懸濁液中のHEK293細胞の一過性トランスフェクションによる組換えヒトタンパ​​ク質のハイ・イールド式

本手順の全体的な目的は、リコンビナントタンパク質を小胞体（ER）およびゴルジ体介在性分泌経路に標的化することで、適切な哺乳類型糖鎖修飾を伴う哺乳類糖タンパク質を発現させることです。この手法は、特定の糖鎖の役割や、抗体および抗体フラグメントの構造パターンと免疫活性化能など、免疫学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、ヒト細胞を用いてヒトタンパク質を発現させるため、標的タンパク質を適切に折り畳み、修飾するための適切な細胞内環境が得られることです。

細胞構築に使用するインキュベーターシェーカーは、培養接種の少なくとも1時間前から、135 RPM、湿度80%、二酸化炭素8%、37 °Cで運転させておきます。バイオセーフティキャビネットのUVランプを点灯させ、密封された培地Aおよび培地Bのボトルを37 °Cのウォーターバスで予熱します。UVランプを消灯し、70%エタノール水溶液でバイオセーフティキャビネット内を滅菌します。

ベントキャップ付きの125 mLエルレンマイヤーフラスコ、ピペット、ピペッター、および予熱した培地ボトルに70%エタノール水溶液をスプレーして滅菌します。これらの器具はこの手順の間、バイオセーフティキャビネット内に配置してください。バイオセーフティキャビネット内に持ち込むすべての物品は、この方法で滅菌する必要があります。

培地Aを26 mL、培地Bを3 mL分注して125 mLのエルレンマイヤーフラスコに移し、30 mL分の新鮮な培養培地を調製します。緩やかに振盪して混ぜ合わせます。-80°Cで凍結保存されていたHEK 293 F細胞のバイアルを37°Cの水槽で加温し、細胞を部分的に融解させます。この操作には約1分かかりますが、細胞を完全に融解させないように注意してください。

次に、バイアルの外側を70%エタノール水溶液で滅菌し、バイオセーフティキャビネット内へ移動させます。1 mLピペットを用いて細胞懸濁液を分注し、29 mLの新鮮な培地が入った125 mLエルレンマイヤーフラスコに移します。培養フラスコの蓋を閉め、フラスコをインキュベーターシェーカーに設置して24時間培養します。

培養接種から24時間後。細胞密度を確認し、培養フラスコを70%エタノール水溶液で滅菌してからバイオセーフティーキャビネット内に移動させる。1 mLピペットとピペッターを用い、培養液100 µLをゆっくりと分取し、滅菌済みの0.5 mLエッペンドルフチューブに移す。

培養フラスコの蓋を閉じ、速やかに培養フラスコをインキュベーターシェーカーに戻します。7.5 µLのトリパンブルー溶液と7.5 µLの細胞を混合します。激しく混ぜ合わせた後、混合液 7.5 µLを計数用スライドに転送します。

自動細胞計数器の電源を入れ、計数スライドをロードチャンバーにセットします。自動リーダーが起動し、細胞数が 1 mL あたりの細胞数および生存率（%）の単位で自動的に計数されます。新鮮な培地へ移行させ、細胞密度を 300,000 live cells/mL にするために必要なドナー培養液の量を決定します。

以前に示した方法に従い、培地Aを23 milliliters、培地Bを3 milliliters、新しい125 milliliter培養フラスコに移して新鮮な培養培地を調製します。その後、汚染のリスクを軽減するため、培地Aと培地Bのストックボトルをバイオセーフティーキャビネットから取り出します。インキュベーターからHEK 2 93 F細胞培養フラスコを取り出します。

70%エタノール水溶液をスプレーし、バイオセーフティキャビネット内に配置します。新しいピペットを使用して、培養液から適切な分量の細胞を分注し、新鮮な培地を含むフラスコに移します。両方の培養物をバイオセーフティキャビネットからインキュベーターシェーカーへ移動させます。

トランスフェクション前に、細胞を1mLあたり約200万から300万個の生存細胞密度まで増殖させます。先に示した方法で細胞密度を確認し、トランスフェクションに使用する細胞量を決定します。滅菌済みのセロロジカルピペットを使用してください。

適切な量の細胞懸濁液を250 milliliter遠心チューブに移します。100 ×gで5分間遠心分離し、細胞を回収します。滅菌後、細胞ペレットの入ったチューブをバイオセーフティキャビネット内に移します。

滅菌ピペットを使用して、使用済みの培地からなる上清をデカンテーションにより除去します。10 millilitersの新鮮な培養培地を用いてピペッティングを行い、ペレット化した細胞を激しく再懸濁し、新鮮なトランスフェクション用培養培地を入れた調製済みフラスコに移します。通気口付き細胞培養フラスコのキャップを締め、細胞をインキュベートしながら、インキュベーターシェーカーで15分から1時間インキュベートします。

血漿DNAおよびPOLYETHERAMINE（またはPEI）のストック溶液を、新鮮な培地を用いて最終濃度0.5 µg/µLまで希釈します。細胞を分散させた培養フラスコをインキュベーターシェーカーから取り出し、バイオセーフティキャビネットへ移動させます。マイクロピペットを用いて300 µLの血漿DNAを培養液に加え、緩やかに手で振って混ぜ合わせます。続いて900 µLのPEIを培養液に加え、再度混ぜ合わせます。その後、3.8 mLの新鮮な培地を加えます。

フラスコをインキュベーターシェーカーに移し、24時間培養します。トランスフェクションの24時間後に、細胞培養液を希釈する必要があります。まず希釈培地を調製するため、滅菌済みの1 mLセロロジカルピペットを用いて、あらかじめ温めておいた220 mMのバルプロ酸（VPA）を1 mL分分注し、滅菌済みの50 mLチューブに移します。

次に、滅菌済みのセラロジカルピペットを用いて、VPA溶液に予め温めておいたMedium Bを5 mL、Medium Aを44 mL加えます。これにより、最終濃度が4.4 mMのVPAを含む新鮮な培養液が50 mL調製されます。インキュベーターから、トランスフェクション後の培養物を回収します。

フラスコの外面を滅菌し、バイオセーフティキャビネット内に配置します。調製した希釈培地を培養液に加えます。トランスフェクション後、さらに4〜5日間、フラスコをインキュベーターシェーカーに戻して培養します。

先に示した手順に従い、細胞生存率を毎日モニタリングしてください。また、タンパク質発現解析のために、トランスフェクションから5〜6日後、または細胞生存率が50%を下回った時点で回収できるよう、毎日分注して保存しておく必要があります。細胞と培地を1000 ×gで5分間遠心分離して細胞を回収します。分泌タンパク質を含む上清を回収し、HEK細胞ペレットに10%漂白剤溶液5 mLを加えてバイオハザードとして廃棄してください。

その後、回収した上清からタンパク質を精製します。この発現系は、HK 2 93 F細胞への一過性導入後におけるIgG one fcの典型的な発現パターンに示されるように、糖鎖付加タンパク質の高収量な生成を可能にしました。IgG one FC用タンパク質カラム、またはFC gamma receptor three Aを結合させたヒスチジンタグ付きGFP用ニッケルカラムを用いたアフィニティー精製により、高純度のタンパク質が得られました。

このシステムにより、水素原子核と直接結合したアミド窒素の共鳴周波数を相関させたこの2次元NMRスペクトルにおいて、同位体標識 IgG one FC が効率的に発現しました。15 atoms の分散した良好なシグナルが確認されました。マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（MALDI-MS）による解析で示されるように、異なる培養条件下で HEK 2 93 F 細胞および HEK 2 93 s 細胞を用いて、異なる糖鎖形態が生成されました。

HEK 293S細胞から発現したIgG1 Fcは、5つのマンノースと2つのN-アセチルグルコサミン残基からなる形態の糖鎖を保持しており、フコース含有糖鎖は含まれていなかった。一方、HEK 293F発現材料からは、コアフコースを持つ複合型ビアンテナ形式の糖鎖が得られ、その大部分は末端にN-アセチルグルコサミンを有しており、少割合でモノまたはジアンテナ形式であった。HEK 293F細胞を用いた発現において糖鎖付加阻害剤を添加したところ、フコースの取り込みが90%以上減少した。一度習得すれば、一過性トランスフェクションの確立は1日目に1.5時間、2日目に15分で完了できる。4～6日間の発現期間後、タンパク質を含む溶液を15分で回収することが可能である。

最後に、タンパク質の精製には約1.5時間かかります。この手順を行う際は、トランスフェクション前に安定した培養状態を維持し、活発に増殖している細胞にトランスフェクションを行い、PEIを添加する前にDNAを添加することを忘れないでください。本手順に続き、発現した糖タンパク質の構造と機能を調査するために、さまざまな生物物理学的手法を用いたタンパク質の機能特性解析などの他の手法を実施することが可能です。

この手法は、免疫学分野の研究者がIgGと糖鎖付加の構造活性相関をin vitroおよびin vivoで探索するための道を切り拓きました。このビデオを視聴することで、K 2 93 F細胞とPZ N twoベクターを組み合わせて糖タンパク質を調製および精製する方法について、十分に理解することができます。