のカスタマイズアスペルギルスニジェールモルフォロジー

この方法は、糸状菌、アスペルギルス属、ニジェールの微粒子依存性形態学的構造を生成および特徴付けて、真菌の形態を生産性と相関させます。3リットルの攪拌タンク、バイオリアクターでマイクロ粒子の有無にかかわらず8ニジェールを培養し、比生産性を計算します。定義された時点でサンプルを採取し、バイオマス、乾燥重量、および拒否権フラクトサーゼ活性を決定します。

72時間後、顕微鏡で真菌の形態を調べ、デジタル画像分析によって特徴付けます。次に、画像解析の関連パラメータを、特定の生産性と数学的に相関する形態番号に組み合わせます。最終的に、この方法は、糸状微生物の形態形成をよりよく理解するために、アスペルギルス・ニジェールの形態を正確に生成し、包括的に特徴付けることができます。

Aspergillus Nigelは、何十年にもわたってバイオテクノロジーの重要な工業用作業馬です。アスパ、ナイジェル、および関連種の最も興味深く、しばしば制御不能な特性の1つは、培養条件に応じて、密集した球状のペレットから粘性菌糸体に至るまでの複雑な形態があることです。私たちの手順の主な利点は、微粒子を添加することにより、プロセスのニーズに合わせて特別に真菌の形態を調整できるようになったことです。

これまでのところ、真菌形態のそのようなカスタマイズについて他の方法は記載されていません。この方法は、糸状微生物の培養に関する重要な質問に答えるのに役立ちます。なぜなら、工業的応用のためには、真菌の形態を制御し、また、井戸と産生不良の真菌の形態を区別することが重要であるからです。

私たちのプロトコルは、真菌の形態の望ましいカスタマイズと特性評価のための手段を提供します。この方法は、アスペルギルス・ナイジェルの形態についての洞察を提供することができますが、ペニシリウムや連鎖球菌株などの他の糸状微生物にも適用できます。無菌培養用に4つのバイオリアクターを設置します(添付のプロトコルに詳述されています)。

テキストは、微粒子の添加に基づいて、異なる形態のアスペルギルスニジェールを栽培します。72時間後、50ミリリットルを転送します。培養液のサンプルをファルコンチューブに入れます。

バイオマスサンプルは、乾燥物で乾燥させた後、マイクロスケールでセルロースフィルターを秤量した後、少なくとも二重に採取する必要があります。ウォータージェット真空ポンプフィルターが接続されたブフナー漏斗にフィルターを置き、10ミリリットルのサンプルに続いて10ミリリットルをフィルターします。バイオマスから中性化合物を除去するための脱イオン水は、フィルターを途中で一度しわにします。

ガラスのペトリ皿に入れ、重量が一定になるまでコンパートメントドライヤーに入れます。フィルターを乾燥剤に移し、冷まします。次に、重量を測定します。

グルコースオキシダーゼおよびペルオキシダーゼ酵素アッセイの重量、フィルターの差、およびその後のサンプル体積による除算を計算することにより、リットルあたりのバイオマス乾燥重量を計算します。サンプルは、1.5ミリリットルのシリンジパスを使用して氷上に保存します。セルロースアセテートフィルターを介して反応チューブへの培養懸濁液ベータフラクトSASEアッセイを行います。

統計的堅牢性のために、2つのトリプリケートサンプルで細心の注意を払って成功を保証します。アッセイを開始するには、スクロースからグルコースへのpHおよび温度依存の開裂を制御するために試験管に20マイクロリットルのサンプルを追加し、20マイクロリットルのサンプルの代わりに20マイクロリットルの脱イオン水を使用します。また、各サンプルについて、アッセイにより培養液中の残留グルコースのネガティブコントロールを調製します。

20マイクロリットルの熱不活化サンプル スクロースからグルコースへの反応を開始するには、200マイクロリットルの1.65モルスクロース溶液を追加します。pH 5.4〜20マイクロリットルのサンプルで、すべての反応チューブを摂氏40度の加熱ブロックで20分間インキュベートします。氷上でチューブを冷却した後、摂氏95度で10分間加熱して反応を停止します。

必要に応じてサンプルを遠心分離し、測定された吸収が較正された値の範囲内にあるようにアッセイ用のサンプルを希釈します。次に、反応ごとに2マイクロリットルのサンプルをマイクロタイタープレートに加えます。サンプル測定を3回で適切に行います。

また、1ミリモルから15ミリモルまでの10種類のグルコース溶液の標準曲線を準備します。ゼロ点校正には、2マイクロリットルの脱イオン水を使用します。次に、それぞれに200マイクロリットルの試薬溶液を加えます。

室温で10分間よくインキュベートします。96ウェルサンライズマイクロプレートリーダーとマゼランデータ検索ソフトウェアを使用して、450ナノメートルでの吸収を測定します。スプレッドシートで結果チャートを開き、標準曲線のキャリブレーション ラインを作成します。

各サンプルのアクティビティを計算します。次に、サンプル活性から適切なネガティブコントロールの値を減算することにより、ベータフラクトテイズ活性を計算します。最後に、バイオマス乾燥重量とベータフラクトサーゼ活性を考慮して、特定の生産性を計算します。

プラスチック製のペトリ皿に3ミリリットルの培養懸濁液を入れ、生理的塩化ナトリウム溶液で希釈して形態学的構造を分離します。顕微鏡写真の品質は非常に重要です。その後の画像解析では、希釈ステップ中に作成に注意する必要があります。

ペトリ皿を、内蔵カメラを備えた顕微鏡で観察します。サンプルごとに約100枚の形態学的構造の画像を取得して保存し、各画像に少なくとも1つのオブジェクトが完全に描かれていることを確認します。同じように、異なる反応器からのサンプルを含む皿で続け、毎回新しい画像を取得します。

異なる量のタルク粉末を添加して成長させた異なる反応器からのサンプルの形態学的成長形態が異なることに注意してください。次に、画像処理プログラムで同じサンプルのすべての画像を開きます。画像J.プロセスツールを使用して、バイナリを作成します。

画像を白黒に変換して、一連の画像全体にコマンドを適用します。次にマクロコードを使用して、スケールバーを含む画像の1つを開きます。スケール バーを横切る直線を作成して、2000 ミクロンに相関するピクセル数を決定します。

解析ツールを選択し、測定値を設定し、形状係数、フェレット、直径面積、および周囲長を選択します。マクロコードを使用して、一連の画像を処理します。次に、形状係数の値の結果をグラフ化するスプレッドシートを開きます。

各画像について、1 つのサンプルのすべての画像を使用して、各画像の形態番号を計算します。形態番号の平均値を計算します。グラフ作成およびデータ分析プログラムを使用して、特定の生産性で形態番号をプロットします。

タルク微粒子の濃度の増加を添加することにより、数学的回帰によって数学的関係を決定します。8ニジェールSKAN 10 15。形態は、真のペレット形態から分散体、または私の形態にさえ変更されます。予想通り、ペレットの形態は標準条件で示されます。

興味深いことに、菌糸体の形態は、タルク微粒子1リットルあたり10グラムの培地を補給することによって作成されます。同時に、Beto Fructo taseの活性は、タルク粉末1リットルあたり1〜3グラムの約3倍のサプリメントを摂取すると、自動画像解析によって決定されたパラメータを使用してフルクトース活性が2倍になる分散形態につながります。微粒子依存の形態は、形態によって包括的に記述できます。

数字に注意してください、滑らかなペレットで完全に丸いものは、顕微鏡の画像ではそのような粒子の完全な円として表示されます。形態番号は、標準条件で1に近い値を持っています。反応器1の形態は、約0.8の形態番号を示します。

リアクター4の形態は、1リットルあたり10グラムです。タルク粉末は、約0.1の形態数を特徴としています。タルク粉末濃度が1リットルあたり1グラムから3グラムの反応器2と3の形態番号は、これらの両極端の間にあり、分散した形態を示しています。

微粒子依存性の形態はベータフルクトース細胞の生産性と密接に関連しているため、形態、数、および生産性には良好な数学的相関関係がありますその開発後。この技術は、バイオテクノロジーの分野の研究者が真菌の形態、特に生産性との関係をさらに探求する道を開きました。この手順に従って、特定の形態学的、真菌のクロスタイプを詳細に作成することで、糸状微生物の培養の他の重要な側面を探求することができます。

たとえば、菌糸体の形態は、口蓋の形態よりもはるかに粘性が高いことが知られています。したがって、プロセスの全体的な生産性は、目的の製品の問題と精製によって損なわれます。私たちの形態学番号は、文化、プロ神学に関するモデルを確立し、一般的な真菌の形態学の理解を深めるのに役立ちます。