Name: RNA-seqのトロンビン処理におけるトランスクリプトームの解析と制御ヒト肺微小血管内皮細胞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 18 min 30 s
Description: 学ぶRNA-seqプロトコルでトロンビン処理したヒト肺微小血管内皮細胞のトランスクリプトームを解析する方法。RNA抽出、ライブラリ構築、シーケンス、データ解析、RT-PCRによる検証を含む完全な手順を解説します。

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著者らは、我々のデータ解析のためのそれらのコンピューティング·クラスタの使用のために子供のマーシー病院や診療所で博士スティーブンKingsmoreと小児ゲノム医学センターに感謝したいと思い、イルミナのフィールドサービスチーム（エリザベス·ボワイエ、スコット·クッ​​ク、マーク·クック）と技術彼らの迅速な対応と次世代DNAシーケンシング楽器、HiScanSQ、およびデータ品質分析の実行に関する有用な提案のためのコンサルタントチーム。この作品は、子供のマーシー病院や診療所の健康グラントHL080042（SQY）とスタートアップ資金や寄付金の国立研究所、カンザスシティ、ミズーリ大学（SQYへ）によって部分的にサポートされていました。

<html>このプロトコルを概説するフローチャートを図1に表示されます。 1。トロンビン、RNA単離、RNAの品質評価と定量で細胞を処理する<ol><li> 5％のFBS、成長因子および抗生物質によるEGM-2培地で6ウェルプレートで90〜100％コンフルエントまで培養ヒト肺微小血管内皮細胞（HMVEC-LBL）（Lonza社、カタログ番号CC-3202）。 </li><li>飢餓·メディア（0％FBS）を30分トロンビンによる治療に先立って、メディアを変更してください。 </li><li> 0.05 U / mlのトロンビンを用いて細胞を治療したり、℃、5％CO 2、37℃で6時間のコントロールとして未処理のままにしておきます。 </li><li>メーカーの指示に従ってアンビオンミールヴァナキットを使用して処理した細胞および対照細胞から全RNAを単離する。 </li><li> Experionの自動電気泳動Station上の標準プロトコルに従ってExperionのStdSense真核生物RNAチップを搭載したRNAの品質を評価する（= &quot;_blank&quot;&gt; www.bio-rad.com）。 </li><li>標準分光光度法を用いてRNAを定量化する。 </li></ol> 2。ライブラリーの構築とシーケン<ol><li>出発原料として、サンプルあたり高品質のtotal RNA 1μgを使用します。 </li><li>ライブラリーを構築するために、イルミナ（プロトコル＃15008136 Rev. A翻訳版）からの標準的な手順に従ってください。このプロトコルでは、ポリ2ラウンドの（）を含むmRNAの選択は、rRNAの塩基配列決定を最小限に抑えるためにrRNAを除去するために行われている。 </li><li> Experionの自動電気泳動駅（上の標準プロトコルに従ってExperionのDNAを1Kチップを使用してライブラリの品質評価<a href="http://www.bio-rad.com" target="_blank">www.bio-rad.comを</a> ）。 </li><li>定量PCRを使用してライブラリを定量化：以前に標準曲線とライゲーションアダプターに特異的なプライマーとして、配列決定されたライブラリを使用してください。未知のライブラリ（ すなわち 1:100、1:500および1:1000）の希釈液の範囲を使用します。 qPCRにアコを実行SyberGreen MMプロトコルにrding、各ライブラリの元の原液濃度を計算します。 </li><li>クラスタフローセルへの準備が整うまで、-20℃で10 nMおよびストアにライブラリの株式を希釈します。 </li><li>ときに、クラスタフローセルをする準備ができて、水浴中CBOT試薬プレートを解凍します。 CBOTは、クラスタの生成プロセスを合理化するために使用されるイルミナ楽器です。 </li><li> CBOT楽器を洗う。 </li><li>ライブラリを変性：13μlの1×TEと6μlの10μMのライブラリを組み合わせると、チューブの側面に、1μlの1NのNaOHを（イルミナ社によって提供される）を追加します。渦は、スピンダウンし、室温で5分間インキュベートし、氷上で変性したライブラリを配置。 </li><li>ライブラリを希釈：12 PMの最終濃度996μlのHT1と4μlの変性ライブラリを組み合わせることにより予冷ハイブリダイゼーション緩衝液（HT1、イルミナによって提供される）で変性したライブラリを希釈します。氷上の変性および希薄化ライブラリを配置します。 </li><li> 、CBOTプレートの管のそれぞれの行を反転すべての試薬は融解していることを保証します。プレートをスピンダウンし、/パンク箔シールを取り外して、CBOTにロード。 </li><li>ストリップチューブに希釈し、変性したライブラリのアリコートを120μlは、1から8までのラベルが付いた。制御スパイクのように各試験管に1.2μlの希釈、変性PHIX制御ライブラリ（イルミナ）を追加します。ボルテックスし、チューブをスピンダウンして、正しい向きでCBOT（右にチューブ＃1）上にロードします。 </li><li> CBOTにフローセルとマニホールドをロードします。 </li><li>フローチェックを完了し、クラスタリングの実行を開始します。 </li><li>実行が完了したら、すべてのレーンを横切っ試薬送達を確認してください。異常をメモしておきます。どちら4℃で直ちにシーケン実行を開始またはチューブ中でフローセルを保存</li><li>シーケンシング合成による（SBS、イルミナ）の試薬を解凍します。 </li><li>切断ミックスに触れた後、他の試薬に触れないように確認しながら、試薬トレイ上の適切な箇所に試薬をロードします。 </li><li> NOを使用N-シークエンスフローセル（ つまり以前に配列決定した1）、プライム試薬ラインを2回押します。 </li><li> 70％エタノールとレンズペーパーに続いて70％エタノールとキムワイプとシーケンスフローセルを、徹底的に清掃してください。どんなスジ用フローセルを点検してください。必要に応じて再清掃してください。 </li><li>シーケンサーにフローセルをロードして、マニホールドとフローセルの間のシールがタイトであることを保証するためにチェックフローを実行します。 </li><li>シーケンスの実行を開始します。 </li><li>彼らは実行時 ​​に利用可能になると品質メトリクス（クラスタの密度を例えば 、フィルタを通過するクラスタ、Q30、強度）を評価する。 </li><li>ラン全体で強度を監視します。 </li><li> 101サイクルが完了すると、2番目の読み出し完了するターンアラウンド化学を実行します。ペアリングエンド試薬及び第2のリード定款バッファ（ICBは、SBSの試薬の成分、イルミナ）を解凍し、試薬をロードします。 </li><li>第2 回は、強度、Q30読ん評価、シーケン実行を継続ランの進行状況としてND他の品質メトリクス。 </li></ol> 3。データ解析<ol><li>ベースコール·ファイル（。BCL）ファイルに変換するCASAVAの最新バージョン（イルミナ、現在は1.8.2）を使用します。fastqファイルは、各サンプルのシングルfastqファイルの作成を確実にするために0にfastq-クラスタカウントを設定する。下流解析用fastqファイルを解凍します。 </li><li>超高スループット短い読み取りのアライナ（ボウタイ、0.12.7）6およびSAMtools（0.1を用いて哺乳動物サイズのゲノムを読み取ったRNA-seqを揃えトップハットの最新バージョン（1.4.1）5を使用してペアリング終了アライメントを実行します。 17）7。 SAMtoolsは、SAM形式で後処理アライメントを行なうための各種ユーティリティが実装されています。参照ヒトトランスクリプトームはiGenomes（からダウンロードすることができます<a href="http://www.illumina.com" target="_blank">www.illumina.com</a> ）。トップハットを実行している、我々はFR-unstranded（デフォルト）などのライブラリ·タイプ·オプションを含む、すべてのデフォルトのパラメータ設定を使用していました。 </li><li>私達8ソフトウェアパッケージプログラムCuffDiff、カフスの部分（1.3.0）ING、人間の基準に基づいて、トランスクリプトーム、前者で差次的に発現する遺伝子の転写産物を選別するためのコントロール細胞にトロンビン処理した細胞を比較します。この比較は、既知の転写産物の発現差を検出します。表形式で結果を可視化するには、Microsoft Excelを使用します。カフス·プログラムを実行して、我々は、すべてのデフォルトパラメータの設定を使用しました。 FPKMとのそれらの遺伝子転写産物は&lt;0.05、P&gt; 0.05は除外されます。 </li><li>小説アイソフォームを検出するために、基準のトランスクリプトームなしでカフスを実行します。 Cuffcompareを使用して、リファレンスゲノムにサンプルトランスクリプト·ファイルを比較し、1分析用リファレンスゲノムと第二の分析のための基準ゲノムとして合成制御トランスクリプトファイルとして結合されたトロンビントランスクリプト·ファイルを使用してCuffdiffを備えた差動式をテストします。表形式で結果を可視化するには、Microsoft Excelを使用します。再び、thosの電子遺伝子転写FPKMと&lt;0.05およびp&gt; 0.05は除外されます。このステップの後、捜査官は、UCSCゲノムブラウザのホームページ（に新たに報告された成績証明書のリストをアップロードすることを選ぶことができ<a href="http://genome.ucsc.edu/" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/</a>手動検査によりその妥当性を確認するため）。 </li><li>工夫パスウェイ解析（IPAに発現差のある遺伝子のリストを提出<a href="www.ingenuity.com" target="_blank">www.ingenuity.com</a>トロンビン処理によって影響を受ける遺伝子および経路の特徴づけのために）。このステップでは、捜査官は、カマーバンド（使用することを選ぶかもしれ<a href="http://compbio.mit.edu/cummeRbund/" target="_blank">http://compbio.mit.edu/cummeRbund/</a>視覚化、管理を支援するために）、カフス、RNA-seqの出力を分析する作業を支援し、簡素化するように設計されているRパッケージを、とCuffdiff分析によって生成されたデータのすべてを統合します。 </li></ol> 4。定量的リアルタイムリポによるRNA-seqの結果の検証lymerase連鎖反応（QRT-PCR） <ol><li>制御およびトロンビ​​ン処理HMVEC-LBLセル、ステップ1.6から1.4に記載されたRNAの品質評価およびRNA定量からのtotal RNA抽出を行います。 </li><li>メーカーの指示（インビトロジェン社、18080から051）に続いてのSuperScript IIIファーストストランド合成システムRTのキットと、各サンプル1μgの全RNAから相補的DNAを生成します。 </li><li> CUGBP、Elav-likefamilymember1（CELF1、Hs00198069_m1）、Fanconianemia、complementationgroupD2（FANDCD2、Hs00276992_m1）、TNFreceptorの検出のためのTaqmanアッセイオンデマンドに設計されたオリゴヌクレオチドを​​用いて、Applied Biosystemsの第VIIa 7リアルタイムPCRシステムで定量RT-PCR解析を実行関連因子1（TRAF1、Hs01090170_m1）、およびβ-アクチン（ACTB、Hs99999903_m1）。各サンプルは、トータルRNAの5 ngに相当するテンプレートを持っていた。 DDCt法を用いて定量を測定し、β-アクチンに正規化する。各アッセイは複製され、少なくとも3生物を越えて行った。 </li></ol>

<ol><li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li>
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</ol>

特別な利害関係は宣言されません。

主な手順 RNAの取り扱い：RNaseがあっても、最も高品質のRNAを低下させます従ってケアはRNAを10の分離、貯蔵及び使用時に注意が必要です。手袋は常に人間の手で発見のRNaseの混入を防ぐために着用されています。手袋は、特に皮膚、ドアノブや他の共通の表面に触れた後、頻繁に変更する必要があります。ピペットのセットは、単に仕事をRNAに専念すべきであり、すべてのヒントやチューブは、RNaseフリーであるべきである。 RNAの単離と下流のアプリケーションは、日常などのRNase-ZAPとして製品に除染されている低トラフィック地域で行われるべきである。劣化はまた、凍結融解の繰り返しで発生する可能性があります。これらは分離直後にダウンストリームアプリケーション用のRNAを分取することで最小限に抑えることができます。あるいは、cDNAを直接分離後に、そのような定量RT-PCRなどのダウンストリーム·アプリケーションのために行うことができます。 RNAは-80℃で保存し、使用中に氷の上で保たれるべきである。また、IMPで完全に解凍し、ボルテ...

<table border="1"><tbody><tr><td width="183"> 試薬や機器 </td><td width="85"> 会社 </td><td width="185"> カタログ番号 </td><td width="359"> 注釈 </td></tr><tr><td>ヒト肺微小血管内皮細胞</td><td>ロンザ</td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td>ロンザ、Bulletのキット</td><td>ロンザ</td><td> CC-3202 </td><td> EGM-2、FBS、成長因子や抗生物質が含まれています</td></tr><tr><td>トロンビン</td><td>シグマ</td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td>アンビオンミールヴァナキット</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> AM 1560 </td><td></td></tr><tr><td>のRNaseザップ</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> ExperionのStdSens RNA </td><td>バイオ·ラッド</td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> TruSeq RNAの調製キット</td><td>イルミナ</td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> AMPureXPビーズ</td><td>ベックマン·コールター</td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td>スーパースクリプトII逆転写酵素</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> ExperionのDNAの1K </td><td>バイオ·ラッド</td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td>のQuantiTect SyberGreen </td><td>キアゲン</td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PEのクラスタ生成キット</td><td>イルミナ</td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> PHIXコントロールキット</td><td>イルミナ</td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200サイクルSBSキット</td><td>イルミナ</td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> HiScanSQ * </td><td>イルミナ</td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> CBOT </td><td>イルミナ</td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td>定量PCRマシン - Viia7 </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td>モデル＃VIIA7 /機器＃10631261 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td> Experionのシステム</td><td>バイオラッド</td><td> 7007001 </td><td>バイオアナライザは、代替システムである</td></tr><tr><td>分光光度計</td><td>バイオテック</td><td>エポックマイクロプレート分光光度計</td><td>または同等の</td></tr><tr><td>遠心分離機 - ソーバルレジェンドXTR </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 75004521 </td><td>または同等の</td></tr><tr><td>マグネットスタンド</td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> 96ウェルサーモ</td><td>一般的なラボサプライヤー</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表3主な試薬のリストとEメジャーquipment。 *、ビデオでは、代わりにHiScanSQのHiSeq1000が実証された。 </td></tr></tbody></table>

rna-seqのトロンビン処理におけるトランスクリプトームの解析と制御ヒト肺微小血管内皮細胞

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

mRNAレベルの測定を介して細胞内での遺伝子発現の特性は、細胞の転写機構を外部信号（ 例えば、薬物治療）、またはどのように細胞が健康な状態と病気の状態の間で異なることによりどのような影響を受けるかを決定するのに有用なツールです。次世代DNAシーケンシング技術の出現と連続洗練された、RNAシーケンシング（RNA-seq）は、転写物の全ての種をカタログ化するすべての発現している遺伝子の転写構造を決定するために、定量化するトランスクリプトーム解析のますます普及している方法となっている与えられた細胞、組織または生物1,2における転写産物の全体集合の変化の発現レベル。 RNA-seqは徐々にそれが完全なトランスクリプトームのプロファイリングの利点を持っているので、トランスクリプトーム解析のための好ましい方法として、DNAマイクロアレイを交換するデジタルdatum型（任意の転写物のコピー数）を提供すると、任意の既知のゲノムシーケンシャルに頼っていませんCE 3。 ここでは、トロンビン処理の有無にかかわらず、ヒト肺微小血管内皮細胞のトランスクリプトームのプロファイルへのRNA-seqを適用するための完全かつ詳細なプロトコルを提示。このプロトコルは、と題する我々の最近発表された研究に基づいている我々は正常ヒト肺微小血管内皮細胞の最初の完全なトランスクリプトーム解析を行っている4 &quot;RNA-seqはトロンビンで処理したヒト肺微小血管内皮細胞における遺伝子およびそのアイソフォームの新規トランスクリプトームを明らかにする&quot; RNA-seqを使用してトロンビンで処理した。これは、炎症状態、癌、糖尿病、冠状動脈性心臓病の病因におけるトロンビン媒介内皮機能不全の分子機構についての洞察を得るためにさらなる実験のための前例のない資源をもたらし、これらの疾患に対する治療ターゲットの潜在的な新規のリードを提供しています。 このプロトコルの記述テキスト4つの部分に分かれています。最初の部分は、トロンビンおよびRNAの単離、品質分析と定量化したヒト肺微小血管内皮細胞の治療について説明しています。第二部では、ライブラリーの構築およびシーケンシングを説明しています。第三部は、データ分析を説明しています。 4番目の部分は、RT-PCR検証アッセイを記載する。いくつかの重要な手順の代表的な結果が表示されます。重要なステップでの成功を後押しするための有用なヒントや注意事項は、ディスカッション·セクションで提供されています。このプロトコルはトロンビンで処理したヒト肺微小血管内皮細胞を使用していますが、それは哺乳類と非哺乳類細胞の両方で、さまざまな刺激または阻害剤で処理した組織内のプロファイル·トランスクリプトームに一般化することができる、または健康状態の間の細胞または組織にトランスクリプトームを比較する疾病状態。

ステップ1：28S：18S比は伝統的にRNA分解の指標として用いられる。理想的には、28Sのピークは18歳のバンド（2の比）の約2倍の面積を持つ必要がありますが、この理想的な比率は、しばしば、実際には見られません。さらに、28S：分光光度法から得られた18S比はRNAの分解量を過小評価することができます。より正確に劣化、したがって、RNAサンプルの品質を定量化するために、Experionのシステムは、RNAの品質インジケータ（RQI）数を計算します。 RQIアルゴリズムは、標準化され、分解されたRNAの一連のサンプルからのデータにRNAサンプルの電気泳動図を比較して、自動的に10（インタクトなRNA）と1（分解されたRNA）の範囲の数値を返します。 RNAの品質は8より大きい理想的には少なくとも7のRQIを有するべきであり、 図2は、8.4のRQIで高品質のRNAサンプルを用いたExperionの結果を示しています。 のためにステップ2：ライブラリは約250から300 bpの広...

このプロトコルは、トロンビン処理の有無にかかわらず、ヒト肺微小血管内皮細胞にトランスクリプトームのプロファイルへのRNA-seqの、強力な次世代DNAシーケンシング技術を適用するための完全かつ詳細な手順を示します。このプロトコルは、異なる試薬又は病気の状態によって影響を受ける様々な細胞や組織に一般化できる。

RNA-seqのトロンビン処理におけるトランスクリプトームの解析と制御ヒト肺微小血管内皮細胞

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

この手順の全体的な目標は、強力な次世代DNAシーケンシング技術であるRNA-Seqをトランスクリプトームのプロファイリングに適用するための完全で詳細なプロセスを提示することです。これは、まずトロンビン処理の有無にかかわらず、ヒト肺微小血管内皮細胞から全RNAを単離し、RNAの品質を確認することによって達成されます。2番目のステップは、それらのRNAサンプルからDNAライブラリを構築することです。cbot装置を使用してクラスター生成を合理化し、HighSeq 1000でDNAシーケンシングタスクを実行します。次に、データ解析を行い、最終的に発現差のある遺伝子転写産物を同定し、表示します。最後のステップは、RT TP CRによってRN aeqの結果を検証することです。トランスクリプトーム解析用のDNAマイクロアレイなどの既存の方法に対するICの主な利点は、ICが完全なトランスクリプトームをプロファイリングし、デジタルタイプのデータを提供できること、および細胞内の遺伝子発現の既知のゲノム化に依存しないことです。一方、MRAレベルの測定は、細胞の機構の転写が外部シグナルによってどのように影響を受けるか、または細胞が健康状態と疾患状態の間でどのように異なるかを判断するのに役立つツールです。このプロトコルでは、処理されたトロビンおよび制御ヒト肺微小血管インドシン細胞におけるトランスクリプトームのIC分析を実演します。このプロトコルは、最近発表された研究に基づいており、私たちは成功裏に高SEQ 1000、人気のある次世代のDNAシーケンシングプラットフォームである次世代DNAシーケンシングプラットフォームであるHigh SEQ 1000でRNA-Seqを使用してトロンビンで処理されたヒト肺微小血管内皮細胞の最初の完全なトランスクリプトーム分析を実行しました。VS 7 R-T-P-C-Rシステムを使用して、Dr.Denovaは、ヒト肺、微小血管内皮細胞および全細胞RNA単離のトロンビン治療を実演します.Mrs.マーガレットギブソンは、RNA品質とDNAライブラリだけでなく、cbot上のクラスター生成をチェックするExperianシステムを実演します。そして、ディミトリ・グレゴール博士は、このプロトコル文化を始めるためのデータ分析を実演します。ヒト肺微小血管内皮細胞は、EGMの6ウェルプレートで90〜100%のコンフルエンス、5%FBS成長因子と抗生物質を含む2つの培地。トロンビンによる治療の30分前にメディアを飢餓培地に交換します。.30分後、細胞を0.05単位/ミリリットル、トロンビンで処理するか、またはコントロールとして未処理のままにします。細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で6時間インキュベートします。6時間の治療の後。Nirvanaキットを使用して、処理した細胞とコントロール細胞から全RNAを分離します。Experian自動電気泳動ステーションの標準プロトコルに従って、Experianの標準センス真核生物のRNAチップを使用してRNAの品質を評価します。最後に、ライブラリ構築のための標準的な分光測光法を使用してRNAを定量します。サンプルあたり1マイクログラムの高品質トータルRNAを出発物質として使用して、ライブラリを構築します。メーカーの標準プロトコルに従ってください。このプロトコルでは、Mr.mRNAを含むポリの選択を2ラウンド行います。RNAシーケンシングを最小限に抑えるためにRNAを除去するには、ExperianのDNA one Kチップを使用してライブラリの品質を評価します。Experian自動電気泳動ステーションの標準プロトコルに従っています。定量的なリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を用いてライブラリを定量します。書かれたプロトコルに記載されているように、Q-R-T-P-C-Rと略されます。このビデオに添付して、サイバーグリーンMMプロトコルに従ってQ-R-T-P-C-Rを実行し、各ライブラリの元のストック濃度を計算します。ライブラリーストックを10ナノモルに希釈し、摂氏20度で保存します。フローセルをクラスター化する準備ができたら、cbot試薬プレートをウォーターバスで解凍します。CBOTは、クラスタ生成プロセスを効率化するために使用される機器です。cbot装置を洗浄した後、最初に13マイクロリットルの1XTEと6マイクロリットルの10ナノモルを組み合わせてライブラリを変性させます。次に、各チューブの側面にライブラリを作成し、1マイクロリットルの1つの通常の水酸化ナトリウムを追加し、チューブを回転ダウンさせてボルテックスし、室温で5分間インキュベートします。次に、変性したライブラリを氷の上に置きます。次に、996マイクロリットルのバッファーと4.0マイクロリットルの変性ライブラリーを組み合わせて、最終濃度12ピコモルの変性ライブラリーを予め冷却したハイブリダイゼーションバッファーで変性ライブラリーを希釈します。変性希釈したライブラリを上に置きます。次に、cbotプレートの各チューブ列を反転させ、すべての試薬が解凍されていることを確認します。プレートを回転させた後、水酸化ナトリウムチューブの列からホイルシールを取り外し、cbotアリコートにロードします。希釈した変性ライブラリー120マイクロリットルを、1〜8とラベル付けされたストリップチューブに入れます。希釈した変性PHI Xコントロールライブラリー1.2マイクロリットルを各チューブにスパイクインコントロールとして追加します。チューブをボルテックスして回転させた後、チューブ番号1を右にして正しい向きでcbotにロードします。フローセルとマニホールドをcbotにロードします。フロー チェックを完了し、クラスタリングの実行を開始します。ランが完了したら、すべてのレーンで試薬の送達を確認します。異常があればメモしてください。シーケンシングランをすぐに開始するか、フローセルを付属のチューブに摂氏4度で保存します。シーケンシングを開始します。合成試薬でシーケンシングを解凍します。試薬トレイの適切な場所に試薬をセットし、他の試薬に触れないように注意してください。切断ミックスに触れた後、nonsシーケンシングフローセルプライミングを使用して、試薬ラインを70%エタノールとKimワイプでシーケンシングフローセルを2回徹底的に洗浄し、続いて70%エタノールとレンズペーパーでシーケンシングフローセルを完全に洗浄します。フローセルに縞がないか検査し、必要に応じて再清掃します。フローセルをシーケンサーにロードし、フローチェックを実行して、マニホールドとフローセルの間のシールがしっかりしていることを確認します。シーケンシングランを開始します。実行中に利用可能になった品質メトリックを評価します 実行中の強度を監視します。101サイクルが完了した後。ターンアラウンドケミストリーを実行して、2回目の読み取りを完了します。最初の父は試薬をペアにし、2番目の読み取り組み込みバッファー。次に、試薬をロードし、シーケンシングを続行し、評価を実行します。次に、実行の進行に合わせて、強度 Q3 やその他の品質指標を読み取ります。データ分析を開始するには、最新バージョンの cassava を使用して、ベース呼び出しファイルを FAST Q ファイルに変換します。高速 Q クラスター数を 0 に設定すると、1 つの高速 Q ファイルが作成されます。サンプルごとに、ダウンストリーム分析用の高速Qファイルを解凍します。最新バージョンのトップハットを使用してペアとアライメントを実行し、超ハイスループットショートリードを使用してRNA-Seqリードを哺乳類サイズのゲノムにアラインメントし、SAMツールで後処理アライメントのためのさまざまなユーティリティを実装します。参照ヒトトランスクリプトームは、カフスソフトウェアパッケージのプログラムカフ差分部分を使用してフラグメントアンストランドとしてライブラリタイプオプションを含む、すべてのデフォルトのパラメータ設定を使用してトップハットを実行するIゲノムからダウンロードすることができます。トロンビン処理細胞と対照細胞を比較します。トロンビン処理細胞中の差次的に発現する遺伝子転写産物を、ヒト参照トランスクリプトームに基づいてスクリーニングします。次に、スプレッドシートを使用して、結果を表形式で視覚化します。この場合、すべてのデフォルトのパラメータ設定を使用し、FPKMが0.05未満でpが0.05より大きい遺伝子転写産物をフィルタリングして、参照なしで新しいアイソフォームランカフリンクを検出しました。トランスクリプトームは、カフコンペアを使用して、サンプルの転写ファイルを参照ゲノムと比較します。1つの解析では結合トロンビン転写産物ファイルを参照ゲノムとして、2つ目の解析では結合されたコントロール転写産物ファイルを参照ゲノムとして、カフ差分で差次的発現を試験し、再度、スプレッドシートを使用して結果を表形式で視覚化します。以前と同様に、FPKMが0.05未満でpが0.05より大きい遺伝子転写産物をフィルタリングしました。このステップの後、研究者は、新たに報告された転写産物のリストを UC SC ゲノム ブラウザー Web サイトにアップロードして、手動検査によってその有効性を確認することを選択できます。差次的に発現する遺伝子のリストは、トロンビン処理の影響を受ける遺伝子と経路の特性評価のために、創意工夫の経路分析に提出することもできます。このステップでは、研究者は、カフスRN aeq出力の分析タスクを支援し、簡素化するように設計されたRパッケージであるcummerbundを使用して、カフ差分分析によって生成されたすべてのデータの管理、視覚化、および統合を支援することを選択できます。RN aeq結果の検証は、まずQ-R-T-P-C-Rによって行われ、ビデオの前半で示したように、コントロールおよびトロンビン処理されたヒト肺微小血管内皮細胞からの全RNA単離、RNA品質評価、およびRNA定量を行います。次に、各サンプルの1マイクログラムの全RNAから、メーカーの指示に従って3本の第一鎖合成システムrtを上付き文字で生成します。最後に、このビデオに添付されている書面によるプロトコルに記載されているTAC MAN assay on demand設計のヌクレオチドを使用して、VI a 7リアルタイムPCRシステムでQ-R-T-P-C-R分析を実行し、そこに説明されている定量を測定します。28 sと18 Sの比率は、従来、RNA分解の指標として使用されてきました。分解をより正確に定量化するために、エクスペリエンスシステムはRNA品質指標またはRQI数を計算します。RQIアルゴリズムは、RNAサンプルのエレクトロフェログラムを一連の標準化された分解RNAサンプルのデータと比較し、10から1までの数値を自動的に返します。RNAサンプルのRQIは少なくとも7、理想的には8より大きい必要があります。これらのExperianの結果は、RQIが8.4の高品質のRNAサンプルを示しています。ライブラリは、このExperianの結果の図に示すように、高品質のライブラリのために約250〜300塩基対の広帯域を持つ必要があります。ここでは、標準曲線サンプルと1つの未知サンプルのQ-R-T-P-C-R結果を示しています。シーケンシングランの進行状況と品質は、ラン全体を通して常に観察する必要があります。この図は、最初のサイクルイメージングステップ中の適切なクラスター密度を示しています。これは、実行の最初の表示です。高品質のクラスターは、明るく焦点が絞られている必要があります。第 1 サイクルの完了後に生成される第 1 ベースレポートの例を示します。この時点で、推定されたクラスター密度強度レベルと焦点品質を評価することが重要です。サイクル4の後の次の品質チェックポイントをここに示します。これは、各レーンの絶対クラスター密度を示しています。クラスター密度は、サイクル 13 以降、1 平方ミリメートルあたり 850 K を超えてはなりません。フェーズとプレフェーズの統計が計算されます。一般的な数値は 0.1 から 0.25 の間です。主要な品質評価は、いくつかの品質指標が計算されるサイクル24の後に可能になります。Q3 を超える読み取りの割合は、ベースに対する信頼度の尺度です。Q スコアが 3 で読み取りを呼び出すと、基本呼び出しが間違っている可能性が 1000 分の 1 であることを意味します。Qスコアは実行が進むにつれて減少しますが、読み取りの95%以上がQ3を満たすかそれを超えることから開始する必要があります。filter または pf を渡すクラスターは、実際のシーケンス データが取得されるクラスターです。理想的には、これは85%以上である必要がありますクラスターpfは、フェーズ、フェーズ前の強度などの多くの要因に基づいており、実行が進行しても Q3.It は変化しません。アラインド率は、FI x ゲノムにリアルタイムでアラインメントされるリードの尺度です。約 1%FI x ライブラリがサンプルライブラリにスパイクされたため、アライメントされたパーセントは 0.5 から 1 の間である必要があります。この統計は、ライブラリーの内容がクラスターによってよく表されており、ここにリストされているクラスター生成バイアスはなく、コントロール細胞とトロンビン処理されたヒト肺微小血管内皮細胞の両方で発現遺伝子とアイソフォームが挙げられていることを示しています。特に、約26, 000の新規アイソフォームが検出されており、RN aeqの強度を示しています。未知のRNAを同定することができます。あるいは、スプライシングされた転写産物や代替プロモーターの使用など、マイクロアレイ技術では検出できないものもあります。RNA-Seqは、マイクロアレイによって不正確、定量化、または検出されない、存在量の少ない転写産物を測定し、別のアプローチを使用してRNA-Seqの結果を検証することもできます。A-Q-R-T-P-C-R実験を行い、RNA-Seqデータ中の3つの異なる遺伝子をアッセイし、TRの1つは自己7.96倍にアップレギュレーションされました。1つは1.16倍にダウンレギュレーションされ、2つはQ-R-T-P-C-Rデータで1.70倍ダウンレギュレーションされました。これらの対応する数値は、それぞれプラス7.25倍マイナス1.15倍とマイナス2.07倍です。RNA-SeqとQ-R-T-P-C-Rでアッセイしたこれら3つの遺伝子の結果はよく一致しており、RNA-Seqの結果を裏付けています。このプロトコルは、シニア細胞のヒト肺微小血管で治療されたトロビンの1つの時点でのICに特異的ですが、異なる刺激や阻害剤で処理された他の細胞組織でのマルチタイムポイント研究や研究、または健康な状態と疾患状態との間の細胞または組織のトランスクリプトームの比較に容易に適応できます。これは高SQ 1000に特有のものですが、このプロトコルはHighSeqファミリーまたはゲノムアナライザーのいずれにも適用できます。クラスター生成ステップとシーケンシング試薬をわずかに変更した2つの装置。その他、solidシリーズなどの次世代DNAシーケンシングプラットフォーム。GSシステムだけでなく、いくつかの新しいシステムもRNA-Seqの目的で採用されています。彼らのライブラリー構築とシーケンシング手順はわずかに異なる場合がありますが、このプロトコルで提示されているRNAハンドリングのヒント、データ解析部分、およびR-T-P-C-Rによる検証は、RNA-Seqアプリケーションにとって参照価値を持つことができます。

rna-seq-analysis-transcriptomes-thrombin-treated-control-human

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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学ぶRNA-seqプロトコルでトロンビン処理したヒト肺微小血管内皮細胞のトランスクリプトームを解析する方法。RNA抽出、ライブラリ構築、シーケンス、データ解析、RT-PCRによる検証を含む完全な手順を解説します。

RNA-seqのトロンビン処理におけるトランスクリプトームの解析と制御ヒト肺微小血管内皮細胞

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