、分化や継代培養するための準備が整いました。 図1Bの矢印は、通常、めっき後24時間を見つけること小さなMESのコロニーを示しています。めっき後の4日間は、MESの細胞が生い茂っになります。彼らは差別化し始めていることを示し、平坦な外観と定義された境界の損失を示しています。このような細胞は、神経細胞への分化に適していません。 運動ニューロンにMESの細胞を区別するには、MESの細胞はEBの形成を可能にするためにサスペンションの条件で栽培する必要があります。ステップ2では、ES細胞はEBの形成を促進するためのフィーダー層なしで培養表面に転写されています。このステップでは、彼らは神経系統に直接細胞への2日間ノギン、bFGFを、とFGF-8を添加した神経分化培地中でインキュベートされる。小さなEBは、分化の1日目で顕微鏡下で観察することができます。彼らは、培地中に浮遊する必要があります。キャリーPMEFも1日目で見つけることができます分化、削除する必要があります。これらの細胞は、EBSが新しい細菌の皿に継代されたときように排除される細菌の料理に準拠しています。従って、分化の2日目で、ほとんどまたはまったくPMEFは、培養皿の中で見られるべきである。ステップ3では、新しい料理にEBの継続的な転送が残っているPMEFの除去を確認する必要があります。 EBは運動ニューロンに細胞を区別するために5日間のRAとSAGを添加した運動ニューロンへの分化（MND）培地中で培養されています。培養中に、EBのサイズが成長し続けると分化3日目〜4で肉眼で見ることができます。 図1Cは、分化7日目のEBの微視的な外観を示しています。未分化細胞とは異なり、EBは、GFPの発現に起因する強い蛍光を示しています。これらのEBは最適に区別され、解離のために準備が整いました。フローサイトメトリーは、51％±解離EBからの細胞の0.8％が細胞に5を発現している GFPに分化したことを示した。ステップ5番目の文化の中でGDNF、CNTF、BDNF、長い軸索突起の延長でNT3結果の存在下でESE運動ニューロンは、 図1Dは、2日間解離EBのめっき後の分化した細胞の外観を示す。メッキ細胞の細胞体から伸びる長い突起に注意してください。免疫蛍光染色は、GFP +細胞は汎神経マーカー（ニューロフィラメント中規模チェーン）と二つの運動ニューロン特異的マーカー、（膵島-1およびコリンアセチルトランスフェラーゼは、 図2）を発現することを示しています。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig1.jpg" /> 図1：運動ニューロン（写真はWu らから変更しました。5）にMES細胞の分化。 MESの細胞から運動ニューロンへの分化プロトコルのA）スキーム。 B）未分化MES細胞は線維芽細胞フィーダー層の上に円形コロニーを形成します。彼らは弱いGFP発現しています。 C）MESの細胞はフィーダー層とcultuから分離されたEBを形成する低添付皿に赤い。分化過程の最初の2日間、細胞を50 ng / mlのノギン、20 ng / mlのbFGFを、20 ng / mlのFGF-8にさらされた。その後、彼らは1μMレチノイン酸と5日に1μMソニックザヘッジホッグアゴニストSAGと区別するために誘導した。分化したMESの細胞は強いGFPの蛍光を表明した。 D）7日間分化した後、EBはpoly-DL-ornithine/lamininコーティングプレート上で分離し、播種した。分化した細胞は、培養2日後に長い神経突起を伸ばし。スケールバー= 200μmである。 MN =運動ニューロン。 A、B、CおよびDは、明視野像であり、B &#39;、C&#39;とD &#39;は、対応する蛍光画像である。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig2.jpg" /> 図2。MES細胞由来の運動ニューロンのキャラクタリゼーション。フィラメント媒体チェーン（NF-M、赤）、チャット（赤）、および膵島-1（赤）の免疫蛍光染色は、GFP（緑色）がexprと一致したession。 DAPI（青色）が核を識別するために使用されていました。スケールバー=50μmである。

<ol><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110, 385-397 (2002).</li>
<li>Miles, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+motoneurons+derived+from+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells.</a> J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).</li>
<li>Wichterle, H., Peljto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells+to+spinal+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Stem+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons.</a> Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).</li>
<li>Kiris, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell-derived+motoneurons+provide+a+highly+sensitive+cell+culture+model+for+botulinum+neurotoxin+studies%2C+with+implications+for+high-throughput+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery.</a> Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).</li>
<li>Wu, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+assessment+of+a+cell+model+of+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy.</a> BMC Neurosci. 12, 25(2011).</li>
<li>McMahon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin-mediated+antagonism+of+BMP+signaling+is+required+for+growth+and+patterning+of+the+neural+tube+and+somite%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite.</a> Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).</li>
<li>Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+posterior+neural+tissue+is+induced+by+FGF+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo.</a> Development. 125, 473-484 (1998).</li>
<li>Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+truncated+FGF+receptor+blocks+neural+induction+by+endogenous+Xenopus+inducers%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers.</a> Development. 122, 869-880 (1996).</li>
<li>Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purmorphamine+activates+the+Hedgehog+pathway+by+targeting+Smoothened%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened.</a> Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).</li>
<li>Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+modulation+of+Smoothened+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Small molecule modulation of Smoothened activity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).</li>
<li>Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+FGF8+signaling+from+the+midbrain-hindbrain+junction+regulates+growth+and+polarity+in+the+developing+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain.</a> Development. 124, 959-969 (1997).</li>
</ol>

利害の衝突が宣言されません。

MES細胞の質が運動ニューロンの効率的な生成のための最も重要なパラメータです。 MESの細胞は、自発的な分化を防止するためにPMEFで栽培する必要があります。 LIFの添加により、未分化状態のMES細胞を維持するのに役立ちます。 MESの細胞はすべての12から15時間を分割するので、培地は急速に枯渇し、毎日交換する必要がありますとなります。 ソニックヘッジホッグ経路の効率的な活性化が運動ニューロンの仕様を誘導するために必要な重要なパラメータです。 SHHタンパク質（R＆Dシステム）、およびHhのアゴニストHhAg1.3（Curis社）、purmorphamine（Calbiochem社）、およびSAG（EMDケミカルズ）などShhのシグナル伝達アゴニストは、すべての運動ニューロン1-3の形成を促進するために使用されている、10,11。我々はモーターニューロン表現型5に向かって細胞を分化におけるpurmorphamineより効果的な分子であることがサグが見つかりました。 1 - RAが20％以上の分化効率を与えた...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> PMEF </td><td>ミリポア</td><td> PMEF-H </td><td> NA </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PMEF培地 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td>インビトロジェン</td><td> 11965-118 </td><td> NA </td></tr><tr><td> FBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 16140-071 </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td> L-グルタミン酸</td><td>インビトロジェン</td><td> 25030-081 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>インビトロジェン</td><td> 15240-063 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td></td><td></TD&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> MES培地 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES細胞修飾FBS </td><td>インビトロジェン</td><td> 16141-079 </td><td> 15パーセント</td></tr><tr><td>グルタミン-I </td><td>インビトロジェン</td><td> 35050-061 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>インビトロジェン</td><td> 11140-050 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>ヌクレオシド</td><td>ミリポア</td><td> ES-008-D </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>ミリポア</td><td> ES-007-E </td><td> 0.1mMの</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ミリポア</td><td> TMS-AB2-C </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td> LIF </td><td>ミリポア</td><td&gt; LIF2010 </td><td> 10 ng / mlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 神経分化培地 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ESカルトFBS </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 06905 </td><td> 15パーセント</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>インビトロジェン</td><td> 11140-050 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>モノチオグリセロール</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> M-6145 </td><td> 1mMの</td></tr><tr><td>頭</td><td>インビトロジェン</td><td> PHC1506 </td><td> 50 ng / mlの</td></tr><tr><td> FGF-8 </td><td>インビトロジェン</td><td> PHG0274 </td><td> 20 ng / mlの</td></tr><tr><td> bFGFの</td><td>インビトロジェン</td><td> PHG0024 </td><td> 20 ng / mlの</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND培地（分化） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-カルト基礎中期</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td>ノックアウト血清代替物</td><td>インビトロジェン</td><td> 10828-028 </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td> N-2サプリメント</td><td>インビトロジェン</td><td> 17502-048 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td> ITSサプリメント-B </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07155 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07157 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ミリポア</td><td> TMS-AB2-C </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>グルタミン-I </td><td>インビトロジェン</td><td> 35050-061 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td> D-グルコース</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> G-8270 </td><td> D 2 H 2 Oで0.15パーセント</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07159 </td><td> 5μg/ mlの</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> H3149 </td><td> d 2は 20μg/ mlのH 2 O </td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>ミリポア</td><td> ES-007-E </td><td> 0.1mMの</td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> R-2625 </td><td> 1μM </td></tr><tr><td>サグ</td><td> EMDケミカルズ</td><td> 566660 </td><td> 1μM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND媒体（運動ニューロン培養） </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-カルト基礎中期</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td>ノックアウト血清代替物</td><td>インビトロジェン</td><td> 10828-028 </td><td> 10パーセント</td></tr><tr><td> N-2サプリメント</td><td>インビトロジェン</td><td> 17502-048 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td> ITSサプリメント-B </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07155 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07157 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>ミリポア</td><td> TMS-AB2-C </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td>グルタミン-I </td><td>インビトロジェン</td><td> 35050-061 </td><td>一パーセント</td></tr><tr><td> D-グルコース</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> G-8270 </td><td> D 2 H 2 Oで0.15パーセント</td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td> StemCエル·テクノロジーズ</td><td> 07159 </td><td> 5μg/ mlの</td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> H3149 </td><td> d 2は 20μg/ mlのH 2 O </td></tr><tr><td> β-メルカプトエタノール</td><td>ミリポア</td><td> ES-007-E </td><td> 0.1mMの</td></tr><tr><td> BDNF </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 248-BD-005/CF </td><td> 10 ng / mlの</td></tr><tr><td> CNTF </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 257-NY-010/CF </td><td> 10 ng / mlの</td></tr><tr><td> GDNF </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 212-GD-010/CF </td><td> 10 ng / mlの</td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> R＆Dシステムズ</td><td> 267-N3-005/CF </td><td> 10 ng / mlの</td></tr></tbody></table> NA =非適用される。 表1。MESの細胞培養や分化のPMEFとメディア。 <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;試薬の強力な&gt;名前</td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 最終濃度 </td></tr><tr><td> 0.1％ゼラチン</td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07903 </td><td> NA </td></tr><tr><td>ポリ-DL-オルニチン</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P0421 </td><td> dには0.1 mg / mlの2 H 2 O </td></tr><tr><td>マウスラミニン</td><td>ミリポア</td><td> CC095 </td><td> 2、PBS中のμg/ mlの</td></tr><tr><td> 0.25％トリプシン/ EDTA </td><td> StemCellテクノロジーズ</td><td> 07901 </td><td> NA </td></tr><tr><td>アキュマックス</td><td>ミリポア</td><td> SCR006 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> NA =非適用される。 表2コーティングと解離用試薬。

運動ニューロンにマウス胚性幹細胞の効率的な分化

Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

機能的な運動ニューロンへの胚性幹（ES）細胞の直接分化は、病気のメカニズムを研究するための新しい薬剤化合物をスクリーニングするために、このような脊髄性筋萎縮症（SMA）および筋萎縮性側索硬化症などの運動ニューロン疾患の新しい治療法を開発するための有望なリソースを表します（ ALS）。現在の多くのプロトコルは、運動ニューロン1月4日に、マウス胚性幹（MES）の細胞を区別するために、レチノイン酸（RA）とソニックヘッジホッグ（Shh）の組み合わせを使用します。しかし、運動ニューロンへのMES細胞の分化効率は中程度の成功を収めている。我々は大幅に現在確立されているプロトコルと比べて分化効率を向上させる二段階の分化プロトコル5を開発しました。最初のステップは、ノギンと線維芽細胞増殖因子（FGFの）を追加することによって、神経誘導プロセスを強化することです。ノギンは骨形成タンパク質（BMP）のアンタゴニストであると神経誘導に関与している前方神経パターニング6の形成におけるニューロン新生と結果のデフォルトのモデルにccording。 FGFシグナリングは、後部神経アイデンティティ7-9を促進することにより、神経組織の形成を誘導するノギンと相乗的に作用する。このステップでは、MESの細胞は、神経系統に向かって分化を促進するために二日間ノギン、bFGFを、とFGF-8でプライミングされた。第二段階では、運動ニューロンの仕様を誘導することである。ノギン/ FGFの露出したMESの細胞が運動ニューロンの生成を容易にするために、別の5日間、RAとShhのアゴニスト、Smoothenedのアゴニスト（SAG）とインキュベートした。運動ニューロンへの混乱の分化をモニターするために、我々は運動ニューロン特異的プロモーターHb9 1の制御下でEGFPを発現するトランスジェニックマウス由来のES細胞株を使用していました。この堅牢なプロトコルを使用して、我々は±分化効率の0.8％の51を達成した（n = 3、P &lt;0.01、スチューデントの t検定）5。免疫からの結果染色は、GFP +細胞は運動ニューロン特異的マーカー、膵島-1およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ChATの）を発現することを示した。私たちの二段階分化プロトコルは、脊髄運動ニューロンにMESの細胞を区別するための効率的な方法を提供します。

我々は運動ニューロンにマウス胚性幹細胞のインビトロ分化の効率を改善するための新しいプロトコルを開発しました。として免疫組織化学的手法を用いてニューロンと運動ニューロンマーカーの発現によって証明機能を分化したES細胞は運動ニューロンを取得しました。

胚性幹細胞（ES細胞）から機能的な運動ニューロンへの直接分化は、疾患メカニズムの研究やスクリーニングを行うための有望なリソースとなります。

本手順の全体的な目的は、マウス胚性幹細胞を運動ニューロンへと分化させることです。まず、マウス胚性幹細胞をマウス一次胚性線維芽細胞上で培養し、白血病抑制因子を添加します。次に、noggin、BFG F、およびFGF8を添加して神経分化プロセスを促進します。その後、レチノイン酸およびSmoothenedアゴニストとともにインキュベートすることで運動ニューロンへの特定を誘導し、続いて軸索伸長と運動ニューロンの成熟を行います。最後に、免疫蛍光顕微鏡を用いて、強いGFP蛍光を発現している分化したMES細胞を観察します。大量の運動ニューロンを生成できるようになったことで、既存のプロトコルと比較して、運動ニューロン疾患の研究が促進されました。マウス胚性幹細胞を運動ニューロンへと分化させるこの手法は、より効率的です。この方法は、脊髄性筋萎縮症に関する知見を提供することができます。これは、筋萎縮性側索硬化症などの他の運動ニューロン疾患にも適用可能です。マウス初代胚性線維芽細胞を播種するために、100 mmの組織培養ディッシュ4枚に、0.1%ゼラチン溶液を8 mLずつコーティングします。室温で30分後、余分な液体を除去してください。次に、mitomycin Cで処理したPMEFの1バイアルを40 mLのPMEF培地で希釈し、4枚のプレートに播種して最大1週間培養します。次に、MES細胞1バイアルを37°Cのウォーターバスで解凍します。15mLチューブ内で、細胞を5mLのE ES培地で洗浄します。その後、800 RPMで5分間遠心分離します。上清を吸引し、新鮮な白血病抑制因子を添加したES培地20 millilitersでMES細胞を再懸濁します。PMEF培養液から10 millilitersの培地を除去し、代わりにHBG 3 ES細胞懸濁液10 millilitersを加えてください。播種後24時間目の小さなコロニーから、72時間後の直径約100 micrometersのコロニーに至るまで、MES細胞の経過を観察します。MES細胞の誘導に向けて細胞の増殖を維持するため、培地を毎日交換します。その後、運動ニューロンへと分化させます。マウス胚性幹細胞は、まずPMEFフィーダー細胞から分離し、誘導当日に浮遊環境で培養する必要があります。100 mmのES細胞培養につき、0.1%ゼラチンでコーティングしたT25フラスコを1個用意します。室温で30分後に、余分なゼラチンを除去し、PBSで3回洗浄します。ES細胞培養から、ゆるく付着しているコロニーを剥がさないように注意しながら、培地を慎重に吸引し続けます。その後、10 mLのPBSで1回洗浄します。次に、MES細胞をPMEFから分離するため、0.25% trypsin EDTAを3 mL加え、3～5分間インキュベートします。37 °Cで、幹細胞とPMEFがプレートから剥離したことを確認します。その後、新鮮なES培地を15 mL加え、ピペッティングによりコロニーを分散させます。細胞懸濁液を調製済みのゼラチンコートT150フラスコに移し、PFSがゼラチン化表面に付着するように37 °Cで30分間インキュベートします。次に、浮遊しているMES細胞を50 mLチューブに回収し、遠心分離によりペレット化します。細胞を10 mLの神経分化培地で再懸濁します。ヘモサイトメーターを用いて培地中の細胞数を算出し、分化のために100 mmの懸濁培養皿に播種します。1日目に、顕微鏡観察によりMES細胞が胚様体と呼ばれる小さな浮遊凝集体を形成していることを確認します。皿に付着している可能性のあるPMEFを除去するため、ES懸濁細胞と培地を15 mLチューブに移し、500 RPMで3分間遠心分離します。胚体（ebs）を回収するため、培地を慎重に吸引し、ペレット状になったebsに新鮮な神経分化培地を10 milliliters加え、その後、細胞を新しい細菌培養皿に播種し、分化条件下で24時間培養します。2日目、培養皿を軽く回して混ぜ、培地とEBSを15 milliliterチューブに移します。EBSを重力で沈降させた後、培地を慎重に吸引し、10 millilitersの運動ニューロン分化培地でEBSを再懸濁します。分化過程において、新しい細菌用ディッシュでEBSを5日間培養します。7日目に、EBSの直径が約150から200 micrometersであり、分化に伴い強いGFP信号を発現していることを確認します。EBSを分散させる2日前となる5日目に、24ウェルプレートの底に12 millimeterの円形カバーガラスを配置します。次に、100 µg/mL の poly DL ornithine を 0.5 mL 加え、4 °C で一晩インキュベートします。組織培養フード内で、poly DL ornithine を吸引し、プレートとカバーグラスを風乾させます。プレートのウェルを二回蒸留水で 3 回洗浄します。カバーガラスをコーティングするため、そのまま風乾させます。氷冷した1 XPBS 5 mLに、2 µg/mLとなるようにマウスlamininを新たに希釈します。各ウェルに0.5 mLずつ添加し、4 °Cで一晩インキュベートします。分化後、PBSで2回洗浄します。7日目に、EBSを15 mLチューブに回収し、重力で沈降させます。PBSで4回洗浄した後、1 mLのACU maxをEBSに加え、静かに混ぜて室温で5分間インキュベートし、その後、EBSを覆っている余分なACU maxを吸引します。次に、3 mLのMND培地を加え、1 mLのマイクロピペットを用いて約20回ピペッティングし、EBSを分散させます。室温で2分間インキュベートした後、細胞懸濁液をセルストレーナーキャップを通して12 × 75 mmチューブに回収します。フィルターで保持された残りの凝集塊や細胞に対してもこの分散操作を繰り返し、最終的に6 mLの単一細胞懸濁液として単一細胞の回収率を高めます。単一細胞懸濁液を穏やかに混合し、ヘモサイトメーターを用いて細胞数をカウントします。完全MND培地を用いて、細胞密度を2 × 10⁵ cells/mLに調整して播種します。poly DL-ornithineおよびラミニンでコーティングしたカバーガラスが入った調製済みの24ウェルプレートの各ウェルに、0.5 millilitersの細胞懸濁液を分注します。分化後の細胞は、2日後に長い神経突起を伸ばします。培養において、HBG3は、運動ニューロン特異的プロモーターであるHB9の制御下でEGFPを発現する遺伝子組み換えマウス由来のES細胞株であり、規定の分化プロトコルを用いています。MES細胞は、運動ニューロンを誘導するために使用できます。未分化のMES細胞は、線維芽細胞フィーダー層の上で円形のコロニーを形成します。これらの細胞は弱いGFP発現を示します。これらのMES細胞をフィーダー層から分離し、低接着ディッシュで培養して胚様体を形成させた。分化したMES細胞は、7日目以降に強いGFP蛍光を示した。分化したEBsを解離し、poly DL-ornithineおよびラミニンでコーティングしたプレートに播種した。分化した細胞は、培養2日後に播種した細胞の細胞体から長いニューライトを伸長させ、MES細胞由来の運動ニューロンは免疫蛍光染色によって特徴付けることができます。これらのGFP陽性細胞は、汎ニューロンマーカーであるニューロフィラメントと、2つの運動ニューロン特異的マーカーを発現しています。これらはEyelid oneおよびコリンアセチルトランスフェラーゼであり、合わせてDPIで核を染色します。本研究の2段階分化プロトコルは、MES細胞を脊髄運動ニューロンへ分化させる効率的な手法を提供します。このビデオを視聴することで、マウス胚性幹細胞を運動ニューロンへ効率的に分化させる方法を理解できるはずです。結論として、運動ニューロンを効率的に生成するためには、マウス胚性幹細胞の品質が高いことが最も重要なパラメータであるという点に留意してください。

efficient-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-into-motor

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、小分子ベースのオリゴデンドロサイト前駆細胞体（OPC）にマウス胚性幹細胞の分化のためのプロトコルについて説明します。このプロトコルは、分化の30日間で高効率とOlig2 + NG2 +...

オリゴデンドロサイト前駆体に胚性幹細胞の分化

このビデオでは、マウス胚性幹細胞(mESC)から神経前駆細胞(NPC)をin...

マウス胚性幹細胞から神経前駆細胞を作製する技術

このビデオでは、脊髄神経前駆細胞(NPC)を運動ニューロンに分化させる方法を紹介しています。これは、NPCの成熟運動ニューロンへの分化を促進することを目的とした特定の阻害剤が豊富な特殊な培地を使用して、コーティングされた培養プレート上でのNPCの培養プロセスを詳述しています。...

脊髄神経前駆細胞の運動ニューロンへの分化

このビデオは、胚性幹細胞を機能しているシナプスを持つニューロンのネットワーク集団に分化する技術を示しています。胚性幹細胞のニューロンへの分化、ニューロンネットワーク形成の誘導、およびネットワーク化されたニューロンによる培養の濃縮に関与するステップを概説しています。...

マウス胚性幹細胞のネットワーク化ニューロン集団への分化

このビデオでは、ヒトiPS細胞を運動ニューロンに分化させる過程を紹介しています。その根拠は、特定の転写因子を発現するように遺伝子改変されたiPS細胞を利用することにあります。この抗生物質をドキシサイクリンを含む培地で培養すると、転写因子の発現が引き起こされ、運動ニューロン前駆細胞へのiPS細胞の分化が促進されます。最終的に、前駆細胞をニューロン培地で培養して、成熟した機能的な運動ニューロンを生成します。...

人工ヒト人工多能性幹細胞の機能的運動ニューロンへの分化

このプロトコルは、無血清単層法を使用して胚性幹細胞から神経前駆細胞を生成する方法を詳細に説明しています。これらの前駆細胞は、成熟した神経細胞タイプの誘導や神経仕様のプロセスの研究に使用でき、化合物スクリーニングのためのマルチウェルフォーマットスケーリングに適しています。...

無血清単層培養中のマウス胚性幹細胞の神経分化

このプロトコルでは、変更された胚様体-単層法を用いたマウス胚性幹細胞から皮質介在ニューロン前駆細胞と後細胞分裂の介在ニューロン前駆体を生成するためのメソッドについて説明します。これらの前駆細胞/前駆体生体外で使用することができますまたは蛍光ソート運命決定を研究するため新生児大脳新皮質に移植や治療への応用で使用されます。...

マウス胚性幹細胞の皮質介在ニューロン前駆細胞への分化

このプロトコルは、誘導性 piggyBac...

PiggyBac ベクターを用いたヒト誘導多能性幹細胞 (iPSCs) の機能的脊髄および頭蓋運動ニューロンへの変換

ここで提示するプロトコルは、ヒト胚性幹細胞の単細胞培養の生成とその後の神経前駆細胞への分化のためのプロトコルである。プロトコルは、シンプルで堅牢でスケーラブルで、薬物スクリーニングや再生医療用途に適しています。...

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

ここでは、低コストで使いやすい方法を確立し、胚性幹細胞からニューロンへの迅速かつ効率的な分化を導く方法を確立しました。この方法は、研究室間で普及に適しており、神経学的研究のための有用なツールとなり得る。...

インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

吊り下げドロップ法を用いて、マウス胚性幹細胞を神経細胞に分化する手順について説明する。また、RT-qPCR、免疫蛍光、RNA-seq、フローサイトメトリーを通して包括的なフェノミック解析を行っています。...

マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

学ぼう、マウス胚性幹細胞から運動ニューロンへの効率的な分化プロトコル。この方法は神経系マーカー発現を用いて確認され、運動ニューロン疾患や脊髄性筋萎縮症の研究に応用可能です。

運動ニューロンにマウス胚性幹細胞の効率的な分化

さらに動画を探す