Name: 懸濁液中のHEK293細胞の一過性トランスフェクションによる組換えヒトタンパク質のハイ・イールド式 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: 学ぶHEK293細胞を用いた一過性トランスフェクションによる組換えヒタンパク質の高効率発現法。ERとゴルジ体分泌経路を活用し、適切な糖鎖修飾を持つ糖タンパク質を免疫学研究に供給します。

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この作品は、財政補助金K22AI099165（AWB）により、P41GM103390（KWM）と国立衛生研究所からP01GM107012（KWM）、アイオワ州立大学の生化学、生物物理学＆分子生物学のロイ・J・カーバー部門からの資金によってサポートされていました。この作品の内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしもNIHの公式見解を示すものではありません。

すべての著者は、この原稿に競合する金銭的利益がないことを宣言しています。

このプロトコルは、S又はHEK293F細胞の一過性トランスフェクションを介してタンパク質発現を示す図です。バーブとMoremen研究室で確立最適なトランスフェクション条件は、高効率のトランスフェクションを達成するために、細胞密度および試薬濃度の重要な組み合わせを採用します。このプロトコルを実装する重要な考慮事項は次のとおりです（一貫性のある文化が倍加時間で）トランスフェクションの前に安定した文化を維持します。積極的に95％を超える細胞生存率に（トランスフェクションの前に/ mlで24時間、1×10 6個の細胞に細胞を希釈することによって達成される）細胞を増殖させるのトランスフェクション。トランスフェクション時の細胞密度は90％培地Aおよび10％B培地を含む培養における生存率&gt; 95％（トランスフェクションの密度）と6×10 2.5〜3.0の間の生細胞/ mlであるべきです。そして、31はそれぞれ、3 / mlのと9μgの/ mlの前のPEI添加にDNAを添加し;メディアコンタで1：24時間トランスフェクション後に培養液1に希釈され、2.2 mMの濃度をもたらすのにi...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/53568">High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension</a>. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1 
Roy W. Johnson2 
Heather A. Moniz2 
Kelley W. Moremen2 
Adam W. Barb1 
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University 
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia

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Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

構造および機能の詳細な分析のために適切に折り畳まれ、翻訳後修飾されたヒトタンパ​​ク質を高収率で製造することは重要な課題です。発現系が多数天然様の機能と動作を有する組換えタンパク質を産生すること可能です。酵母、植物、昆虫および哺乳動物系でもある1-4を説明しても細菌発現系、主に大腸菌株は、原因でこれらの発現系のシンプルさに、研究の分野で最もアクセスし、一般的に使用されるツールを表しています。しかしながら、これらのシステムの大部分は、標的タンパク質の適切な翻訳後修飾することができません。バーブとMoremen研究所の基本的な関心は、適切なグリコシル化と真核生物のタンパク質を生産しています。多くのヒトタンパク質（5を参照）適切な機能のために適切なグリコシル化を必要とします。 真核生物グリコシル化機構が広範かつ両方アスパラギン（N）を含む、修飾の多様を作成することが可能である-セリン/スレオニン（O）は、複雑なグリカン6 -結合しました。これは、ヒトタンパク質の&gt; 50％がN-グリコシル化7であると推定されています。グリカンは、少数を示すために、本質的な治療用モノクローナル抗体を含む多くのタンパク質の構成成分、エリスロポエチン、および第IX因子などの血液凝固因子です。複数のメソッドは、11-14または操作された組換えシステム15-20からの回復を化学酵素には、純粋に合成8-10から適切にN-グリコシル化タンパク質および範囲を準備するために存在するが、驚くことではないが、人間の発現系は、これまでで最も堅牢であることが証明されましたヒトタンパ​​ク質を生成するための方法。 多くの治療用のヒト糖タンパク質は、哺乳動物細胞を用いた組換え系において産生されます。ノートのシステムは、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）、マウス骨髄腫（NS0）、ベビーハムスターKidneですY（BHK）、ヒト胚性腎臓（HEK-293）及びタンパク質産生のために4,21,22接着または懸濁培養で使用されるヒト網膜細胞株。しかし、哺乳動物タンパク質発現系は、安定な細胞株の生成、高価な増殖培地と基板補助トランスフェクション手順23を必要としています。 哺乳動物細胞のトランスフェクションは、リン酸カルシウム24,25、カチオン性ポリマー（DEAE-デキストラン、ポリブレン、ポリリジン、ポリエチ（PEI））または正に荷電したカチオン性リポソーム26-29を含む多くの薬の助けを借りて達成されます。 PEIは26ポリカチオン性、荷電、直鎖状または分岐鎖状のポリマー（25 kDaの）であるDNAと安定な複合体を形成し、エンドサイトーシスされます。エンドソームの酸性化の際に、PEIは、エンドソームおよび細胞質26,30へのDNAの放出の破裂につながる、膨潤すると考えられています。 suspensiで最近まで、一過性トランスフェクション文化に細胞培養29に加え、続いて前に、DNA / PEI複合体形成することにより実施しました。しかし、ワームおよび共同研究者らは 、in situ 31,32 で DNA / PEI複合体を形成されたHEK293細胞における組換えタンパク質産生のために最適化された非常に効率的なプロトコルを報告しました。これは、培養培地中に調製、複合体の滅菌、および緩衝液交換を回避します。大幅な収量増加につながった33の発現増強プラスミドを含むことにより、さらなる最適化。ここでは、これらの進歩の上に構築し、広く適用可能である方法です。発現条件はまた、Nグリカン合成に影響を与えるように変更されてもよいです。 中間段階でのN-グリカンの処理を停止し、遺伝子欠失を有するHEK293S細胞株は、、グルコサミン（GlcNAc 2 の Man 5）34 2、N-アセチルグルコサミン残基に加えて5マンノース残基からなる均一なN-グリカンを有するタンパク質の発現をもたらします35。これらの細胞N-アセチルトランスフェラーゼI（GNTI）下流N-グリカン処理36,37のために必要とされる遺伝子を欠いています。キフネンシン、シアル酸類似体およびフコース類似体及び2-デオキシ-2-フルオロフコースなどのグリコシルトランスフェラーゼ阻害剤の使用は、同様の効果と、N-グリカンプロセッシング38-41限界があります。 プロトコルは、ここで報告された、図1 42,43、PEI支援過渡哺乳類細胞株（HEK293FまたはHEK293S細胞）へのトランスフェクション、および適切なグリコシル化タンパク質の高収量の回復に示すようにPGEN2ベクトルを使用しています。このシステムは堅牢であり、組換えタンパク質の大規模な力価の生産のための同位体標識およびグリカンエンジニアリングを含む様々な要因に対応することができます。

<table><tbody><tr><td>バイオセーフティキャビネット&nbsp;</td><td>NuAire, Inc. (英語)</td><td>CellGard ES NU-S475-400</td><td>Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet</td></tr><tr><td>Incubation Shaker</td><td>INFORS HT</td><td></td><td>Multitron Cell&nbsp;</td></tr><tr><td>Medium A: FreeStyle Expression Medium&nbsp;</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td>12338-018</td><td></td></tr><tr><td>ミディアム B:エクセル 293 無血清ミディアム&nbsp;</td><td>シグマ</td><td>14571C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>125 三角フラスコ(ベントキャップ付き</td>) <td>Corning Incorporated/Life Sciences</td><td>431143</td><td></td></tr><tr><td>250 三角フラスコ(ベントキャップ付き</td>) <td>Corning Incorporated/Life Sciences</td><td>431144</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle HEK 293F Cells</td><td>Life Technologies</td><td>R790-07</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 使い捨て血清ピペット</td><td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10B</td><td></td></tr><tr><td>10 mlディスポーザブル血清ピペット</td><td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>25 ml ディスポーザブル血清ピペット</td><td>Fisher Scietific</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>ピペッター (Pipet-Aid XP)</td><td>ドラモンドサイエンティフィ</td>ック <td>161263</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルー ソリューション&nbsp;</td><td>サーモサイエンティフィック&nbsp;</td><td>SV30084.01</td><td></td></tr><tr><td>スライドのカウント&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>TC20 自動セルカウンター&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド&nbsp;</td><td>145-0102</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン(PEI)</td><td>Polysciences Inc.</td><td>23966</td><td>25 mM 4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)と150 mM NaCl(pH 7.5)を含む緩衝液に1 mg / mlの濃度で原液を調製します。PEIを完全に溶解します。0.22 &mu;Mシリンジフィルターと-20°Cで保存します。</td></tr><tr><td>4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)</td><td>EMDケミカルズ(株)</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>25 mm シリンジ フィルター、0.22 &mu;M</td><td>Fisher Scietific</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>トリサミノメタン (トリス塩基)</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>XL1-Blue</td><td>Stratagene</td><td>222249</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP1421-2</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>Fluka Analytical&nbsp;</td><td>92144</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>BDH 化学薬品</td><td>BDH8014</td><td></td></tr><tr><td>プラスミド精製キット</td><td>QIAGEN</td><td>12145</td><td></td></tr><tr><td>バルプロ酸 (VPA)</td><td>SIGMA</td><td>P4543</td> 水中<td>で 220 mM のストック溶液を準備し、滅菌 0.22 mm フィルターを通過して滅菌し、-20 > で保存します。C</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>EW-17707-65</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質 A-セファロース カラム</td><td>SIGMA</td><td>P9424</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA スーパーフロー</td><td>QIAGEN</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>3-(N-モルフォリノ)プロパンスルホン酸 (MOPS)</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP308-500</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scietific</td><td>BP381-500</td><td></td></tr><tr><td>10 kDa 分子量カットオフ Amicon&reg;超遠心フィルター&nbsp;</td><td>ミリポア</td><td>UFC901096</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>ALDRICH</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>β-メルカプトエタノール</td><td>ALDRICH</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>SIGMA</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>プレシジョンプラスプロテイン オールブルースタンダード</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0373</td><td></td></tr><tr><td>酢酸、氷河&nbsp;</td><td>フィッシャーScietific</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>クーマシーブリリアントブルー&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド&nbsp;</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>MALDI-TOFMS ボイジャー・デ・プロ&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15N 標識 L-チロシン</td><td>ALDRICH</td><td>332151</td><td></td></tr><tr><td>15N 標識 L-リジン</td><td></td><td>ALDRICH 592900</td><td></td></tr><tr><td>非標識 L-フェニルアラニン</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>13C6-グルコース</td><td>ALDRICH</td><td>389374</td><td></td></tr><tr><td>2-デオキシ-2-フルオロ-l-フコース&nbsp;</td><td>サンタクルス</td><td>バイオテクノロジーsc-283123</td><td></td></tr></tbody></table>

懸濁液中のhek293細胞の一過性トランスフェクションによる組換えヒトタンパ​​ク質のハイ・イールド式

High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension

複雑な翻訳後修飾を有する組換えタンパク質を生産する技術は、構造と機能の研究のための主要な課題です。迅速な確立と一過性にトランスフェクト哺乳動物細胞株からの高回収はこの障壁に対処し、自然にERおよびゴルジ体媒介分泌経路を通って流れるされているタンパク質を発現する有効な手段です。ここで、高いタンパク質収率のために設計された哺乳動物発現ベクターでトランスフェクトしたヒトHEK293FおよびHEK293S細胞株を用いて、タンパク質発現のための1つのプロトコルです。このシステムの適用は、培養物1リットル当たり、回収、精製したタンパク質の95から120 mgの間の収率で表される3つの代表的な糖タンパク質を用いて実証されています。これらのタンパク質は、ヒトのFcγRIIIAおよびラットα2-6シアル酸転移酵素、ST6GalI、N末端GFP融合だけでなく、変更されていないヒト免疫グロブリンG1のFcと表現の両方です。この堅牢なシステムUTI質量分析および核磁気共鳴分光法を用いて、構造研究のための同位体濃縮タンパク質および炭水化物の発現のために適合可能である無血清培地をlizes。さらに、N-グリカンの組成物は、収率を低下させないようにして特定のグリカンの改変を防止するための小分子を添加することによって調整することができます。

高レベルのタンパク質発現および純度この最適化された発現系は、グリコシル化タンパク質の高い収率を生じました。典型的なパターンのIgG1-Fcと（ 図1）の式に示されています。この場合は、0日目、粗培地中の可溶性発現の割合を用いて分析されて5日目タンパク質発現までの1日目（希釈）に続いて、トランスフェクションの日とその後の培養の日です。培養物のアリコートを培養希釈後3時間に回収されたようなタンパク質発現の非常に少量の1日目に観察されました。これは、培養培地中で明確な緑の色を表示GFPタグ付きタンパク質を可視化することが容易です。このような増加は、5日目4日目と5日目の間で観察された5日目に2日目からのGFP-FcγRIIIAおよびGFP-ST6GalIの発現のための発現の有意な増加が観察されず、細胞があった&lt;50％実行可​​能なので、培養物は、タンパク質分解を制限するために回収しました。収率（ 表1）...

適切な翻訳後修飾を伴う真核生物タンパク質の実験室規模での生産は、大きな障壁を表しています。ここでは、哺乳類の発現システムを使用したタンパク質発現の迅速な確立とターンアラウンドを実現する堅牢なプロトコールをご紹介します。このシステムは、選択的アミノ酸、タンパク質の選択的標識、および糖鎖組成の低分子モジュレーターをサポートします。

懸濁液中のHEK293細胞の一過性トランスフェクションによる組換えヒトタンパ​​ク質のハイ・イールド式

The art of producing recombinant proteins with complex post-translational modifications represents a major challenge for studies of structure and ...

本手順の全体的な目的は、リコンビナントタンパク質を小胞体（ER）およびゴルジ体介在性分泌経路に標的化することで、適切な哺乳類型糖鎖修飾を伴う哺乳類糖タンパク質を発現させることです。この手法は、特定の糖鎖の役割や、抗体および抗体フラグメントの構造パターンと免疫活性化能など、免疫学における重要な疑問を解決するのに役立ちます。本手法の主な利点は、ヒト細胞を用いてヒトタンパク質を発現させるため、標的タンパク質を適切に折り畳み、修飾するための適切な細胞内環境が得られることです。細胞構築に使用するインキュベーターシェーカーは、培養接種の少なくとも1時間前から、135 RPM、湿度80%、二酸化炭素8%、37 °Cで運転させておきます。バイオセーフティキャビネットのUVランプを点灯させ、密封された培地Aおよび培地Bのボトルを37 °Cのウォーターバスで予熱します。UVランプを消灯し、70%エタノール水溶液でバイオセーフティキャビネット内を滅菌します。ベントキャップ付きの125 mLエルレンマイヤーフラスコ、ピペット、ピペッター、および予熱した培地ボトルに70%エタノール水溶液をスプレーして滅菌します。これらの器具はこの手順の間、バイオセーフティキャビネット内に配置してください。バイオセーフティキャビネット内に持ち込むすべての物品は、この方法で滅菌する必要があります。培地Aを26 mL、培地Bを3 mL分注して125 mLのエルレンマイヤーフラスコに移し、30 mL分の新鮮な培養培地を調製します。緩やかに振盪して混ぜ合わせます。-80°Cで凍結保存されていたHEK 293 F細胞のバイアルを37°Cの水槽で加温し、細胞を部分的に融解させます。この操作には約1分かかりますが、細胞を完全に融解させないように注意してください。次に、バイアルの外側を70%エタノール水溶液で滅菌し、バイオセーフティキャビネット内へ移動させます。1 mLピペットを用いて細胞懸濁液を分注し、29 mLの新鮮な培地が入った125 mLエルレンマイヤーフラスコに移します。培養フラスコの蓋を閉め、フラスコをインキュベーターシェーカーに設置して24時間培養します。培養接種から24時間後。細胞密度を確認し、培養フラスコを70%エタノール水溶液で滅菌してからバイオセーフティーキャビネット内に移動させる。1 mLピペットとピペッターを用い、培養液100 µLをゆっくりと分取し、滅菌済みの0.5 mLエッペンドルフチューブに移す。培養フラスコの蓋を閉じ、速やかに培養フラスコをインキュベーターシェーカーに戻します。7.5 µLのトリパンブルー溶液と7.5 µLの細胞を混合します。激しく混ぜ合わせた後、混合液 7.5 µLを計数用スライドに転送します。自動細胞計数器の電源を入れ、計数スライドをロードチャンバーにセットします。自動リーダーが起動し、細胞数が 1 mL あたりの細胞数および生存率（%）の単位で自動的に計数されます。新鮮な培地へ移行させ、細胞密度を 300,000 live cells/mL にするために必要なドナー培養液の量を決定します。以前に示した方法に従い、培地Aを23 milliliters、培地Bを3 milliliters、新しい125 milliliter培養フラスコに移して新鮮な培養培地を調製します。その後、汚染のリスクを軽減するため、培地Aと培地Bのストックボトルをバイオセーフティーキャビネットから取り出します。インキュベーターからHEK 2 93 F細胞培養フラスコを取り出します。70%エタノール水溶液をスプレーし、バイオセーフティキャビネット内に配置します。新しいピペットを使用して、培養液から適切な分量の細胞を分注し、新鮮な培地を含むフラスコに移します。両方の培養物をバイオセーフティキャビネットからインキュベーターシェーカーへ移動させます。トランスフェクション前に、細胞を1mLあたり約200万から300万個の生存細胞密度まで増殖させます。先に示した方法で細胞密度を確認し、トランスフェクションに使用する細胞量を決定します。滅菌済みのセロロジカルピペットを使用してください。適切な量の細胞懸濁液を250 milliliter遠心チューブに移します。100 ×gで5分間遠心分離し、細胞を回収します。滅菌後、細胞ペレットの入ったチューブをバイオセーフティキャビネット内に移します。滅菌ピペットを使用して、使用済みの培地からなる上清をデカンテーションにより除去します。10 millilitersの新鮮な培養培地を用いてピペッティングを行い、ペレット化した細胞を激しく再懸濁し、新鮮なトランスフェクション用培養培地を入れた調製済みフラスコに移します。通気口付き細胞培養フラスコのキャップを締め、細胞をインキュベートしながら、インキュベーターシェーカーで15分から1時間インキュベートします。血漿DNAおよびPOLYETHERAMINE（またはPEI）のストック溶液を、新鮮な培地を用いて最終濃度0.5 µg/µLまで希釈します。細胞を分散させた培養フラスコをインキュベーターシェーカーから取り出し、バイオセーフティキャビネットへ移動させます。マイクロピペットを用いて300 µLの血漿DNAを培養液に加え、緩やかに手で振って混ぜ合わせます。続いて900 µLのPEIを培養液に加え、再度混ぜ合わせます。その後、3.8 mLの新鮮な培地を加えます。フラスコをインキュベーターシェーカーに移し、24時間培養します。トランスフェクションの24時間後に、細胞培養液を希釈する必要があります。まず希釈培地を調製するため、滅菌済みの1 mLセロロジカルピペットを用いて、あらかじめ温めておいた220 mMのバルプロ酸（VPA）を1 mL分分注し、滅菌済みの50 mLチューブに移します。次に、滅菌済みのセラロジカルピペットを用いて、VPA溶液に予め温めておいたMedium Bを5 mL、Medium Aを44 mL加えます。これにより、最終濃度が4.4 mMのVPAを含む新鮮な培養液が50 mL調製されます。インキュベーターから、トランスフェクション後の培養物を回収します。フラスコの外面を滅菌し、バイオセーフティキャビネット内に配置します。調製した希釈培地を培養液に加えます。トランスフェクション後、さらに4〜5日間、フラスコをインキュベーターシェーカーに戻して培養します。先に示した手順に従い、細胞生存率を毎日モニタリングしてください。また、タンパク質発現解析のために、トランスフェクションから5〜6日後、または細胞生存率が50%を下回った時点で回収できるよう、毎日分注して保存しておく必要があります。細胞と培地を1000 ×gで5分間遠心分離して細胞を回収します。分泌タンパク質を含む上清を回収し、HEK細胞ペレットに10%漂白剤溶液5 mLを加えてバイオハザードとして廃棄してください。その後、回収した上清からタンパク質を精製します。この発現系は、HK 2 93 F細胞への一過性導入後におけるIgG one fcの典型的な発現パターンに示されるように、糖鎖付加タンパク質の高収量な生成を可能にしました。IgG one FC用タンパク質カラム、またはFC gamma receptor three Aを結合させたヒスチジンタグ付きGFP用ニッケルカラムを用いたアフィニティー精製により、高純度のタンパク質が得られました。このシステムにより、水素原子核と直接結合したアミド窒素の共鳴周波数を相関させたこの2次元NMRスペクトルにおいて、同位体標識 IgG one FC が効率的に発現しました。15 atoms の分散した良好なシグナルが確認されました。マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析（MALDI-MS）による解析で示されるように、異なる培養条件下で HEK 2 93 F 細胞および HEK 2 93 s 細胞を用いて、異なる糖鎖形態が生成されました。HEK 293S細胞から発現したIgG1 Fcは、5つのマンノースと2つのN-アセチルグルコサミン残基からなる形態の糖鎖を保持しており、フコース含有糖鎖は含まれていなかった。一方、HEK 293F発現材料からは、コアフコースを持つ複合型ビアンテナ形式の糖鎖が得られ、その大部分は末端にN-アセチルグルコサミンを有しており、少割合でモノまたはジアンテナ形式であった。HEK 293F細胞を用いた発現において糖鎖付加阻害剤を添加したところ、フコースの取り込みが90%以上減少した。一度習得すれば、一過性トランスフェクションの確立は1日目に1.5時間、2日目に15分で完了できる。4～6日間の発現期間後、タンパク質を含む溶液を15分で回収することが可能である。最後に、タンパク質の精製には約1.5時間かかります。この手順を行う際は、トランスフェクション前に安定した培養状態を維持し、活発に増殖している細胞にトランスフェクションを行い、PEIを添加する前にDNAを添加することを忘れないでください。本手順に続き、発現した糖タンパク質の構造と機能を調査するために、さまざまな生物物理学的手法を用いたタンパク質の機能特性解析などの他の手法を実施することが可能です。この手法は、免疫学分野の研究者がIgGと糖鎖付加の構造活性相関をin vitroおよびin vivoで探索するための道を切り拓きました。このビデオを視聴することで、K 2 93 F細胞とPZ N twoベクターを組み合わせて糖タンパク質を調製および精製する方法について、十分に理解することができます。

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Biology

生物学

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懸濁液中のHEK293細胞の一過性トランスフェクションによる組換えヒトタンパ​​ク質のハイ・イールド式

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