懸濁液中のHEK293細胞の一過性トランスフェクションによる組換えヒトタンパ​​ク質のハイ・イールド式

この手順の全体的な目標は、ERおよびGOGIを介した分泌経路に組換えタンパク質を標的とすることにより、適切な哺乳類の糖鎖修飾で哺乳類の糖タンパク質を発現させることです。この方法は、仕様の役割、抗体や抗体フラグメントの構造や免疫活性化の可能性など、免疫学における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、ヒト細胞を使用してヒトタンパク質を発現し、標的タンパク質を適切に折り畳み、修飾するための適切な細胞宣教師を提供することです。

細胞確立のためのインキュベーターシェーカーは、培養接種の少なくとも1時間前に、135 RPM、80%湿度、8%二酸化炭素、および摂氏37度で操作する必要があります。バイオセーフティキャビネットのUVランプをオンにし、密閉されたミディアムAとミディアムBのボトルを摂氏37度のウォーターバスで予温します。UVライトをオフにし、バイオセーフティキャビネットを70%エタノールと水溶液で滅菌します。

125ミリリットルの三角成長フラスコを、ベントキャップピペット、ピペット、および予熱培地ボトルで滅菌します。この手順全体を通して、これらのアイテムをバイオセーフティキャビネットに入れます。すべてのアイテムは、バイオセーフティキャビネットに持ち込まれる前に、この方法で滅菌する必要があります。

26ミリリットルの培地Aと3ミリリットルの培地Bを取り出し、125ミリリットルの三角フラスコに移すことにより、30ミリリットルの培養用の新鮮な培地を準備します。細胞を部分的に解凍するために、摂氏37度の水浴で摂氏マイナス80度で以前に凍結したHEK2 93 F細胞のバイアルを、温めて穏やかに振とうして混合します。これには約1分かかり、細胞を完全に解凍しないでください。

次に、バイアルの外側を70%エタノールの水溶液で滅菌し、バイオセーフティキャビネットに移します。1ミリリットルのピペットを使用して、細胞懸濁液を引き出し、29ミリリットルの新鮮な培地を含む125ミリリットルの三角フラスコに移します。培養フラスコのカバーを閉じ、フラスコをインキュベーターシェーカーに24時間入れます。

培養接種から24時間後。細胞密度を確認し、培養フラスコを70%エタノールと水溶液で滅菌し、バイオセーフティキャビネットに移します。1ミリリットルのピペットとピペットを使用して、100マイクロリットルの培養物をゆっくりと引き出し、滅菌済みの0.5ミリリットルのアイノールチューブに移します。

培養フラスコのカバーを閉じ、できるだけ早く培養フラスコをインキュベーターシェーカーに戻します。7.5マイクロリットルのトライアンブルー溶液を7.5マイクロリットルの細胞と混合します。激しく混合し、次に混合物の7.5マイクロリットルを計数スライドに移します。

自動セルカウンターをオンにし、計数スライドをローディングチャンバーに入れます。オートリーダーが作動し、細胞数/ミリリットルと生存率の単位で自動的に細胞がカウントされます。ミリリットルあたり300, 000生細胞の細胞密度を得るために、新鮮な培地に移すために必要なドナー培養物の量を決定します。

前に示すように、23ミリリットルの培地Aと3ミリリットルの培地Bを新鮮な125ミリリットルの培養フラスコに移すことにより、新鮮な培地を調製します。その後、ミディアムAとミディアムBのストックボトルをバイオセーフティキャビネットから取り出し、汚染のリスクを減らします。HEK 2 93 F細胞培養フラスコをインキュベーターから取り出します。

70%エタノールと水溶液をスプレーし、新しいピペットを使用してバイオセーフティキャビネットに入れます。細胞の正しいアリコートを培養物から取り出し、新鮮な培養物を含むフラスコに移します。中程度。両方の培養物をバイオセーフティキャビネットからインキュベーターシェーカーに移します。

トランスフェクションの前に、細胞を1ミリリットルあたり約200万〜300万の生細胞の密度まで増殖させます。前に示したように細胞密度を確認し、トランスフェクションする細胞の量を決定します。滅菌血清ピペットを使用します。

適切な量の細胞懸濁液を250ミリリットルの遠心分離チューブに移します。Gの100倍で5分間遠心分離することにより、細胞を回収します。滅菌後、ペレット化した細胞の入ったチューブをバイオセーフティキャビネットに移します。

滅菌ピペットを使用して、使用済みからなる上清をデカントします。培地は、10ミリリットルの新鮮な培地を使用してピペッティングアップおよびピペッティングすることにより、ペレット化された細胞を激しく再送し、新鮮トランスフェクション培養物を含む調製されたフラスコに移します。中程度。ベントされた細胞培養フラスコにキャップをねじ込み、細胞がインキュベートしている間、フラスコをインキュベーターシェーカーで15分から1時間インキュベートします。

新鮮な培地を使用して、血漿DNAとポリエーテルアミンまたはPEIストックを0.5マイクロリットルあたり0.5マイクログラムの最終濃度に希釈します。インキュベーターシェーカーから分散細胞の入った培養フラスコを取り出し、マイクロピペットと300マイクロリットルの血漿DNAを使用してバイオセーフティキャビネットに持ち込み、900マイクロリットルのPEIで穏やかに手動振とうして培養し、再度混合します。その後、3.8ミリリットルの新鮮な培地で。

フラスコをインキュベーターシェーカーに24時間移します。トランスフェクションの24時間後、細胞培養物を希釈する必要があります。希釈培地を調製するには、まず滅菌済みの1ミリリットルの血清ピペットを使用して、1ミリリットルのPREWARM 220ミリモルバルプロ酸またはVPAを取り出し、滅菌済みの50ミリリットルチューブに移します。

次に、滅菌血清ピペットを使用して、5ミリリットルのプレウォーム培地Bと44ミリリットルのプレウォーミング培地AをVPA溶液に加えます。これにより、50ミリリットルの新鮮な培地が得られ、最終濃度は4.4ミリモルのVPAになります。インキュベーターからトランスフェクションされた培養物を取り出します。

フラスコの外側を滅菌し、フラスコをバイオセーフティキャビネットに入れます。調製した希釈培地を培養物に加えます。フラスコをインキュベーターシェーカーに戻し、トランスフェクション後さらに4〜5日間待ちます。

前に示した手順により、細胞の生存率を毎日監視します。アリコートはまた、トランスフェクションの5〜6日後、または細胞の生存率が50%を下回った場合、細胞と培地を1000倍Gで5分間遠心分離することにより、タンパク質発現分析のために毎日保存する必要があります。分泌されたタンパク質を含む上清を10%漂白剤溶液の5ミリリットルでHEK細胞ペレットに収集し、バイオハザードとして廃棄します。

続いて、採取した上清からタンパク質を精製する。この発現系は、HK 2 93 F細胞の一過性トランスフェクション後、1fc後のIgGのこの典型的な発現パターンによって示される高収率のグリコシル化タンパク質を産生した。IgG one FC用のタンパク質カラムまたはヒスタミンタグ付きGFP用のニッケルカラムとFC γ受容体3 Aを使用したアフィニティー精製により、高純度のタンパク質が得られました。

このシステムは、水素原子核と直接結合したアミド窒素の共鳴周波数を相関させるこの2次元NMRスペクトルにおいて、同位体に富むIgGワンFCを効率的に発現し、15原子のシグナルがよく分散していることが観察されました。HEK 2 93 F細胞とHEK 2 93 s細胞では、マトリックス支援レーザー脱着イオン化質量分析で示されているように、異なる培養条件下で異なる糖型が産生されました。

HEK 2 93 s 細胞から発現した IgG 1 FC は、5 つのアノと 2 つの N アセチル グルコサミン残基を持つ形態で、HEK 2 93 F express 材料からの FU グルコース糖鎖を含まない形態のヒマンであり、コア FU グルコースを含み、ほとんどが末端 N アセチル グルコサミンまたは少量のモノまたは拡張型を持つ複雑なタイプの bi 旅程型でした。HEK 2 93 F細胞を用いて行った発現に糖鎖化阻害剤を添加すると、fucoの取り込みが90%以上減少しました。一度習得すると、一過性トランスフェクションの確立は、1日目に1.5時間、2日目に15分で完了することができます。4〜6日の発現期間の後、タンパク質を含む溶液は15分で回収できます。

最後に、この手順を試みている間、タンパク質の精製には約1.5時間かかりますが、トランスフェクション前に安定した培養を維持し、活発に増殖する細胞をトランスフェクションし、PEIを添加する前にDNAを添加することを覚えておくことが重要です。この手順に従います。発現した糖タンパク質の発生後の構造と機能を調べるために、さまざまな生物物理学的手法を用いたタンパク質の機能特性評価などの他の方法も実行できます。

この技術は、免疫学の分野の研究者がIgGとin vitroおよびin vivoでのグリコシル化の構造活性相関を探求する道を開きました。このビデオをご覧いただければ、K 2 93 F細胞とPZ N 2ベクターの組み合わせを使用して糖タンパク質を調製および精製する方法を十分に理解できるはずです。