自動化を使用して染色体のハイスループット物理マッピングその場でハイブリダイゼーション

この手順の全体的な目標は、高圧染色体調製物を使用してDNAプローブを蚊のポリタン染色体にマッピングし、続いて自動蛍光in C 2ハイブリダイゼーションと自動イメージングを行うことです。これは、最初に高圧法を使用してポリタン染色体スプレッドを調製することによって達成されます。次のステップは、Nick翻訳プロトコルを使用してゲノムバックDNAを蛍光色素で標識することにより、蛍光プローブを調製することです。

第3のステップは、自動スライド染色システムを使用して蛍光in C 2ハイブリダイゼーションを行うことです。最後のステップは、自動蛍光イメージングシステムを使用して標識された染色体をスキャンして撮影することです。最終的に、画像はポリ染色体上の蛍光標識DNAプローブの局在を示すことができます。

この手法や既存の方法(標準的なマニュアルin situハイブリダイゼーションプロトコルなど)の主な利点は、最高スループットの物理マッピングプロトコルにより、より一貫性のある結果が得られ、ハンズオン時間が劇的に短縮されることです。このプロトコルは、クリストファーのステージ3にあるときに卵巣を採取するために、授血後約25時間で半重力とオリーのメスを解剖することから始まります。この段階では、卵胞内にナース細胞がある透明な領域は丸い形をしており、5人の女性から卵巣を集めて、新しく作られた改造車の騒音溶液の500マイクロリットルに固定する必要があります。

その後、室温で最大24時間、またはマイナス20°Cでそれ以上保存できます。次に、卵巣解剖スライドを作成する直前に、車の騒音溶液と50%プロピオン酸を準備します。卵巣の各ペアを、解剖顕微鏡下のほこりのないスライド上の新鮮な車の騒音溶液の滴に入れます。

解剖針で卵巣を分割します。すべての卵巣片を50%プロピオン酸を含む6つのきれいなスライドに移します。解剖針を使用して卵胞を互いに分離します。

その後、残ったティッシュペーパーをペーパータオルで拭き取ります。さらに50%プロポン酸を一滴加え、3〜5分待ちます。伝説では、卵胞が50%プロポン酸に3〜5分間座ると、染色体の広がりが大幅に向上します。

次に、カバースリップを貼り、さらに1分待って核を広げます。スライドを濾紙とプラスチックで包みます。ドレメルを3〜5、000 RPMに設定し、約1分間、回転するドレメルの先端をカバースリップに対して軽く渦巻きました。

位相顕微鏡で広がりの品質を確認し、必要に応じてドレメルを長く塗布して染色体を平らにします。2枚目のカバースリップを1枚目のカバースリップに隣接して置き、カバースリップを別の顕微鏡で挟みます。次にスライドし、スライドをプラスチックシートと濾紙で包み、ラップスライドを万力に入れてスライドを85〜120インチポンドに絞ります。

6つのスライドすべての染色体を平坦化した後、スライドを開封し、余分なスライドを取り出して染色体をさらに平らにします。スライドを55°Cで10〜15分間、スライド変性ハイブリダイゼーションシステムでインキュベートします。次に、スライドを液体窒素に少なくとも15秒間、またはバブリングが止まるまで浸します。

次に、かみそりの刃でカバースリップをすばやく取り外し、すぐにスライドを冷たい50%エタノールに5分間置きます。このプロセスをスライドごとに順番に繰り返します。スライドを70%a、90%、100%エタノール浴で脱水します。

それらを各バスに5分間浸します。最後に、スライドが自然乾燥した後、魚を染色する準備が整います。自動化されたデバイスは、プローブのラベリングを除く手順のほとんどのステップを実行します。

したがって、デバイスをロードする前に、プローブを準備した状態で市販のNIC変換プロトコルを使用して蛍光色素でDNAを標識し、蛍光プローブを準備し、スライドと試薬を自動スライドにロードします。システムを染色し、次の手順を実行するようにシステムをプログラムします。まず、800マイクロリットルの1つのXPBSを20分間供給します。

次に、スライドをブロードライします。第三に、スライドを450マイクロリットルの4%ホルマリンで1つのXPBSに1分間固定します。次に、スライドを100%エタノールで1秒間、2回、2分間洗浄します。

エタノール浴後、スライドを再度ブロードライします。次に、滑り台を摂氏45度で2分間加熱して、泡立ちを防ぎます。次に、20マイクロリットルのDNAプローブを適用し、続いて鉱油を一滴垂らし、次に自然界のカバースリップ、90°Cの染色体を10分間適用します。

次に、スライドを摂氏42度で14時間ハイブリダイズするように設定します。ハイブリダイゼーションを設定した後、ストリンジェンシーを摂氏42度で2分間洗浄し、続いて2つのXSSCを1秒間連続して塗布し、乾燥させます。次に、800マイクロリットルの0.4 XSSCを摂氏42度で10分間2回塗布し、続いてさらに1回洗浄し、25°Cで2回のXSSCを10分間塗布します。

次に、50マイクロリットルのヨーヨーを染色し、続いてミネラルオイルとカバースリップを塗布します。スライドを摂氏25度で10分間インキュベートします。次に、カバースリップを取り外します。

スライドを2つのXSSCで1回の洗浄につき1秒間4回洗浄し、スライドをブローして乾かします。最後に、15マイクロリットルの長期の金色あせ防止試薬を各スライドに塗布し、新しいカバースリップを取り付けます。アコードプラス自動スキャンシステムの電源を入れます。まず、ハロゲン電球用のオリンパスU-R-F-L-T電源を皮

次にコンピューター、最後にカメラアタッチメント付きの顕微鏡。次に、最初にデュエットソフトウェアパッケージを開き、10 xプリスキャンを設定します。オンラインボタンをクリックし、新しいケースIDを入力して、スライドIDを割り当てます。

bf というラベルの付いたドットをクリックします。これは明視野オプションです。スキャンの選択肢として 10 x プレスキャンを選択します。

2, 500 x 円、10, 000 x 円または長方形を選択します。[設定して実行] をクリックします。次に、プロンプトに従ってスキャンを適切に調整し、[完了]をクリックします。

スキャンを開始するには、メインタブを押してメイン画面に戻ります。次に、オフラインボタンをクリックして、割り当てられたケースIDとスライドIDを見つけます。そして、[オフライン]をクリックします。

左上の領域にあるブラックボックスをスキャンします。矢印をクリックして、[10 x pre-scan] を選択します。目的の画像を見つけたら、矢印を使用してスキャンした画像を確認します。

対象領域の中央にある画面をダブルクリックし、スナップを押します。これにより、すべてのターゲットを選択した後でキャプチャする画像がターゲットになります。各画像を右クリックし、[分類]をクリックして[10 xプレスキャン]を選択し、[ポリタン]を選択します。

メインメニューに戻り、40 x プリスキャンを設定します。もう一度「オンライン」を選択し、スライドを選択します。BF を ffl に変更し、タスク名を revisit dash X 40 dash rg に変更します。

最後の設定のすぐ下にあるセクションを変更して、すべてをダッシュし直します。次に、プログラムを実行し、プロンプトに従います。自動化を設定するには、[ビューの照合を開始] ボタンをクリックして、10 x 画像と 40 x 画像を一致させます。

「完了」をクリックしてスキャンを開始します。完了したら、[分類] をクリックして画像を確認します。女性異常ガンビアからの卵巣看護師細胞ポリタン染色体の調製は、高圧技術を使用して行われました。

この方法では、染色体構造のほとんどを損傷したり変化させたりすることはありません。曲がった染色体を平らにすることで、通常の製剤では見られない隠れた細いバンドが現れます。染色体は、異常のSガンビアとタムバックライブラリーから得られたバックDNAクローンでプローブされました。

ライブラリは、異常なSガンビア害虫株のスター幼虫のオスとメスから最初に生成されました。この手順に続いて、染色体ベースのゲノムアセンブリの迅速な開発を容易にするために、自動化されたハイスループット物理マッピングを実行できます。