Name: RNA-seqのトロンビン処理におけるトランスクリプトームの解析と制御ヒト肺微小血管内皮細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: 学ぶRNA-seqプロトコルでトロンビン処理したヒト肺微小血管内皮細胞のトランスクリプトームを解析する方法。RNA抽出、ライブラリ構築、シーケンス、データ解析、RT-PCRによる検証を含む完全な手順を解説します。

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著者らは、我々のデータ解析のためのそれらのコンピューティング·クラスタの使用のために子供のマーシー病院や診療所で博士スティーブンKingsmoreと小児ゲノム医学センターに感謝したいと思い、イルミナのフィールドサービスチーム（エリザベス·ボワイエ、スコット·クッ​​ク、マーク·クック）と技術彼らの迅速な対応と次世代DNAシーケンシング楽器、HiScanSQ、およびデータ品質分析の実行に関する有用な提案のためのコンサルタントチーム。この作品は、子供のマーシー病院や診療所の健康グラントHL080042（SQY）とスタートアップ資金や寄付金の国立研究所、カンザスシティ、ミズーリ大学（SQYへ）によって部分的にサポートされていました。

<html>このプロトコルを概説するフローチャートを図1に表示されます。 1。トロンビン、RNA単離、RNAの品質評価と定量で細胞を処理する<ol><li> 5％のFBS、成長因子および抗生物質によるEGM-2培地で6ウェルプレートで90〜100％コンフルエントまで培養ヒト肺微小血管内皮細胞（HMVEC-LBL）（Lonza社、カタログ番号CC-3202）。 </li><li>飢餓·メディア（0％FBS）を30分トロンビンによる治療に先立って、メディアを変更してください。 </li><li> 0.05 U / mlのトロンビンを用いて細胞を治療したり、℃、5％CO 2、37℃で6時間のコントロールとして未処理のままにしておきます。 </li><li>メーカーの指示に従ってアンビオンミールヴァナキットを使用して処理した細胞および対照細胞から全RNAを単離する。 </li><li> Experionの自動電気泳動Station上の標準プロトコルに従ってExperionのStdSense真核生物RNAチップを搭載したRNAの品質を評価する（= &quot;_blank&quot;&gt; www.bio-rad.com）。 </li><li>標準分光光度法を用いてRNAを定量化する。 </li></ol> 2。ライブラリーの構築とシーケン<ol><li>出発原料として、サンプルあたり高品質のtotal RNA 1μgを使用します。 </li><li>ライブラリーを構築するために、イルミナ（プロトコル＃15008136 Rev. A翻訳版）からの標準的な手順に従ってください。このプロトコルでは、ポリ2ラウンドの（）を含むmRNAの選択は、rRNAの塩基配列決定を最小限に抑えるためにrRNAを除去するために行われている。 </li><li> Experionの自動電気泳動駅（上の標準プロトコルに従ってExperionのDNAを1Kチップを使用してライブラリの品質評価<a href="http://www.bio-rad.com" target="_blank">www.bio-rad.comを</a> ）。 </li><li>定量PCRを使用してライブラリを定量化：以前に標準曲線とライゲーションアダプターに特異的なプライマーとして、配列決定されたライブラリを使用してください。未知のライブラリ（ すなわち 1:100、1:500および1:1000）の希釈液の範囲を使用します。 qPCRにアコを実行SyberGreen MMプロトコルにrding、各ライブラリの元の原液濃度を計算します。 </li><li>クラスタフローセルへの準備が整うまで、-20℃で10 nMおよびストアにライブラリの株式を希釈します。 </li><li>ときに、クラスタフローセルをする準備ができて、水浴中CBOT試薬プレートを解凍します。 CBOTは、クラスタの生成プロセスを合理化するために使用されるイルミナ楽器です。 </li><li> CBOT楽器を洗う。 </li><li>ライブラリを変性：13μlの1×TEと6μlの10μMのライブラリを組み合わせると、チューブの側面に、1μlの1NのNaOHを（イルミナ社によって提供される）を追加します。渦は、スピンダウンし、室温で5分間インキュベートし、氷上で変性したライブラリを配置。 </li><li>ライブラリを希釈：12 PMの最終濃度996μlのHT1と4μlの変性ライブラリを組み合わせることにより予冷ハイブリダイゼーション緩衝液（HT1、イルミナによって提供される）で変性したライブラリを希釈します。氷上の変性および希薄化ライブラリを配置します。 </li><li> 、CBOTプレートの管のそれぞれの行を反転すべての試薬は融解していることを保証します。プレートをスピンダウンし、/パンク箔シールを取り外して、CBOTにロード。 </li><li>ストリップチューブに希釈し、変性したライブラリのアリコートを120μlは、1から8までのラベルが付いた。制御スパイクのように各試験管に1.2μlの希釈、変性PHIX制御ライブラリ（イルミナ）を追加します。ボルテックスし、チューブをスピンダウンして、正しい向きでCBOT（右にチューブ＃1）上にロードします。 </li><li> CBOTにフローセルとマニホールドをロードします。 </li><li>フローチェックを完了し、クラスタリングの実行を開始します。 </li><li>実行が完了したら、すべてのレーンを横切っ試薬送達を確認してください。異常をメモしておきます。どちら4℃で直ちにシーケン実行を開始またはチューブ中でフローセルを保存</li><li>シーケンシング合成による（SBS、イルミナ）の試薬を解凍します。 </li><li>切断ミックスに触れた後、他の試薬に触れないように確認しながら、試薬トレイ上の適切な箇所に試薬をロードします。 </li><li> NOを使用N-シークエンスフローセル（ つまり以前に配列決定した1）、プライム試薬ラインを2回押します。 </li><li> 70％エタノールとレンズペーパーに続いて70％エタノールとキムワイプとシーケンスフローセルを、徹底的に清掃してください。どんなスジ用フローセルを点検してください。必要に応じて再清掃してください。 </li><li>シーケンサーにフローセルをロードして、マニホールドとフローセルの間のシールがタイトであることを保証するためにチェックフローを実行します。 </li><li>シーケンスの実行を開始します。 </li><li>彼らは実行時 ​​に利用可能になると品質メトリクス（クラスタの密度を例えば 、フィルタを通過するクラスタ、Q30、強度）を評価する。 </li><li>ラン全体で強度を監視します。 </li><li> 101サイクルが完了すると、2番目の読み出し完了するターンアラウンド化学を実行します。ペアリングエンド試薬及び第2のリード定款バッファ（ICBは、SBSの試薬の成分、イルミナ）を解凍し、試薬をロードします。 </li><li>第2 回は、強度、Q30読ん評価、シーケン実行を継続ランの進行状況としてND他の品質メトリクス。 </li></ol> 3。データ解析<ol><li>ベースコール·ファイル（。BCL）ファイルに変換するCASAVAの最新バージョン（イルミナ、現在は1.8.2）を使用します。fastqファイルは、各サンプルのシングルfastqファイルの作成を確実にするために0にfastq-クラスタカウントを設定する。下流解析用fastqファイルを解凍します。 </li><li>超高スループット短い読み取りのアライナ（ボウタイ、0.12.7）6およびSAMtools（0.1を用いて哺乳動物サイズのゲノムを読み取ったRNA-seqを揃えトップハットの最新バージョン（1.4.1）5を使用してペアリング終了アライメントを実行します。 17）7。 SAMtoolsは、SAM形式で後処理アライメントを行なうための各種ユーティリティが実装されています。参照ヒトトランスクリプトームはiGenomes（からダウンロードすることができます<a href="http://www.illumina.com" target="_blank">www.illumina.com</a> ）。トップハットを実行している、我々はFR-unstranded（デフォルト）などのライブラリ·タイプ·オプションを含む、すべてのデフォルトのパラメータ設定を使用していました。 </li><li>私達8ソフトウェアパッケージプログラムCuffDiff、カフスの部分（1.3.0）ING、人間の基準に基づいて、トランスクリプトーム、前者で差次的に発現する遺伝子の転写産物を選別するためのコントロール細胞にトロンビン処理した細胞を比較します。この比較は、既知の転写産物の発現差を検出します。表形式で結果を可視化するには、Microsoft Excelを使用します。カフス·プログラムを実行して、我々は、すべてのデフォルトパラメータの設定を使用しました。 FPKMとのそれらの遺伝子転写産物は&lt;0.05、P&gt; 0.05は除外されます。 </li><li>小説アイソフォームを検出するために、基準のトランスクリプトームなしでカフスを実行します。 Cuffcompareを使用して、リファレンスゲノムにサンプルトランスクリプト·ファイルを比較し、1分析用リファレンスゲノムと第二の分析のための基準ゲノムとして合成制御トランスクリプトファイルとして結合されたトロンビントランスクリプト·ファイルを使用してCuffdiffを備えた差動式をテストします。表形式で結果を可視化するには、Microsoft Excelを使用します。再び、thosの電子遺伝子転写FPKMと&lt;0.05およびp&gt; 0.05は除外されます。このステップの後、捜査官は、UCSCゲノムブラウザのホームページ（に新たに報告された成績証明書のリストをアップロードすることを選ぶことができ<a href="http://genome.ucsc.edu/" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/</a>手動検査によりその妥当性を確認するため）。 </li><li>工夫パスウェイ解析（IPAに発現差のある遺伝子のリストを提出<a href="www.ingenuity.com" target="_blank">www.ingenuity.com</a>トロンビン処理によって影響を受ける遺伝子および経路の特徴づけのために）。このステップでは、捜査官は、カマーバンド（使用することを選ぶかもしれ<a href="http://compbio.mit.edu/cummeRbund/" target="_blank">http://compbio.mit.edu/cummeRbund/</a>視覚化、管理を支援するために）、カフス、RNA-seqの出力を分析する作業を支援し、簡素化するように設計されているRパッケージを、とCuffdiff分析によって生成されたデータのすべてを統合します。 </li></ol> 4。定量的リアルタイムリポによるRNA-seqの結果の検証lymerase連鎖反応（QRT-PCR） <ol><li>制御およびトロンビ​​ン処理HMVEC-LBLセル、ステップ1.6から1.4に記載されたRNAの品質評価およびRNA定量からのtotal RNA抽出を行います。 </li><li>メーカーの指示（インビトロジェン社、18080から051）に続いてのSuperScript IIIファーストストランド合成システムRTのキットと、各サンプル1μgの全RNAから相補的DNAを生成します。 </li><li> CUGBP、Elav-likefamilymember1（CELF1、Hs00198069_m1）、Fanconianemia、complementationgroupD2（FANDCD2、Hs00276992_m1）、TNFreceptorの検出のためのTaqmanアッセイオンデマンドに設計されたオリゴヌクレオチドを​​用いて、Applied Biosystemsの第VIIa 7リアルタイムPCRシステムで定量RT-PCR解析を実行関連因子1（TRAF1、Hs01090170_m1）、およびβ-アクチン（ACTB、Hs99999903_m1）。各サンプルは、トータルRNAの5 ngに相当するテンプレートを持っていた。 DDCt法を用いて定量を測定し、β-アクチンに正規化する。各アッセイは複製され、少なくとも3生物を越えて行った。 </li></ol>

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li>
<li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq%3A+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).</li>
<li>Zhang, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+Reveals+Novel+Transcriptome+of+Genes+and+Their+Isoforms+in+Human+Pulmonary+Microvascular+Endothelial+Cells+Treated+with+Thrombin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin.</a> PLoS One. 7, e31229(2012).</li>
<li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat%3A+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li>
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<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat. Protoc. 7, 562-578 (2012).</li>
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<li>Garber, M., Grabherr, M. G., Guttman, M., Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+methods+for+transcriptome+annotation+and+quantification+using+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq.</a> Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).</li>
<li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+transcriptome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).</li>
</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

主な手順 RNAの取り扱い：RNaseがあっても、最も高品質のRNAを低下させます従ってケアはRNAを10の分離、貯蔵及び使用時に注意が必要です。手袋は常に人間の手で発見のRNaseの混入を防ぐために着用されています。手袋は、特に皮膚、ドアノブや他の共通の表面に触れた後、頻繁に変更する必要があります。ピペットのセットは、単に仕事をRNAに専念すべきであり、すべてのヒントやチューブは、RNaseフリーであるべきである。 RNAの単離と下流のアプリケーションは、日常などのRNase-ZAPとして製品に除染されている低トラフィック地域で行われるべきである。劣化はまた、凍結融解の繰り返しで発生する可能性があります。これらは分離直後にダウンストリームアプリケーション用のRNAを分取することで最小限に抑えることができます。あるいは、cDNAを直接分離後に、そのような定量RT-PCRなどのダウンストリーム·アプリケーションのために行うことができます。 RNAは-80℃で保存し、使用中に氷の上で保たれるべきである。また、IMPで完全に解凍し、ボルテ...

<table border="1"><tbody><tr><td width="183"> 試薬や機器 </td><td width="85"> 会社 </td><td width="185"> カタログ番号 </td><td width="359"> 注釈 </td></tr><tr><td>ヒト肺微小血管内皮細胞</td><td>ロンザ</td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td>ロンザ、Bulletのキット</td><td>ロンザ</td><td> CC-3202 </td><td> EGM-2、FBS、成長因子や抗生物質が含まれています</td></tr><tr><td>トロンビン</td><td>シグマ</td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td>アンビオンミールヴァナキット</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> AM 1560 </td><td></td></tr><tr><td>のRNaseザップ</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> ExperionのStdSens RNA </td><td>バイオ·ラッド</td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> TruSeq RNAの調製キット</td><td>イルミナ</td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> AMPureXPビーズ</td><td>ベックマン·コールター</td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td>スーパースクリプトII逆転写酵素</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> ExperionのDNAの1K </td><td>バイオ·ラッド</td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td>のQuantiTect SyberGreen </td><td>キアゲン</td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PEのクラスタ生成キット</td><td>イルミナ</td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> PHIXコントロールキット</td><td>イルミナ</td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200サイクルSBSキット</td><td>イルミナ</td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> HiScanSQ * </td><td>イルミナ</td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> CBOT </td><td>イルミナ</td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td>定量PCRマシン - Viia7 </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td>モデル＃VIIA7 /機器＃10631261 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td> Experionのシステム</td><td>バイオラッド</td><td> 7007001 </td><td>バイオアナライザは、代替システムである</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>バイオテック</td><td>エポックマイクロプレート分光光度計</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>遠心分離機 - ソーバルレジェンドXTR </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 75004521 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>マグネットスタンド</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェルサーモ</td><td>一般的なラボサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表3主な試薬のリストとEメジャーquipment。 *、ビデオでは、代わりにHiScanSQのHiSeq1000が実証された。 </td></tr></tbody></table>

rna-seqのトロンビン処理におけるトランスクリプトームの解析と制御ヒト肺微小血管内皮細胞

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

mRNAレベルの測定を介して細胞内での遺伝子発現の特性は、細胞の転写機構を外部信号（ 例えば、薬物治療）、またはどのように細胞が健康な状態と病気の状態の間で異なることによりどのような影響を受けるかを決定するのに有用なツールです。次世代DNAシーケンシング技術の出現と連続洗練された、RNAシーケンシング（RNA-seq）は、転写物の全ての種をカタログ化するすべての発現している遺伝子の転写構造を決定するために、定量化するトランスクリプトーム解析のますます普及している方法となっている与えられた細胞、組織または生物1,2における転写産物の全体集合の変化の発現レベル。 RNA-seqは徐々にそれが完全なトランスクリプトームのプロファイリングの利点を持っているので、トランスクリプトーム解析のための好ましい方法として、DNAマイクロアレイを交換するデジタルdatum型（任意の転写物のコピー数）を提供すると、任意の既知のゲノムシーケンシャルに頼っていませんCE 3。 ここでは、トロンビン処理の有無にかかわらず、ヒト肺微小血管内皮細胞のトランスクリプトームのプロファイルへのRNA-seqを適用するための完全かつ詳細なプロトコルを提示。このプロトコルは、と題する我々の最近発表された研究に基づいている我々は正常ヒト肺微小血管内皮細胞の最初の完全なトランスクリプトーム解析を行っている4 &quot;RNA-seqはトロンビンで処理したヒト肺微小血管内皮細胞における遺伝子およびそのアイソフォームの新規トランスクリプトームを明らかにする&quot; RNA-seqを使用してトロンビンで処理した。これは、炎症状態、癌、糖尿病、冠状動脈性心臓病の病因におけるトロンビン媒介内皮機能不全の分子機構についての洞察を得るためにさらなる実験のための前例のない資源をもたらし、これらの疾患に対する治療ターゲットの潜在的な新規のリードを提供しています。 このプロトコルの記述テキスト4つの部分に分かれています。最初の部分は、トロンビンおよびRNAの単離、品質分析と定量化したヒト肺微小血管内皮細胞の治療について説明しています。第二部では、ライブラリーの構築およびシーケンシングを説明しています。第三部は、データ分析を説明しています。 4番目の部分は、RT-PCR検証アッセイを記載する。いくつかの重要な手順の代表的な結果が表示されます。重要なステップでの成功を後押しするための有用なヒントや注意事項は、ディスカッション·セクションで提供されています。このプロトコルはトロンビンで処理したヒト肺微小血管内皮細胞を使用していますが、それは哺乳類と非哺乳類細胞の両方で、さまざまな刺激または阻害剤で処理した組織内のプロファイル·トランスクリプトームに一般化することができる、または健康状態の間の細胞または組織にトランスクリプトームを比較する疾病状態。

ステップ1：28S：18S比は伝統的にRNA分解の指標として用いられる。理想的には、28Sのピークは18歳のバンド（2の比）の約2倍の面積を持つ必要がありますが、この理想的な比率は、しばしば、実際には見られません。さらに、28S：分光光度法から得られた18S比はRNAの分解量を過小評価することができます。より正確に劣化、したがって、RNAサンプルの品質を定量化するために、Experionのシステムは、RNAの品質インジケータ（RQI）数を計算します。 RQIアルゴリズムは、標準化され、分解されたRNAの一連のサンプルからのデータにRNAサンプルの電気泳動図を比較して、自動的に10（インタクトなRNA）と1（分解されたRNA）の範囲の数値を返します。 RNAの品質は8より大きい理想的には少なくとも7のRQIを有するべきであり、 図2は、8.4のRQIで高品質のRNAサンプルを用いたExperionの結果を示しています。 のためにステップ2：ライブラリは約250から300 bpの広...

このプロトコルは、トロンビン処理の有無にかかわらず、ヒト肺微小血管内皮細胞にトランスクリプトームのプロファイルへのRNA-seqの、強力な次世代DNAシーケンシング技術を適用するための完全かつ詳細な手順を示します。このプロトコルは、異なる試薬又は病気の状態によって影響を受ける様々な細胞や組織に一般化できる。

RNA-seqのトロンビン処理におけるトランスクリプトームの解析と制御ヒト肺微小血管内皮細胞

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

この手順の全体的な目標は、強力な次世代DNAシーケンシング技術であるRNA-Seqをトランスクリプトームのプロファイリングに適用するための完全で詳細なプロセスを提示することです。これは、まずトロンビン処理の有無にかかわらず、ヒト肺微小血管内皮細胞から全RNAを単離し、RNAの品質を確認することによって達成されます。2番目のステップは、それらのRNAサンプルからDNAライブラリを構築することです。cbot装置を使用してクラスター生成を合理化し、HighSeq 1000でDNAシーケンシングタスクを実行します。次に、データ解析を行い、最終的に発現差のある遺伝子転写産物を同定し、表示します。最後のステップは、RT TP CRによってRN aeqの結果を検証することです。トランスクリプトーム解析用のDNAマイクロアレイなどの既存の方法に対するICの主な利点は、ICが完全なトランスクリプトームをプロファイリングし、デジタルタイプのデータを提供できること、および細胞内の遺伝子発現の既知のゲノム化に依存しないことです。一方、MRAレベルの測定は、細胞の機構の転写が外部シグナルによってどのように影響を受けるか、または細胞が健康状態と疾患状態の間でどのように異なるかを判断するのに役立つツールです。このプロトコルでは、処理されたトロビンおよび制御ヒト肺微小血管インドシン細胞におけるトランスクリプトームのIC分析を実演します。このプロトコルは、最近発表された研究に基づいており、私たちは成功裏に高SEQ 1000、人気のある次世代のDNAシーケンシングプラットフォームである次世代DNAシーケンシングプラットフォームであるHigh SEQ 1000でRNA-Seqを使用してトロンビンで処理されたヒト肺微小血管内皮細胞の最初の完全なトランスクリプトーム分析を実行しました。VS 7 R-T-P-C-Rシステムを使用して、Dr.Denovaは、ヒト肺、微小血管内皮細胞および全細胞RNA単離のトロンビン治療を実演します.Mrs.マーガレットギブソンは、RNA品質とDNAライブラリだけでなく、cbot上のクラスター生成をチェックするExperianシステムを実演します。そして、ディミトリ・グレゴール博士は、このプロトコル文化を始めるためのデータ分析を実演します。ヒト肺微小血管内皮細胞は、EGMの6ウェルプレートで90〜100%のコンフルエンス、5%FBS成長因子と抗生物質を含む2つの培地。トロンビンによる治療の30分前にメディアを飢餓培地に交換します。.30分後、細胞を0.05単位/ミリリットル、トロンビンで処理するか、またはコントロールとして未処理のままにします。細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で6時間インキュベートします。6時間の治療の後。Nirvanaキットを使用して、処理した細胞とコン

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組合せ miRNA 細胞周期の調節、血管新生治療の解析

我々は、RNA精製と組み合わせてリボソーム中の増強された緑色蛍光タンパク質(EGFP)のEC特異的遺伝的タグを介して、マウス脳、肺および心臓組織における血管内皮細胞(EC)からリボソーム結合mRNAを精製するアプローチを提示する。.

生体内細胞からのRNA単離に対するリボソーム親和性精製(TRAP)の翻訳

患者由来の内皮との全血相互作用を調べるインビトロ血管疾患モデルを紹介する。このシステムは、様々な状況下での原発性内皮細胞の血栓形成特性の研究を可能にする。この方法は、凝固の異なる段階でのその際の血栓性および抗凝固療法において評価するのに特に適している。...

全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル

プロトコルは、ヒト腸間膜動脈からの内皮細胞の単離、培養、およびプロファイリングを記載している。さらに、空間トランスクリプトミクスのためにヒト動脈を調製する方法が提供される。プロテオミクス、トランスクリプトミクス、および機能アッセイは、単離された細胞に対して行うことができる。このプロトコルは、任意の中型または大型の動脈に転用することができる。...

トランスクリプトームレベルでのヒト原発性腸間膜動脈内皮細胞の単離とプロファイリング

このプロトコルは費用効果が大きいトランスクリプトーム ベースの薬剤のスクリーニングのためのex 生体内 または 生体外の 細胞培養からのトランスクリプトーム データ前処理へのワークフローを記述する。...

費用対効果の高いトランスクリプトームベースの薬物スクリーニング

このプロトコルには、Nanostring...

デジタル空間プロファイリングのための形態学およびRNA保存された石灰化動脈の準備・処理

本研究は、せん断応力を用いて血液中の血栓形成を誘発し、多次元読み取りによって血栓を特徴付けるマイクロ流体アッセイを記述しています。このアッセイは血液サンプルの血栓促進傾向を測定できるため、疾患診断、薬剤開発、さらには血栓症に関連する基本的なメカニズム研究に役立ちます。...

血栓プロファイリングアッセイ:生体力学的血栓形成を包括的に特徴づけるためのマイクロ流体ベースのプラットフォーム

学ぶRNA-seqプロトコルでトロンビン処理したヒト肺微小血管内皮細胞のトランスクリプトームを解析する方法。RNA抽出、ライブラリ構築、シーケンス、データ解析、RT-PCRによる検証を含む完全な手順を解説します。

RNA-seqのトロンビン処理におけるトランスクリプトームの解析と制御ヒト肺微小血管内皮細胞

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