細菌におけるRIBO-seq:NGSシーケンシングのためのサンプル収集とライブラリ調製プロトコル

RIBO-seqとも呼ばれるリボソームプロファイリング技術は、現在、生体内でのタンパク質合成のプロセスを研究するための最も効果的なツールです。この方法の利点は、リボソームの位置と数を正確にマッピングすることによって翻訳を監視できることです。RIBO-seqは、リボソームがmRNA分子に結合することにより、リボヌクレアーゼ消化時に埋もれた転写片を保護するという事実に基づいている。

リボソーム足跡と呼ばれる得られた断片を、由来の転写物に配列してマッピングすることができ、リボソームの正確な位置を決定する。同時にRIBO-seqに対して、高スループットの総mRNAシーケンシングが行われ、基準点を提供し、データ分析中にRIBO-seqとRNA-seqの両方からのデータ比較を可能にします。細胞を収穫する前に、必要に応じて、菌体培養にクロラムフェニコールを加え、1ミリリットル当たり100マイクログラムの最終濃度に加え、翻訳を阻害することができる。

抗生物質で培養を1分間インキュベートする。このステップは、翻訳の阻害によりサンプルの収集時間を延長できるため、通常よりも収穫に時間がかかる場合に重要です。事前に温めたろ過システムでサンプルを収集します。

成長条件を模倣するために振れを導入できます。すべての媒体が膜を通過した場合はフィルタリングを停止しますが、フィルタを完全に乾燥させないでください。前温めの消毒されたスコップラを使用して、フィルターディスクから細胞を迅速に掻き取ることによって細菌ペレットを収集します。

すぐに収穫した細胞で全体のすくい全体を液体窒素で満たされた50ミリリットルの管に置きます。収穫されたペレットは、完全に液体窒素で覆われるべきです。ペレットを十分に凍結させ、以前に冷却したスクープラを使用して凍結細胞を取り除きます。

蓋を閉め、穿刺されていることを確認します。液体窒素は蒸発時の圧力変化により閉じた容器が爆発する可能性があるため、これは重要です。GMPP、DNA綿棒、新鮮なエペンドルフチューブをリサーゼ専用に準備します。

必要に応じてクロラムフェニコールを添加してリシスバッファーを調製します。サンプルごとに500マイクロリットルのライシスバッファーを別々のエペンドルフチューブに割り当て、氷の上に置きます。モルタルと害虫を実験室用消毒剤と70%エタノールで除染します。

乳鉢と害虫を冷却し、液体窒素をモルタルに注ぎます。冷凍細菌ペレットを冷やされたモルタルに移し、粉末に粉砕します。酸化アルミニウムの約1体積を加え、粉砕を続けます。

モルタル、害虫、細胞は必要に応じて液体窒素を注ぎ、モルタルの内容物を解凍しないように冷まします。使用する直前に、GMPPNPとDNA綿棒をリシスバッファーアリコートに加えます。溶液をモルタルに移し、粉砕を続けます。

ライザーゼを研削しながらゆっくりと解凍します。リザーゼが完全に解凍したら、混合物を冷やしたエペンドルフチューブに移し、氷に戻します。20,0000 Gの遠心分離機リサーゼを摂氏4度で5分間。

上清を新鮮な冷蔵エペンドルフチューブに移し、氷の上に置きます。ナノドロップを用いて各希釈サンプル中のRNA濃度を測定します。各ライセートをRIBO-seqの場合は0.5〜1ミリグラムのRNAの2つの部分に分け、残りはRNA-セク用です。

RNAの1ミリグラムに、Tris pH 8に3.8マイクロリットルのMNaseを加え、500マイクロリットルの総体積にリシスバッファーで上げる。摂氏25度、毎分300ラウンド、45分間インキュベートします。インキュベーションが終了したら、市販のRNAクリーンアップキットでサンプルを清掃してください。

8つの臼歯尿素と15%ポリアクリルアミドTBEゲルを調製し、TBEバッファーとタンクに入れます。200ボルトの一定電圧で最低10分間のプレラン。サンプルをTBE-尿素サンプルバッファーと混合します。

95°Cで1分間変性し、すぐに氷の上に置きます。注射器を使用してTBEバッファーをゲルウェルに注入して尿素を洗い流します。サンプルをロードし、それらの間に1つの井戸スペースを残して、各サンプルを分離し、クロスコンタミネーションを防ぎます。

29ヌクレオチド長オリゴを使用し、26ヌクレオチドと32ヌクレオチド長オリゴをマーカーとして混合する。電気泳動を180ボルトの一定電圧で実行します。一晩のインキュベーションのための無菌緩衝液を準備する。

電気泳動が終了したら、SYBRゴールドでゲルを染色します。滅菌針またはカミソリの刃を有する26〜32ヌクレオチドの間のゲルの切物片を、別々のエペンドルフ管にゲル断片を入れる。サンプル間の針またはカミソリの刃を変更します。

各エペンドルフに200マイクロリットルの一晩インキュベーションバッファーを加え、10°C、毎分1000ラウンド、一晩でサンプルをインキュベートします。翌日、RNAクリーンアップキットでサンプルを洗浄し、ヌクレアーゼを含まない18マイクロリットルの水で溶出します。得られたリボソームの足跡は図書館の準備の準備ができている。

市販のキットを使用して、RNA-seqのサンプルに対してリボソームRNA枯渇を行います。次に、RNAクリーンアップキットでサンプルを洗浄します。アルカリ加水分解を次のように行い、アルカリ加水分解バッファーを調製し、サンプルの1体積にバッファーの1つのボリュームを加え、95°Cで25分間インキュベートします。

反応を停止させるために、各サンプルに3モル酢酸ナトリウムpH 5.5の5マイクロリットルを加えます。RNAクリーンアップキットでサンプルを洗浄し、ヌクレアーゼを含まない18マイクロリットルの水で溶出します。得られたランダムに断片化したRNAは、ライブラリ調製の準備ができています。

10マイクロリットルの10x反応バッファーと5マイクロリットルのT4ポリヌクレオチドキナーゼを各サンプルに加えます。摂氏37度で1時間半インキュベートします。この時間の後、1ミリモルATPの3マイクロリットルを追加し、1時間37摂氏度でインキュベートします。

次に、RNAクリーンアップキットでサンプルを洗浄します。ここで提供されるプロトコルに従って、市販のキットを使用してライブラリ調製を行う。6%ポリアクリルアミドゲルを用いてPAGEを行う。

SYBRゴールドでゲルを汚します。ライブラリを含む物品物ゲル断片。RNA-seqサンプルの場合、ライブラリは135〜180ヌクレオチド、およびRIBO-seqの場合は135〜170ヌクレオチドの間です。

滅菌針またはカミソリの刃を使用し、切除されたゲル断片を別々のエペンドルフチューブに入れる。サンプル間の針またはカミソリの刃を変更することを忘れないでください。各摘出されたゲル断片にヌクレアーゼを含まない水を100マイクロリットル加えます。

そして、一晩、10摂氏10度、毎分450ラウンドでそれらをインキュベートします。翌日、DNAクリーンアップキットでサンプルを清掃します。得られたライブラリは、高感度、DNAオンチップ電気泳動、そして次世代シーケンシングの質と量の制御の準備ができています。

得られたcDNAライブラリは、高感度のDNAオンチップ電気泳動によって検証された次世代シーケンシングに必要な適切な量と品質を提示します。RIBO-seqライブラリを表すバンドとピークは、RNA-seqライブラリを表すのと比較して、より狭く、より良く定義されています。オンチップ電気泳動によれば、ライブラリは期待されるレンズを持っています。

RIBO-seqライブラリに存在する200塩基対に近い追加のピークは、リボソーム、完全に消化されたリボソームフットプリント、またはアーティファクト、例えばrRNAを示し、シーケンシングから得られたデータがトリミングされ、rRNA tRNAがフィルタリングされたときにバイオインフォマティクス分析中に廃棄することができる。ライブラリの準備で生成されるcDNAの平均量は32ナノグラムであり、次世代シーケンシングに必要な材料の量を十分に提供します。オンチップ電気泳動による品質管理の後、ライブラリはイルミナのNextSeq 500プラットフォーム上でシングルと50ベースペアシーケンシングのために引っ張られました。

アダプターと品質の悪いシーケンスをトリミングすると、RNA-seq サンプルのサンプルあたり 2,500 万から 4,700 万読み取り、RIBO-seq サンプルのサンプルあたり 2,500 万から 5,000 万読み取りが発生しました。取得したデータは、FastQCで品質管理をチェックしました。RNA-セクとRIBO-seqの両方のサンプルは非常に良い品質を提示しました。

記載されたプロトコルに従って作成されたライブラリのマッピングは、RNA-seqサンプルのサンプルあたり240万〜960万個のユニークマッピング読み取り、およびRIBO-seqサンプルに対するユニークにマッピングされた読み取りの2.3〜1040万読み込みをもたらしました。RIBO-seqデータは、RNA-seqデータでは観察されないリボソームの起点およびリボソーム足跡の特徴に対応する、3倍の周期性と背の高い狭いピークを示す。さらに、コーディング配列上のリボソームフットプリントとmRNA断片の平均カバレッジのプロファイルを示すプロットは、予想通り、RIBO-seqデータセット内のCDSにマッピングされた読み取りの割合が高いことを明らかにします。

マッピングされたリボソーム足跡の視覚化は、スクロース勾配超遠心分離による単数的な回復を含む標準的なRIBO-seq手順に従って行われた同じ実験から得られた結果と比較して非常によく似たパターンを示した。当社のプロトコルは、様々な成長条件で翻訳調節を調査するために使用されてきましたが、翻訳開始部位の検出や新規タンパク質コード遺伝子などの翻訳の他の側面を研究するために適用することができます。ガイドラインに従って作成されたライブラリのシーケンシングは、包括的なバイオインフォマティクス分析に十分なデータをもたらします。

ここで紹介するプロトコルは、迅速かつ簡単かつ費用対効果が高く、標準の実験機器で実行できます。