Name: 自動化を使用して染色体のハイスループット物理マッピングその場でハイブリダイゼーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: 学ぶ、高圧染色体標本法と自動化蛍光インプラントハイブリダイゼーションを用いた蚊の多線染色体へのDNAプローブマッピング法。自動化システムが物理マップ作成の効率と再現性を向上させ、ゲノムアセンブリの品質改善に貢献する。

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本研究は、National Institutes of Healthからの助成金1R21AI094289（Igor V. Sharakhov宛）による支援を受けて行われました。Xmatrx 自動スライド染色システムおよびACCORD PLUS 自動スキャニングシステムは、Virginia TechのFralin Life Science Institute、昆虫学部および生化学学部のEquipment Trust Fundプログラムの支援により購入されました。

1. 卵巣栄養細胞からの高圧ポリテン染色体標本作製
<ol>
	<li>吸血後25時間の半飽和状態のAnophelesメスを解剖顕微鏡下で解剖し、メタノールを用いた修正カルノア液（100%メタノール：氷酢酸＝3:1）で卵巣を固定する。この段階の卵巣は、濾胞が楕円形となり、濾胞内の栄養細胞を含む透明領域が円形になるChristophersの第III発育段階にある13。約5匹のメスから採取した卵巣を、1.5 mlのエッペンドルフチューブに入れた500 μlの修正カルノア液に加え、室温で24時間保持する。長期保存する場合は、卵巣を-20 °Cに移す。</li>
	<li>スライド作成の直前に、エタノール（100%エタノール：氷酢酸＝3:1）と50%プロピオン酸を用いた修正カルノア液を調製する。ダストフリーのスライド上に修正カルノア液を1滴滴下し、そこに1対の卵巣を置く。Leica MZ6解剖用実体顕微鏡下で、解剖針を用いて卵巣を約6つのセクションに分割し、清潔なスライド上の50%プロピオン酸の滴の中に配置する。各セクションに別のスライドを使用すること。</li>
	<li>解剖針を用いて濾胞を分離し、解剖顕微鏡下で濾過紙またはペーパータオルを用いて残りの組織を拭き取る。濾胞に50%プロピオン酸を新しく1滴加え、室温で3〜5分間静置する。50%プロピオン酸の滴の上にカバーガラスを被せ、約1分間静置する。</li>
	<li>スライドを濾過紙とプラスチックで包む。Flex-Shaftアタッチメントとソフトプラスチックチップを装着したDremel 200ロータリーツールを用い、回転数を3000-5000 RPMに設定して、チップを円を描くように動かしながらカバーガラスを軽く押し、核を均一に広げる。この工程には約1分かかる。Olympus CX41位相差顕微鏡の20倍対物レンズを用いて、分散の質を確認する。</li>
	<li>染色体を覆っているカバーガラスの隣に別のカバーガラスを配置し、その上から2枚目の顕微鏡スライドで覆い、サンドイッチ状にする。これにより、万力でスライドを押し潰すリスクを軽減できる。スライド容器に付属しているプラスチックシートと濾過紙でサンドイッチを包み、万力によるスライドの傷を防ぐ。</li>
	<li>機械式万力を用いてスライドに圧力をかける。トルクレンチを用いて85-120 inch-lbsの圧力をかければ十分である。この工程は、染色体を最大限に平坦化するために必要である。</li>
	<li>2枚目の顕微鏡スライドと追加のカバーガラスを取り除く。染色体を覆うカバーガラス付きのスライドを、スライド変性・ハイブリダイゼーションシステムを用いて55 °Cで10〜15分間加熱し、染色体をさらに平坦化する。スライドを液体窒素に少なくとも15秒間浸し、気泡が出なくなったところで、カミソリを用いて素早くカバーガラスを取り除く。直ちにスライドを冷えた50%エタノールに5分間浸す。70%、90%、100%エタノールの順に、それぞれ5分間浸してスライドを脱水する。スライドを風乾させる。</li>
</ol>
2. 自動スライド染色システムを用いたFISH法
プローブの標識を除き、Xmatrx自動スライド染色システムを用いて、以下のステップを実行するようにプログラムを設定します。詳細なニックトランスレーション標識プロトコルについては、Fermentas社のDNA polymeraseに付属の説明書に記載されています。
<ol>
	<li>FISHを行う前に、ニックトランスレーション法を用いてゲノムBAC DNAをフルオロクロムで標識し、蛍光プローブを調製する。1 μgのDNA、0.05 mMずつの非標識dATP、dCTP、dGTP、0.015 mMのdTTP、1 μlのCy3-またはCy5-dUTP、0.05 mg/mlのBSA、5 μlの10xニックトランスレーションバッファー、20 unitsのDNA polymerase I、0.0012 unitsのDNase Iを加え、ヌクレアーゼフリー水で25 μlにする。DNA polymerase IとDNase Iの比率は、プローブのサイズが300から500 bpの範囲になるよう経験的に選択する。混合液を15 °Cで1時間インキュベートする。</li>
	<li>スライドと試薬をXmatrx自動スライド染色システムにセットし、以下のステップを実行するプログラムを開始する。1x PBS 800 μlを20分間適用する。エアブローでスライドを乾かす。1x PBS調製4%ホルマリン 450 μlを1分間適用してホルマリン固定を行い、続いて100%エタノールで1秒間の洗浄を2回、2分間の洗浄を1回行う。エアブローでスライドを乾かす。</li>
	<li>プローブ適用時の気泡発生を防ぐため、スライドを45 °Cで2分間加熱する。DNAプローブ 20 μlを適用し、ハイブリダイゼーション溶液の蒸発を防ぐためにミネラルオイルを滴下し、カバーガラスを被せる。スライドを90 °Cで10分間加熱し、染色体とDNAプローブを変性させる。</li>
	<li>ハイブリダイゼーションのため、カバーガラスを被せたままスライドを42 °Cで14時間インキュベートする。ハイブリダイゼーション溶液は、ホルムアミド中の2x SSC、100 mMリン酸ナトリウム、1x Denhardt's solution、100 μg/mlアジ化ナトリウム、および10%デキストラン硫酸で構成される。</li>
	<li>ストリンジェンシー洗浄のため、スライドを42 °Cで2分間加熱し、カバーガラスを取り除き、2x SSCで1秒間の洗浄を4回行う。エアブローでスライドを乾かす。0.4x SSC 800 μlを42 °Cで10分間、2回適用する。25 °Cの2x SSCでスライドを10分間洗浄する。</li>
	<li>1x PBS調製1 μM YOYO-1 50 μlを適用して染色体染色を行う。染色溶液の蒸発を防ぐためにミネラルオイルを滴下し、カバーガラスを被せ、25 °Cで10分間インキュベートする。カバーガラスを取り除き、2x SSCで1秒間の洗浄を4回行う。エアブローでスライドを乾かす。ProLong Gold抗退色剤 15 μlを適用し、カバーガラスを被せる。</li>
</ol>
3. 自動蛍光イメージングシステムによるスライドの読み取り
このセクションでは、ACCORD PLUS自動スキャニングシステムに標準搭載されているDuetソフトウェアの使用方法について詳述します。手順は、以下の順で電源を入れた後に開始してください：ハロゲンランプ用電源 Olympus U-RFL-T、コンピュータ Dell precision T3500、およびカメラ Olympus U-CMAD3を接続した顕微鏡 Olympus BX61。
<ol>
	<li>10x Pre-Scanを設定するには、ACCORD PLUS自動スキャニングシステムのDuetソフトウェアを開きます。「Online」ボタンをクリックします。新しいCase IDを入力し、Slide IDを割り当てます。「BF」と表記されたドットをクリックします。これが明視野オプションです。スキャン選択を「10x Prescan」に設定します。「2500x circle」、「10000x circle」、または「rectangle」を使用します。10x Pre-Scanのために「Set&amp;run」をクリックします。</li>
	<li>「OK」ボタンをクリックして10x Pre-Scanを実行します。プロンプトに従ってスキャニングを適切に調整します。「Finish」をクリックしてスキャンを開始します。「Main」タブを押してメイン画面に戻ります。「Offline」ボタンをクリックします。割り当てられたCase IDとSlide IDを見つけ、「Offline Scan」をクリックします。左上領域の黒いボックスにある矢印をクリックし、「10x Prescan」を選択します。矢印（&lt; || Δ &gt;、いわゆる「戻る」、「一時停止」、「再生」、「進む」ボタン）を使用して、スキャンされた画像を確認します。</li>
	<li>関心のある画像を見つけたら、ターゲット領域の中央を画面上でダブルクリックし、「Snap」を押します。これにより、後でキャプチャする画像としてターゲットが設定されます。すべてのターゲットを選択した後、「Classify」をクリックします。「10x Prescan」を選択します。画像を右クリックして、画像の分類を行います。「Polytene」を選択します。</li>
	<li>Duetソフトウェアで40x Pre-Scanを設定します。「Main」をクリックしてメインメニューに戻ります。再度「Online」を選択します。スライドを選択します。「BF」を「FL」に変更します。タスク名を「Revisit-X40-RG」に変更します。最後の設定の直下のセクションを「Revisit-ALL」に変更します。「Set&amp;Run」をクリックします。「OK」を押します。再度プロンプトに従ってオートメーションを設定します。「Start matching views」ボタンをクリックして、10x画像と40x画像を照合させます。「Finish」をクリックしてスキャンを開始します。完了後、「Classify」をクリックして画像を確認します。</li>
</ol>
4. 代表的な結果
図1は、高圧染色体標本作成の概略図である。この工程には、Dremelツールとメカニカルバイスを用いた染色体の押しつぶしおよび平坦化プロセスと、位相差顕微鏡を用いた染色体の視覚化が含まれる。図2は、自動スライド染色システムを用いた染色体スライド標本上の標的DNAへの蛍光標識プローブのハイブリダイゼーション、FISH実験後のプローブの視覚化およびマッピングのための自動スキャン顕微鏡の使用、ならびに染色体へのゲノムスキャホールドの配置と方向付けを示している。
An. gambiaeの雌の卵巣栄養細胞から多染体染色体を調製するため、高圧法を用いた。この手法では、染色体構造の大部分に損傷や変化を与えない（図 3）。また、曲がった染色体を平坦化するため、通常の標本では見られない隠れた微細帯を明らかにすることができる（図 4）。
本プロトコルで使用したプローブは、An. gambiae PEST系統のDNAから作製されたND-TAM BACライブラリーから得られたゲノムBAC DNAクローンである。このライブラリー用のゲノムDNAは、雌雄両方の孵化したばかりの1齢幼虫から抽出した。 Figure 5は、An. gambiaeの多糸染色体にハイブリダイズさせたBACクローンを用いたFISHの結果を示している。この手順は、Xmatrx自動スライド染色システムを用いて実施した。An. gambiaeの細胞遺伝学的フォトマップ10を用いて、2つのBACクローン、102B24（GenBank: BH372701, BH372694）およびBAC 142O19（GenBank: BH368703, BH368698）は、それぞれ2R腕の区分16Cおよび16Dに局在していた。しかし、An. gambiae PEST系統のAgamP3アセンブリ14に対するBLAST検索では、102B24および142O19に相同な配列は、それぞれ2R腕の区分16Bおよび17Aで特定された（Table 1）。したがって、ゲノム座標と細胞遺伝学的区分の対応関係を、我々のマッピングデータに基づいて調整することが可能となった。An. gambiae M型およびS型のゲノムアセンブリに対するBLAST検索の結果、これら2つのBACクローンは、各型において異なるコンティグにあるが、同一のスキャフォールド内に位置していることが分かった（Table 1）。これにより、特定されたコンティグを特定の染色体位置に関連付けることができる。さらに、特定されたスキャフォールドを細胞学的区分16CD内で適切に方向付けることができる。興味深いことに、スキャフォールドにおける102B24と142O19の配列間の距離は、PEST系統、M型、S型のゲノムアセンブリにおいて、それぞれ1,892,981 bp、1,658,391 bp、1,688,426 bpであった。PEST系統はM型とS型のハイブリッドであるため、この差はPESTゲノムのアセンブリミスに起因する可能性が高い。
<table border="1">
	<tbody >
		<tr >
			<td >BAC 
			(アクセッション番号)</td >
			<td >PEST系統 
			AgamP3 
			 
			座標</td >
			<td >M-form 
			コンティグ 
			 
			座標</td >
			<td >M-form 
			スキャフォールド 
			 
			座標</td >
			<td >S-form 
			コンティグ 
			 
			座標</td >
			<td >S-form 
			スキャフォールド 
			 
			座標</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >102B24 
			(BH372694)</td >
			<td >2R:AAAB0100 
			8844_26 (16B) 
			 
			43,681,342- 
			43,681,874</td >
			<td >ABKP020247 
			53.1 
			 
			32,513- 
			33,045</td >
			<td >EQ090167.1 
			 
			1,858,377- 
			1,858,909</td >
			<td >ABKQ010123 
			32.1 
			 
			4,299- 
			4,832</td >
			<td >EQ099711.1 
			 
			215,891- 
			216,424</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >102B24 
			(BH372701)</td >
			<td >2R:AAAB0100 
			8844_28 (16B) 
			 
			43,788,213- 
			43,788,969</td >
			<td >ABKP020247 
			51.1 
			 
			24,816- 
			25,575</td >
			<td >EQ090167.1, 
			 
			1,772,683- 
			1,773,442</td >
			<td >ABKQ010123 
			35.1 
			 
			27,782- 
			28,540</td >
			<td >EQ099711.1, 
			 
			305,514- 
			306,272</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >142O19 
			(BH368698)</td >
			<td >2R:AAAB0100 
			 
			8805_5 (17A) 
			45,428,580- 
			45,429,264</td >
			<td >ABKP020247 
			01.1 
			 
			2,499- 
			3,185</td >
			<td >EQ090167.1 
			 
			315,806- 
			316,492</td >
			<td >ABKQ010123 
			76.1 
			 
			49,242- 
			49,942</td >
			<td >EQ099711.1 
			 
			1,791,625- 
			1,792,325</td >
		</tr >
		<tr >
			<td >142O19 
			(BH368703)</td >
			<td >2R:AAAB0100 
			8805_8 (17A) 
			 
			45,560,099- 
			45,574,323</td >
			<td >ABKP020220 
			17.1 
			 
			30,971- 
			32,469</td >
			<td >EQ090167.1 
			200,518- 
			202,016</td >
			<td >ABKQ010123 
			79.1 
			 
			27,760- 
			28,508</td >
			<td >EQ099711.1 
			 
			1,903,569- 
			1,904,317</td >
		</tr >
	</tbody >
</table>
表 1. An. gambiae のゲノムアセンブリに対するBAC末端配列のBLAST検索結果。
<img alt="蚊の卵巣解剖；解剖顕微鏡；染色体標本作製；位相差顕微鏡。" src="/files/ftp_upload/4007/4007fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 1"> 
図 1. 高圧染色体標本作製の概略図。適切な発生段階にある蚊の卵巣が示されている。
<img alt="自動スライドハイブリダイゼーションおよびスキャニング顕微鏡を用いた染色体マッピング用のプローブ標識。" src="/files/ftp_upload/4007/4007fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 2"> 
図 2. 自動FISH、スライドスキャニング、およびゲノムスキャフォールドの染色体マッピングを示す概略図。
<img alt="ポリテン染色体の構造、顕微鏡画像、DNAバンドパターン解析、遺伝学研究。" src="/files/ftp_upload/4007/4007fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図3"> 
図3. 高圧法を用いて得られた An. gambiae のポリテン染色体3の展開図。3Lおよび3Rは、それぞれ左腕と右腕のテロメアを示す。PHおよびIHは、それぞれ中心節近傍ヘテロクロマチン（pericentric heterochromatin）と間在ヘテロクロマチン（intercalary heterochromatin）を示す。
<img alt="異なる圧力下での3R/3L染色体帯パターンの比較顕微鏡写真" src="/files/ftp_upload/4007/4007fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 4"> 
図 4. 従来の手法（上）と高圧手法（下）を用いて調製したAn. gambiaeの多糸染色体の比較。画像は、3R腕の29A-30E（A）および3L腕の43D-46D（B）の区分を示している。
<img alt="ショウジョウバエ多糸染色体における染色体マッピング、蛍光マーカー、および遺伝子座の図解。" src="/files/ftp_upload/4007/4007fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="図 5"> 
図 5. An. gambiaeの多糸染色体に対するBACクローンのFISH。A) 2R腕における102B24（赤色信号）のハイブリダイゼーション。B) 伸展させた2R腕の分節16Cおよび16Dに対する、102B24（赤色信号）および142O19（青色信号）のデュアルカラーFISH。矢印は、Cy3（赤）およびCy5（青）で標識したBACクローンのハイブリダイゼーション信号を示す。Cは中心体領域。a/+はヘテロ接合体2La逆位を示す。染色体は蛍光色素YOYO-1で対比染色した。

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</ol>

申告すべき利益相反はありません。

高圧法の最も重要なステップは、卵巣発達のChristophers' III stage13で単離された卵巣栄養細胞を適切に潰す（スクワッシングする）ことです。適切に潰せていない場合、染色体が十分に伸展せず、FISH後のプローブ位置の特定に支障をきたす可能性があります。一方で、潰しすぎると、染色体が断裂したり、バンドパターンが消失するほど伸長したりすることがあります。Dremelツールを用いて複数のスライドを作成することで、潰し方の習熟による一貫性が得られ、全体的なスライド作成効率が向上します。この高圧法は、もともとD. melanogasterの新鮮に単離した唾液腺のために開発された手法です9。しかし、蚊の卵巣は通常、染色体標本作製に使用される前に、修正Carnoy固定液（メタノール：氷酢酸＝3：1 体積比）で保存されています。そのため、私たちは既存の高圧プロトコルを修正し、マラリア蚊An. gambiaeの固定された卵巣栄養細胞の多糸染色体に適合させました。高精度バイスを用いてスライド全体に高度に平行な作業面から高圧をかけるため、鉛筆の消しゴムを用いた従来のタッピング法よりも、染色体標本の作製時間を大幅に短縮できます。
その他の重要な手順として、毛包を50%プロピオン酸に十分に浸漬させること、およびスライドを加熱することが挙げられます。これらの手順はいずれも、染色体を平坦化させるために不可欠です。これらの工程を怠ると、脱水後に染色体が光沢を帯びることがあり、その結果、FISHにおいてシグナルと誤認されかねない過剰な背景（バックグラウンド）が生じる可能性があります。この高圧圧砕法は、同様の溶液を用いて有糸分裂染色体の調製を行う際にも有効です。さらなる伸展と平坦化により、核から染色体をより適切に露出させることができます。均等に圧力をかけることで染色体が適切に平坦化され、計測が可能となり、染色によって可視化されるバンドの解像度も向上する可能性があります。蚊から有糸分裂染色体を単離する方法についての詳細は、別の文献15に記載されています。通常の圧砕調製でも、FISH 16や免疫染色17を含む多くの目的に十分ですが、高圧法を用いることで、スライド間のばらつきを抑えられるだけでなく、染色体全体の品質が向上し、染色体マッピングにおいてより詳細な情報を得ることができます。また、この手順は、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション用の多糸染色体メンブレンスライドの調製にも利用可能です。
高圧法の制限事項としては、スライドの破損や染色体の過伸展が挙げられます。バイスでスライドに過剰な負荷をかけることでスライドが破損する可能性がありますが、本記事に記載された圧力を用いることでこれを抑制できます。染色体の過伸展については、ドレメルツールを長時間スライドに適用すると、染色体が伸びすぎて解像度が低下する可能性があります。これは、ツールを短時間だけ適用し、顕微鏡下で確認した後、染色体の広がりが不十分な場合にのみ再度ドレメルツールを適用することで解消できます。
従来のFISHプロトコールには、通常5〜20分間行われる洗浄およびインキュベーション工程が多数含まれており、実験期間中のほぼ全行程において研究者の細心の注意が必要となります。さらに、手動で処理できるスライドの枚数は、通常、1回の実験につき数枚に制限されます。対照的に、自動スライド染色システムは、すべての工程（洗浄、インキュベーション、プローブ塗布、変性、ハイブリダイゼーション、カバーガラスの貼付および除去を含む）を自動的に実行します。これにより、FISH実験において研究者は最大6〜8時間の作業時間を削減できます。さらに、自動FISHシステムはスループットを大幅に向上させることが可能です。例えば、Xmatrxシステムでは、シングルプレパレーションスライドで最大40アッセイ、デュアルプレパレーションスライドで最大80アッセイを同時に処理できます。本システムの制限としては、大量の溶液を調製する必要があるため、少数のFISH実験を行う場合には効率的ではないことが挙げられます。加えて、システムにプログラムされたFISHプロトコールを新しいアプリケーションに適用する場合、修正や調整が必要になる場合があります。
スライドスキャニングシステムは、蛍光顕微鏡を自動化したものです。ステージ移動の自動化とシンプルな顕微鏡コントロールパネルにより、研究者の時間は節約され、顕微鏡の操作は極めて簡単になります。例えば、ACCORD PLUSスキャニングシステムのソフトウェアでは、複数の蛍光チャネルの容易なキャプチャと、管理しやすい画像取得が可能です。その一例として、単一の画像を撮影するのではなく、z-stackキャプチャ機能が搭載されています。このソフトウェアは、設定可能なz-stack画像をキャプチャすることで、少なくとも1枚の画像がピントが合った状態であることを保証します。このシステムは、主に大量の画像取得（1枚のスライド上の多数の細胞）向けに作られていますが、手動でスライドを操作するよりも、スライド上の染色体をはるかに簡単に見つけることができます。
自動スライド染色システムとスキャンニングシステムの両者は、細胞遺伝学クリニックによるヒト細胞の染色体異常のFISH診断に日常的に用いられています。本研究では、これらの自動化システムを基礎研究用途に活用するプロトコルを開発しました。この自動ハイスループット物理地図作成プロトコルにより、あらゆる対象種の物理的染色体地図を迅速に構築することが可能になります。なお、本報告では物理地図作成に多染染色体を使用しましたが、これらのシステムには有糸分裂染色体も利用可能です。大半の生物は判読可能な多染染色体を形成しないため、本プロトコルを有糸分裂染色体に適応させることは有用であると考えられます。しかし、利用可能な場合は、多染染色体を用いることで、機能的ゲノム領域と染色体構造との対応関係について、最高解像度で有用な情報を得ることができます。バンドやインターバンドのパターンなどの多染染色体の組織化原理は、最近では通常の非多染（間期）染色体のそれと同様であると言われています18。したがって、高圧染色体標本を用いて詳細な物理地図を作成すれば、DNA配列をバンド、インターバンド、パフ、セントロメア、テロメア、ヘテロクロマチンなどの特定の染色体構造に結びつけることができ、染色体ベースのゲノムアセンブリを構築できる可能性があります。

<table><tbody><tr><td>22x22 mm 顕微鏡用カバーガラス</td><td>Fisher</td><td>12-544-10</td><td></td></tr><tr><td>18x18 mm 顕微鏡用カバーガラス</td><td>Fisher</td><td>12-553-402</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>Fisher</td><td>A491-212</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>Fisher</td><td>A412-4</td><td></td></tr><tr><td>プロピオン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402907</td><td></td></tr><tr><td>フレックスシャフトアタッチメント付き Dremel 200 ロータリーツール</td><td>Rand</td><td></td><td>3&quot; 多目的ミニベンチグラインダー（速度制限機能付き）</td></tr><tr><td>Dremelツール用特別設計 200 &amp;mu;l プラスチックチップ（プラスチックエッジ付きビーズ状）</td><td>Pipetman</td><td>F171300</td><td>ピペットチップの先端部分をカットし、加熱する</td></tr><tr><td>錫コーティング・ラピッドバイス</td><td>Avenger Gold Toolmaker</td><td>MTC-200-1</td><td>直角度および平行度の精密研磨精度 0.00025 以内</td></tr><tr><td>トルクレンチ</td><td>Craftsman</td><td>44593</td><td></td></tr><tr><td>ThermoBrite スライド変性・ハイブリダイゼーションシステム</td><td>Abbott Molecular</td><td>30-144110</td><td></td></tr><tr><td>25 mm バリアスライド</td><td>Abbott Molecular</td><td>XT108-SL</td><td></td></tr><tr><td>25 mm カバーガラス</td><td>Abbott Molecular</td><td>XT122-90X</td><td></td></tr><tr><td>Xmatrx 自動スライド染色システム</td><td>Abbott Molecular</td><td>08L46-001</td><td></td></tr><tr><td>MZ6 Leica 実体顕微鏡</td><td>Leica</td><td>VA-OM-E194-354</td><td>別の実体顕微鏡を使用可能</td></tr><tr><td>Olympus CX41 位相差顕微鏡</td><td>Olympus</td><td>CX41RF-5</td><td>別の位相差顕微鏡を使用可能</td></tr><tr><td>ACCORD PLUS 自動スキャンシステム</td><td>BioView (USA)</td><td>BV-5000-ACCP</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Invitrogen</td><td>P5493</td><td></td></tr><tr><td>10% NBF（中性緩衝ホルマリン）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td></td></tr><tr><td>99% ホルムアミド</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP227500</td><td></td></tr><tr><td>デキストラン硫酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>20x SSCバッファー</td><td>Invitrogen</td><td>AM9765</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>50x Denhardt液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2532</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>1 mM YOYO-1 ヨウ化物 (491/509) DMSO溶液</td><td>Invitrogen</td><td>Y3601</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止剤</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>dATP, dCTP, dGTP, dTTP</td><td>Fermentas</td><td>R0141, R0151, R0161, R0171</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-dUTP, Cy5-dUTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA53022, PA55022</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3294</td><td></td></tr><tr><td>DNAポリメラーゼ I</td><td>Fermentas</td><td>EP0041</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Fermentas</td><td>EN0521</td><td></td></tr></tbody></table>

自動化を使用して染色体のハイスループット物理マッピング<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

10,000種の脊椎動物1および5,000種の昆虫および関連節足動物2の全ゲノム配列を解読するプロジェクトが、今後5年間にわたって実施される見込みです。例えば、15種のマラリア蚊のゲノム配列決定が、現在Illuminaプラットフォームを用いて行われています3,4。このAnopheles属の種群には、マラリアの媒介種と非媒介種の両方が含まれています。ゲノムアセンブリが利用可能になれば、研究者は媒介能力に関連する進化的な変化を推論するための比較解析を行うという、類まれな機会を得ることになります。しかし、次世代シーケンシングのリードを用いて高品質なde novoゲノムアセンブリを構築することは困難であることが判明しています5。さらに、Anopheles gambiaeの既存のゲノムアセンブリは、サンガー法を用いて得られたものであるものの、ギャップが存在するか断片化しています4,6。
比較ゲノム解析の成否は、研究者が染色体ベースのゲノムアセンブリではなく、多数のシーケンシングコンティグを扱うかどうかに左右されます。断片化されマッピングされていない配列は、ゲノム解析において以下の問題を引き起こします。(i) 未確認のギャップにより、ゲノム配列のアノテーションが不正確または不完全になる。(ii) マッピングされていない配列により、パラログ遺伝子と異なるハプロタイプ由来の遺伝子の区別がつかなくなる。(iii) シーケンシングコンティグの染色体への割り当てや方向性が不明であるため、再編成の系統樹の再構築や染色体進化の研究ができない。新しくゲノムが解読された種に対して高解像度の物理地図を構築することは、適時かつ費用対効果の高い投資であり、ゲノムアノテーション、進化解析、および天然集団における個々のゲノムの再シーケンシングを促進します7,8。
ここでは、物理地図の迅速な作成を可能にする、染色体調製、蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）、およびイメージングへの革新的なアプローチを紹介します。An. gambiaeを例として、物理的な染色体地図の作成がゲノムアセンブリを改善し、その結果、ゲノム解析の質を向上させ得ることを実証します。まず、高圧法を用いて多糸染色体のスプレッドを調製します。もともとDrosophila向けに開発されたこの手法9により、通常の押し潰し法10よりも染色体の詳細な可視化が可能になります。次に、ハイスループットな物理ゲノムマッピングのために、完全に自動化されたFISH用フロントエンドシステムを使用します。この自動スライド染色システムは、複数のアッセイを同時に実行し、手作業による時間を大幅に短縮します11。第三に、電動スライドステージを備えた自動蛍光イメージングシステムを用いて、FISH後のラベル化された染色体を自動的にスキャンし、撮影します12。このシステムは、同一スライド上の複数の染色体プレートを同定し、可視化するのに特に有用です。さらに、スキャンプロセスによって、より均一なFISH結果を得ることができます。全体として、この自動ハイスループット物理マッピングプロトコルは、標準的な手動プロトコルよりも効率的です。

超並列DNAシーケンシング技術に基づくゲノムアセンブリは、通常、高度に断片化されています。物理的な染色体マップの開発は、ゲノムアセンブリを改善できる可能性があります。本研究では、物理マップ開発のスループットを大幅に向上させる、染色体調製、蛍光in situハイブリダイゼーション、およびイメージングへの革新的なアプローチを実証します。

10,000種の脊椎動物1および5,000種の昆虫および関連節足動物2の全ゲノム配列を取得するプロジェクトが実施される予定であり...

本手順の目的は、高圧染色体標本作製法を用いて蚊のポリテン染色体を作成し、それに続いて自動蛍光in situハイブリダイゼーションおよび自動イメージングを行うことで、DNAプローブをポリテン染色体にマッピングすることです。まず、高圧法を用いてポリテン染色体のスプレッドを調製します。次に、ニックトランスレーションプロトコルを用いてゲノムDNAを蛍光色素で標識し、蛍光プローブを調製します。3番目のステップでは、自動スライド染色システムを用いて蛍光in situハイブリダイゼーションを行います。最終ステップでは、自動蛍光イメージングシステムを用いて、ラベル化された染色体をスキャンし、撮影します。最終的に、画像によってポリ染色体上の蛍光ラベル化DNAプローブの局在を示すことができます。本手法の標準的な手動in situハイブリダイゼーションプロトコールなどの既存手法に対する主な利点は、この高スループットな物理マッピングプロトコールによって、より一貫した結果が得られ、手作業の時間が大幅に削減されることです。本プロトコールでは、まず、吸血後約25時間の雌を解剖し、卵巣がstage 3にある状態で回収します。この段階では、卵胞内の栄養細胞を含む透明な領域が円形であるはずです。5匹の雌から卵巣を回収し、500 µLの調製直後の修正Carnoy液で固定します。その後、室温で最大24時間まで、あるいは-20°Cでより長期間保存できます。次に、卵巣の解剖スライドを作成する直前に、カルノ溶液と50%プロピオン酸を準備します。解剖顕微鏡下で、埃のないスライド上の新鮮なカルノ溶液の一滴に、各ペアの卵巣を配置します。解剖針を用いて卵巣を分割します。卵巣の断片すべてを、50% 酢酸プロピオンが含まれる6枚の清潔なスライドガラスに移します。解剖針を用いて、卵胞を互いに分離します。その後、残っている組織をペーパータオルで拭き取ります。50% propionic acidをもう1滴加え、3～5分間待ちます。注：毛包を50% propionic acidに3～5分間浸すと、染色体の伸展が大幅に改善されます。次に、カバーガラスを掛け、核が広がるまでさらに1分間待ちます。スライドをフィルターペーパーとプラスチックで包みます。ドレメルを3,000〜5,000 RPMに設定し、約1分間、回転するドレメルのチップでカバーガラスを軽く円を描くように動かします。位相差顕微鏡で展展状態を確認し、染色体を平坦にするために必要に応じてドレメルを長く適用します。1枚目のカバーガラスに隣接して2枚目のカバーガラスを配置し、別の顕微鏡スライドでカバーガラスを挟みます。次に、スライドをプラスチックシートとフィルターペーパーで包み、バイスに固定して、85から120 inch poundsの間でスライドを圧搾します。6枚すべてのスライド上の染色体を平坦化した後、スライドのラップを外し、染色体をさらに平坦にするために余分なスライドを取り除きます。スライド変性ハイブリダイゼーションシステムを用い、55 °Cで10〜15分間スライドをインキュベートします。次に、スライドを液体窒素に少なくとも15秒間、または気泡が出なくなるまで浸します。次に、カバースリップをカミソリで素早く取り除き、直ちにスライドを冷えた50%ethanolに5分間浸します。この工程を各スライドに対して順次繰り返します。その後、70%、90%、および100%ethanolの浴でスライドを脱水します。それぞれの浴槽に5分間浸します。最後に、スライドを自然乾燥させれば、染色準備が完了します。プローブの標識化以外の手順の大部分は、自動装置によって行われます。デバイスをロードする前に、市販のNICトランスレーションプロトコルに従って、バックDNAを蛍光色素で標識し、蛍光プローブを調製します。プローブの準備が整ったら、スライドと試薬を自動スライド染色システムにロードし、システムに以下の手順を実行するようプログラムします。まず、800 µLの1×PBSを20分間供給します。次に、スライドをブロードライします。3番目に、1 XPBSで調製した4% formalin 450 µLを用いて、スライドを1分間固定します。その後、100% ethanolで1秒間の洗浄を2回行い、最後に2分間洗浄します。エタノール浴の後、スライドを再度エアブローで乾燥させます。次に、気泡の発生を防ぐため、スライドを45 °Cで2分間加熱します。その後、DNAプローブを20 µL滴下し、続いてミネラルオイルを1滴滴下してカバーガラスをかけ、90 °Cで10分間、染色体を加熱します。次に、スライドを42 °Cで14時間ハイブリダイゼーションさせます。ハイブリダイゼーション後、42 °Cで2分間ストリンジェンシー洗浄を行い、続いて2 XSSCを1秒間4回連続で塗布し、乾燥させます。その後、42 °Cで0.4 XSSCを800 µL、10分間2回塗布し、さらに1回洗浄を行い、最後に25 °Cで2 XSSCを10分間塗布します。次に、染料として50 µLのYO-YO-1を添加し、続いてミネラルオイルを加え、カバーガラスを掛けます。スライドを25 °Cで10分間インキュベートします。その後、カバーガラスを取り除きます。スライドを2x SSCで1回1秒間、計4回洗浄し、エアダスターで乾燥させます。最後に、各スライドにProlong Gold抗退色剤を15 µL滴下し、新しいカバーガラスを被せます。Accord Plus自動スキャンシステムを起動させますが、まずハロゲンランプ用のOlympus U-R-F-L-T電源から入れてください。次にコンピュータを、最後にカメラアタッチメント付きの顕微鏡の電源を入れます。まずduetソフトウェアパッケージを開き、10倍のプレスキャンを設定します。オンラインボタンをクリックし、新しいケースIDを入力して、スライドIDを割り当てます。bfと表記されたドットをクリックしてください。これが明視野（brightfield）オプションです。スキャン選択で10 x pre-scanを選択してください。2,500 x circle、10,000 x circle、またはrectangleのいずれかを選択します。setをクリックしてrunを実行してください。その後、プロンプトに従ってスキャンを適切に調整し、finishをクリックします。スキャンを開始するには、メインタブを押してメイン画面に戻ります。次に、オフラインボタンをクリックし、割り当てられたケースIDとスライドIDを確認して、「オフライン」をクリックします。左上領域にあるブラックボックスをスキャンします。矢印をクリックし、「10 x pre-scan」を選択してください。関心のある画像が見つかった後、矢印を使用してスキャンした画像を確認します。対象領域の中央にある画面をダブルクリックし、snapを押します。これにより、すべてのターゲットを選択した後にキャプチャする画像が指定されます。各画像を右クリックし、classifyをクリックして10 x pre-scanを選択し、polytanを選択します。メインメニューに戻り、40xのプレスキャンを設定します。再度「online」を選択し、スライドを選択してください。BFをfflに変更し、タスク名を「revisit-X-40-rg」に変更します。最後のsettingの直下にあるセクションをrevisit dash allに変更します。その後、プログラムを実行し、プロンプトに従ってください。オートメーションを設定するには、[start matching views]ボタンをクリックして、10xと40xの画像をマッチングさせます。「完了」をクリックしてスキャンを開始します。完了後、「分類」をクリックして画像を確認してください。異常個体のガンビア雌個体から、高圧法を用いて卵巣栄養細胞の多価染色体を調製しました。この手法では、大部分の染色体構造を損傷したり変化させたりすることはありません。曲がった染色体を平坦化することで、通常の標本では観察できない隠れた微細帯（ファインバンド）を明らかにします。染色体には、S Gambia および Tam back ライブラリの異常個体から得られたバック DNA クローンを用いてプローブハイブリダイゼーションを行いました。このライブラリは、S Gambia害虫株の第1 instar 幼虫のオスおよびメスから作製されました。この手順に従うことで、自動化されたハイスループットな物理地図作成が可能となり、染色体ベースのゲノムアセンブリの迅速な構築が促進されます。

high-throughput-physical-mapping-chromosomes-using-automated-situ

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

全体のマウント<em&gt;上皮内</emE11.5マウス胚へのE8.5&gt;ハイブリダイゼーション

Chromosomics：同時に新規OctoChrome FISHアッセイを使用した全24ヒト染色体における数値と構造変化の検出

染色体の複製タイミングの解析のための定量的な方法が記載されている。この方法は、蛍光との組み合わせでBrdUの取り込みを利用...

蛍光灯と組み合わせることで染色体の複製タイミング<em&gt;その場</em&gt;ハイブリダイゼーション

in situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光は、細胞内でのそれらの天然環境中の核酸の検出を可能にする。ここでは、マウス胚性幹細胞におけるX染色体不活性化を研究するために使用することができるFISHによるRNAおよびDNAの合成、同時検出のためのプロトコルを記載している。...

組み合わせたDNA-RNA蛍光<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（FISH）差別雌マウス胚性幹細胞におけるX染色体の不活性化を研究するために、

&gt;jove_contentvivoタンパク質-DNA相互作用をマッピングする方法は、ゲノム研究のあらゆる側面において重要になりつつありますが、それらは手間がかかり、費用がかかり、時間がかかります。ここでは、限られた量の細胞とin...

万HeLa細胞でエピジェネティックプロファイルを生成するためのChIP-seqの実験の自動化

ここでは、スライドマウント染色体上の反復ヘテロクロマティック配列を可視化するために、蛍光DNAのin situハイブリダイゼーション(DNA...

蛍光DNAための簡単​​な方法<em&gt;その場で</em&gt;ぺしゃんこ染色体へのハイブリダイゼーション

この原稿は、 Xを生成するための詳細な方法を提示-染色体腕プローブおよび実行する蛍光その場で交配 (魚) の妹の状態を調べるに染色分け体結束の prometaphase...

Prometaphase の腕凝集度と中期の状態を監視する蛍光In Situハイブリダイゼーション (魚) を使用して私はショウジョウバエの卵母細胞

南しみが付くことおよび/または PCR を用いたマウス胚性幹細胞に発生した相同組換えイベントを識別するための詳しいプロトコルを紹介します。このメソッドは、伝統的な胚性幹細胞を用いた相同組換えを介したターゲット技術を使用して非ミオシン II 遺伝子交換マウス...

南しみが付くことおよびポリメラーゼの連鎖反応を使用してマウス胚性幹細胞での相同組換えイベントの識別

本論文では、ChIP液体ハンドラプラットフォームを用いた特定のヒストン修飾(H3K27ac)に関連するDNA領域の半自動マイクロスケールのChIP-Seqプロトコルについて説明し、続いてタグメンテーションを用いたライブラリ調製について述べている。この手順には、品質と量の目的に対する制御評価が含まれており、他のヒストン修飾または転写因子に採用することができます。...

大規模エピジェネティック研究のための半自動化されたChIP-Seq法

このプロトコルは、事前埋め込みEdU-ストレプトアビジン-ナノゴールド標識とChromEMTの組み合わせを採用した、構造的に保存されたクロマチンin in situにおける...

電子断層撮影による超構造保存クロマチン中の複製ドメインのイメージング

学ぶ、高圧染色体標本法と自動化蛍光インプラントハイブリダイゼーションを用いた蚊の多線染色体へのDNAプローブマッピング法。自動化システムが物理マップ作成の効率と再現性を向上させ、ゲノムアセンブリの品質改善に貢献する。

自動化を使用して染色体のハイスループット物理マッピング

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