運動ニューロンにマウス胚性幹細胞の効率的な分化
2012年6月9日
我々は運動ニューロンにマウス胚性幹細胞のインビトロ分化の効率を改善するための新しいプロトコルを開発しました。として免疫組織化学的手法を用いてニューロンと運動ニューロンマーカーの発現によって証明機能を分化したES細胞は運動ニューロンを取得しました。
この手順の全体的な目標は、マウス胚性幹細胞を運動ニューロンに分化させることです。まず、マウス初代胚性線維芽細胞に胚性幹細胞を培養し、白血病抑制因子を補充します。次に、ノギンBFGFおよびFGF8を添加することにより、ノーマライゼーションプロセスを強化し、レチノイン酸と平滑化されたアゴニストとのインキュベーションにより運動ニューロンの仕様を誘導し、その後、軸索の伸長と運動ニューロンの成熟
が続きます。最後に、免疫蛍光顕微鏡を使用して、強力なGFP蛍光を発現する分化したMES細胞を調べます 運動ニューロンを大量に生成することで、現在の既存のプロトコルと比較して運動ニューロン疾患の研究が促進されました。マウス胚性幹細胞を運動ニューロンに分化させるこのアプローチは、より効率的です。この方法は、脊髄性筋萎縮症に関する洞察を提供することができます。
それはまた、筋萎縮性側索硬化症などの他の運動ニューロン疾患に適用することができます 初代胚性マウス線維芽細胞をプレートするために、0.1%ゼラチン溶液の8ミリリットルで4、100ミリメートルの組織培養皿をコーティングします。室温で30分後、余分な液体を廃棄します。次に、活性化されたPMEF中のマイトマイシンCの1バイアルを40ミリリットルのPMEF培地プレートに希釈し、4つのプレートに最大1週間培養します。
次に、MES細胞のバイアル1つを37度の水浴で解凍します。15ミリリットルのチューブで5ミリリットルのE ES培地で細胞を洗浄します。800 RPMで5分間遠心分離した後。
上清を吸引し、新たに添加した白血病抑制因子を含む20ミリリットルのES培地にMES細胞を再懸濁します。PMEF培養物から10ミリリットルの培地を取り出し、10ミリリットルのHBG 3 ES細胞懸濁液と交換します。MES細胞の進行を、24時間の小さなコロニーからプレーティング後72時間の直径約100マイクロメートルのコロニーまで、経時的にモニタリングします。
MES細胞の誘導のための細胞の増殖を維持するために、培地を毎日交換してください。運動ニューロンへの分化。マウス胚性幹細胞は、まずPMEFフィーダー細胞から分離し、導入日に懸濁環境で培養する必要があります。
100ミリメートルES培養物ごとに、0.1%ゼラチンでコーティングされたTワン50フラスコを準備し、室温で30分後、余分なゼラチンを取り除き、PBSで3回洗浄します。ES培養物から培地を慎重に吸引し続け、緩く付着したコロニーが剥がれないように注意してください。次に、10ミリリットルのPBSで一度洗います。
次に、MES細胞をPMEFから分離するために、0.25%トリプシンEDTAを3ミリリットル加え、3〜5分間インキュベートします。摂氏37度で、幹細胞とPMEFがプレートから分離したことを確認します。次に、15ミリリットルの新鮮なES培地を加え、ピペッティングでコロニーを破壊します。
調製したゼラチンに細胞懸濁液を移し、50フラスコを37°Cで30分間インキュベートし、PFSをゼラチン化した表面に付着させます。次に、浮遊MES細胞を50ミリリットルのチューブに取り込み、濃縮してペレット化します。細胞を10ミリリットルの神経分化に再懸濁します。
培地はヘモサイトメーターを使用して列挙し、分化時に100ミリメートルの懸濁培養皿にプレート化します。1日目は、MES細胞が胚体と呼ばれる小さな浮遊凝集体を形成していることを顕微鏡で確認します。キャリーオーバーPMEFがディッシュに付着しているため、ES懸濁細胞と培地を15ミリリットルのチューブに移し、500RPMで3分間遠心分離します。
培地から胚体を吸引するためには、ペレット状のebsに培地である新鮮な神経分化を10ミリリットル慎重に加え、次いで分化時に24時間新しい細菌皿培養物で細胞をプレート化する。2日目は、培養皿を渦巻き、培地とEBSを15ミリリットルのチューブに移します。EBSを重力で沈殿させ、次に媒体を慎重に吸引し、EBSと運動ニューロン分化の10ミリリットルを懸濁します。
EBSを新しい細菌皿で5日間分化させて培地培養します。7日目は、EBSの直径が約150〜200マイクロメートルで、分化時に強いGFPシグナルを発現することを確認します。EBSを解離する2日前の5日目に、12mmの丸いカバースリップを24ウェルプレートの底に置きます。
次に、100マイクログラム/ミリリットルの0.5ミリリットル、ポリDLオルニチンを加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。ポリDLオルニチンエアドライプレートを吸引し、組織培養フードでスリップを覆います。プレートウェルを二重蒸留水で3回すすぎます。
カバースリップをコーティングするために、風乾させます。5ミリリットルの氷冷たく1つのXPBSで、マウスラミニン1ミリリットルあたり2マイクログラムの新鮮な希釈を行います。ウェルあたり0.5ミリリットルを加え、摂氏4度で一晩インキュベートします。
分化時にPBSで2回洗浄します。7日目に、EBSを15ミリリットルのチューブに集め、EBSが重力によって沈殿するのを待ちます。PBSで4回洗浄した後、EBSに1ミリリットルのACU maxを添加し、室温で5分間静かに混合してインキュベートし、EBSを覆う余分なACU maxを吸引します。
次に、3ミリリットルのMND培地を添加し、1ミリリットルのeinorマイクロピペットを使用して約20回ピペッティングしてEBSを解離し、室温で2分間インキュベートした後、細胞懸濁液をセルトレーナーキャップに通して12×75ミリメートルのチューブに入れます。フィルターに保持された残りの凝集体および細胞でこの解離ステップを繰り返し、6ミリリットルの最終的な単一細胞懸濁液中の単一細胞の収量を濃縮する。ヘモサイトメーターを使用して単一細胞懸濁液を穏やかに混合し、細胞を完全なMND培地に希釈し、1ミリリットルプレートあたり5番目の細胞の10倍の密度にします。
ポリDLオルニチンラミニンコーティングされたカバースリップを含む調製された24ウェルプレートのウェルあたり0.5ミリリットルの細胞懸濁液。分化した細胞は、2日後に長い神経突起を伸ばします。培養において、HBG 3は、明確な分化プロトコルを持つ運動ニューロン特異的プロモーターHB nineの制御下でEGFPを発現するトランスジェニックマウスに由来するES細胞株です。
MES細胞は、運動ニューロンの誘導に用いることができます。未分化のMES細胞は、ファイバーブラストフィーダー層の上部に丸いコロニーを形成します。GFP発現が弱い。
これらのMES細胞をフィーダー層から分離し、低付着皿で培養して胚体を形成しました。分化したMES細胞は、7日目以降に強いGFP蛍光を発現しました。分化EBSを解離し、ポリDLオルニチンラミニンコーティングプレートに播種しました。
分化した細胞は、培養で2日後に播種した細胞の細胞体から長い神経突起を伸ばし、MES細胞由来の運動ニューロンを免疫蛍光染色により特徴付けることができる。これらのGFP陽性細胞は、汎ニューロンマーカーであるニューロフィラメントと2つの運動ニューロン特異的マーカーを発現しています。まぶた1つとコリンアセチルトランスフェラーゼDPIは、一緒に取り込んだ核を染色します。
当社の2段階分化プロトコルは、MES細胞を脊髄運動ニューロンに分化するための効率的な方法を提供します。このビデオを見れば、マウス胚性幹細胞を運動ニューロンに効率的に分化させる方法を理解できるはずです。結論として、高品質のマウス胚性幹細胞が運動ニューロンを効率的に生成するための最も重要なパラメーターであることを忘れないでください。
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概要
この研究は、マウスの胚性幹細胞を運動ニューロンに効率的に分化する新しいプロトコルを提示します。分化した細胞は運動ニューロンの特性を示し、免疫組織化学的技術を通じて特定のマーカーの発現によって確認されます。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 幹細胞生物学
- 運動ニューロン研究
背景
- 運動ニューロン疾患は研究において重大な課題をもたらします。
- 現在の分化プロトコルはしばしば非効率的です。
- 分化方法の改善は研究成果を向上させることができます。
- マウスの胚性幹細胞は運動ニューロンを研究するための貴重なモデルです。
研究の目的
- マウスの胚性幹細胞を運動ニューロンに分化するより効率的なプロトコルを開発すること。
- 運動ニューロン疾患の研究を促進すること。
- 脊髄性筋萎縮症などの状態に関する洞察を提供すること。
使用した方法
- 一次マウス胚性線維芽細胞上でマウス胚性幹細胞を培養すること。
- 白血病抑制因子を培養に加える。
- 運動ニューロン特性を誘導するためにnoggin、BFGF、およびFGF8を追加すること。
- 視黄酸とsmoothenedアゴニストを使用して成熟と軸索伸長を行う。
主要な結果
- 胚性幹細胞から運動ニューロンへの成功的な分化。
- 免疫蛍光顕微鏡法で運動ニューロンマーカーの発現を確認。
- 研究目的のために大量の運動ニューロンを生成。
- 既存のプロトコルと比較して効率が向上。
結論
- 新しいプロトコルは分化プロセスを大幅に改善します。
- この方法は運動ニューロン疾患の理解を進めることができます。
- 将来の研究はこのプロトコルを治療的洞察のために活用できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons addresses a critical bottleneck in disease modeling and early drug discovery for neurodegenerative disorders. This protocol enhances predictive confidence in generating disease-relevant cell types, supporting translational research and target validation for motor neuron diseases such as SMA and ALS. Improved differentiation efficiency enables scalable production of functional motor neurons, facilitating robust phenotypic screening and mechanistic de-risking in preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables generation of disease-relevant motor neurons for hypothesis-driven target interrogation.
- Supports functional validation of candidate targets in a controlled stem cell-derived system.
- Improves mechanistic de-risking by providing reproducible neural differentiation outputs.
- Facilitates portfolio triage by enabling early-stage assessment of neurotoxicity and efficacy.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized source of motor neurons for high-content phenotypic screening.
- Enables quantitative assay development using GFP and immunofluorescent marker readouts.
- Supports reproducibility and scalability for compound evaluation workflows.
- Prepares validated cell systems for downstream screening and mechanistic studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro disease models with translational biomarker strategies for motor neuron disorders.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation using functionally characterized neurons.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by providing robust, disease-relevant data.
- Enhances predictive value for therapeutic candidate selection in neurodegenerative disease pipelines.
Pipeline & Workflow Integration
This two-step differentiation protocol integrates into the early discovery-to-preclinical continuum, enabling reliable generation of motor neurons for target validation, screening, and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification in motor neuron disease models.
- Screening: Delivers assay-ready, marker-validated motor neurons for reproducible compound testing.
- Analytics: Provides quantitative outputs via GFP expression and immunofluorescent marker analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models through disease-relevant cell systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable platform for motor neuron generation across R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurodegenerative disease research.
- Operational Value: Standardizes differentiation protocols for reproducibility and scalability across teams.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of neurotherapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture and neural differentiation protocols.
- Needs access to fluorescence microscopy and immunostaining infrastructure for marker validation.
- Demands cross-team standardization to ensure reproducibility of differentiation efficiency.
- May require adaptation for different stem cell lines or disease models.
- Dependent on high-quality starting stem cell populations for optimal outcomes.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:15
Culturing Mouse Embryonic Stem Cells (Timing: 3 days)
2:34
Neural Induction (Timing: 2 days)
4:48
Motor Neuron Specification (Timing: 5 days)
5:24
Preparation of Poly-DL-Ornithine/Laminin Coated Coverslips (Timing: 2 days)
6:18
Axon Elongation (Timing: 2 days)
7:47
Results: mES Cell Differentiation into Motor Neurons
9:12
Conclusion
