RNA-seqのトロンビン処理におけるトランスクリプトームの解析と制御ヒト肺微小血管内皮細胞

この手順の全体的な目標は、強力な次世代DNAシーケンシング技術であるRNA-Seqをトランスクリプトームのプロファイリングに適用するための完全で詳細なプロセスを提示することです。これは、まずトロンビン処理の有無にかかわらず、ヒト肺微小血管内皮細胞から全RNAを単離し、RNAの品質を確認することによって達成されます。2番目のステップは、それらのRNAサンプルからDNAライブラリを構築することです。

cbot装置を使用してクラスター生成を合理化し、HighSeq 1000でDNAシーケンシングタスクを実行します。次に、データ解析を行い、最終的に発現差のある遺伝子転写産物を同定し、表示します。最後のステップは、RT TP CRによってRN aeqの結果を検証することです。トランスクリプトーム解析用のDNAマイクロアレイなどの既存の方法に対するICの主な利点は、ICが完全なトランスクリプトームをプロファイリングし、デジタルタイプのデータを提供できること、および細胞内の遺伝子発現の既知のゲノム化に依存しないことです。

一方、MRAレベルの測定は、細胞の機構の転写が外部シグナルによってどのように影響を受けるか、または細胞が健康状態と疾患状態の間でどのように異なるかを判断するのに役立つツールです。このプロトコルでは、処理されたトロビンおよび制御ヒト肺微小血管インドシン細胞におけるトランスクリプトームのIC分析を実演します。このプロトコルは、最近発表された研究に基づいており、私たちは成功裏に高SEQ 1000、人気のある次世代のDNAシーケンシングプラットフォームである次世代DNAシーケンシングプラットフォームであるHigh SEQ 1000でRNA-Seqを使用してトロンビンで処理されたヒト肺微小血管内皮細胞の最初の完全なトランスクリプトーム分析を実行し

ました。VS 7 R-T-P-C-Rシステムを使用して、Dr.Denovaは、ヒト肺、微小血管内皮細胞および全細胞RNA単離のトロンビン治療を実演します.Mrs.マーガレットギブソンは、RNA品質とDNAライブラリだけでなく、cbot上のクラスター生成をチェックするExperianシステムを実演します。

そして、ディミトリ・グレゴール博士は、このプロトコル文化を始めるためのデータ分析を実演します。ヒト肺微小血管内皮細胞は、EGMの6ウェルプレートで90〜100%のコンフルエンス、5%FBS成長因子と抗生物質を含む2つの培地。トロンビンによる治療の30分前にメディアを飢餓培地に交換します。.

30分後、細胞を0.05単位/ミリリットル、トロンビンで処理するか、またはコントロールとして未処理のままにします。細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で6時間インキュベートします。6時間の治療の後。

Nirvanaキットを使用して、処理した細胞とコントロール細胞から全RNAを分離します。Experian自動電気泳動ステーションの標準プロトコルに従って、Experianの標準センス真核生物のRNAチップを使用してRNAの品質を評価します。最後に、ライブラリ構築のための標準的な分光測光法を使用してRNAを定量します。

サンプルあたり1マイクログラムの高品質トータルRNAを出発物質として使用して、ライブラリを構築します。メーカーの標準プロトコルに従ってください。このプロトコルでは、Mr.mRNAを含むポリの選択を2ラウンド行います。

RNAシーケンシングを最小限に抑えるためにRNAを除去するには、ExperianのDNA one Kチップを使用してライブラリの品質を評価します。Experian自動電気泳動ステーションの標準プロトコルに従っています。定量的なリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応を用いてライブラリを定量します。

書かれたプロトコルに記載されているように、Q-R-T-P-C-Rと略されます。このビデオに添付して、サイバーグリーンMMプロトコルに従ってQ-R-T-P-C-Rを実行し、各ライブラリの元のストック濃度を計算します。ライブラリーストックを10ナノモルに希釈し、摂氏20度で保存します。

フローセルをクラスター化する準備ができたら、cbot試薬プレートをウォーターバスで解凍します。CBOTは、クラスタ生成プロセスを効率化するために使用される機器です。cbot装置を洗浄した後、最初に13マイクロリットルの1XTEと6マイクロリットルの10ナノモルを組み合わせてライブラリを変性させます。

次に、各チューブの側面にライブラリを作成し、1マイクロリットルの1つの通常の水酸化ナトリウムを追加し、チューブを回転ダウンさせてボルテックスし、室温で5分間インキュベートします。次に、変性したライブラリを氷の上に置きます。次に、996マイクロリットルのバッファーと4.0マイクロリットルの変性ライブラリーを組み合わせて、最終濃度12ピコモルの変性ライブラリーを予め冷却したハイブリダイゼーションバッファーで変性ライブラリーを希釈します。

変性希釈したライブラリを上に置きます。次に、cbotプレートの各チューブ列を反転させ、すべての試薬が解凍されていることを確認します。プレートを回転させた後、水酸化ナトリウムチューブの列からホイルシールを取り外し、cbotアリコートにロードします。

希釈した変性ライブラリー120マイクロリットルを、1〜8とラベル付けされたストリップチューブに入れます。希釈した変性PHI Xコントロールライブラリー1.2マイクロリットルを各チューブにスパイクインコントロールとして追加します。チューブをボルテックスして回転させた後、チューブ番号1を右にして正しい向きでcbotにロードします。

フローセルとマニホールドをcbotにロードします。フロー チェックを完了し、クラスタリングの実行を開始します。ランが完了したら、すべてのレーンで試薬の送達を確認します。

異常があればメモしてください。シーケンシングランをすぐに開始するか、フローセルを付属のチューブに摂氏4度で保存します。シーケンシングを開始します。

合成試薬でシーケンシングを解凍します。試薬トレイの適切な場所に試薬をセットし、他の試薬に触れないように注意してください。切断ミックスに触れた後、nonsシーケンシングフローセルプライミングを使用して、試薬ラインを70%エタノールとKimワイプでシーケンシングフローセルを2回徹底的に洗浄し、続いて70%エタノールとレンズペーパーでシーケンシングフローセルを完全に洗浄します。

フローセルに縞がないか検査し、必要に応じて再清掃します。フローセルをシーケンサーにロードし、フローチェックを実行して、マニホールドとフローセルの間のシールがしっかりしていることを確認します。シーケンシングランを開始します。

実行中に利用可能になった品質メトリックを評価します 実行中の強度を監視します。101サイクルが完了した後。ターンアラウンドケミストリーを実行して、2回目の読み取りを完了します。

最初の父は試薬をペアにし、2番目の読み取り組み込みバッファー。次に、試薬をロードし、シーケンシングを続行し、評価を実行します。次に、実行の進行に合わせて、強度 Q3 やその他の品質指標を読み取ります。

データ分析を開始するには、最新バージョンの cassava を使用して、ベース呼び出しファイルを FAST Q ファイルに変換します。高速 Q クラスター数を 0 に設定すると、1 つの高速 Q ファイルが作成されます。サンプルごとに、ダウンストリーム分析用の高速Qファイルを解凍します。

最新バージョンのトップハットを使用してペアとアライメントを実行し、超ハイスループットショートリードを使用してRNA-Seqリードを哺乳類サイズのゲノムにアラインメントし、SAMツールで後処理アライメントのためのさまざまなユーティリティを実装します。参照ヒトトランスクリプトームは、カフスソフトウェアパッケージのプログラムカフ差分部分を使用してフラグメントアンストランドとしてライブラリタイプオプションを含む、すべてのデフォルトのパラメータ設定を使用してトップハットを実行するIゲノムからダウンロードすることができます。トロンビン処理細胞と対照細胞を比較します。

トロンビン処理細胞中の差次的に発現する遺伝子転写産物を、ヒト参照トランスクリプトームに基づいてスクリーニングします。次に、スプレッドシートを使用して、結果を表形式で視覚化します。この場合、すべてのデフォルトのパラメータ設定を使用し、FPKMが0.05未満でpが0.05より大きい遺伝子転写産物をフィルタリングして、参照なしで新しいアイソフォームランカフリンクを検出しました。

トランスクリプトームは、カフコンペアを使用して、サンプルの転写ファイルを参照ゲノムと比較します。1つの解析では結合トロンビン転写産物ファイルを参照ゲノムとして、2つ目の解析では結合されたコントロール転写産物ファイルを参照ゲノムとして、カフ差分で差次的発現を試験し、再度、スプレッドシートを使用して結果を表形式で視覚化します。以前と同様に、FPKMが0.05未満でpが0.05より大きい遺伝子転写産物をフィルタリングしました。

このステップの後、研究者は、新たに報告された転写産物のリストを UC SC ゲノム ブラウザー Web サイトにアップロードして、手動検査によってその有効性を確認することを選択できます。差次的に発現する遺伝子のリストは、トロンビン処理の影響を受ける遺伝子と経路の特性評価のために、創意工夫の経路分析に提出することもできます。このステップでは、研究者は、カフスRN aeq出力の分析タスクを支援し、簡素化するように設計されたRパッケージであるcummerbundを使用して、カフ差分分析によって生成されたすべてのデータの管理、視覚化、および統合を支援することを選択できます。

RN aeq結果の検証は、まずQ-R-T-P-C-Rによって行われ、ビデオの前半で示したように、コントロールおよびトロンビン処理されたヒト肺微小血管内皮細胞からの全RNA単離、RNA品質評価、およびRNA定量を行います。次に、各サンプルの1マイクログラムの全RNAから、メーカーの指示に従って3本の第一鎖合成システムrtを上付き文字で生成します。最後に、このビデオに添付されている書面によるプロトコルに記載されているTAC MAN assay on demand設計のヌクレオチドを使用して、VI a 7リアルタイムPCRシステムでQ-R-T-P-C-R分析を実行し、そこに説明されている定量を測定します。

28 sと18 Sの比率は、従来、RNA分解の指標として使用されてきました。分解をより正確に定量化するために、エクスペリエンスシステムはRNA品質指標またはRQI数を計算します。RQIアルゴリズムは、RNAサンプルのエレクトロフェログラムを一連の標準化された分解RNAサンプルのデータと比較し、10から1までの数値を自動的に返します。RNAサンプルのRQIは少なくとも7、理想的には8より大きい必要があります。

これらのExperianの結果は、RQIが8.4の高品質のRNAサンプルを示しています。ライブラリは、このExperianの結果の図に示すように、高品質のライブラリのために約250〜300塩基対の広帯域を持つ必要があります。ここでは、標準曲線サンプルと1つの未知サンプルのQ-R-T-P-C-R結果を示しています。

シーケンシングランの進行状況と品質は、ラン全体を通して常に観察する必要があります。この図は、最初のサイクルイメージングステップ中の適切なクラスター密度を示しています。これは、実行の最初の表示です。

高品質のクラスターは、明るく焦点が絞られている必要があります。第 1 サイクルの完了後に生成される第 1 ベースレポートの例を示します。この時点で、推定されたクラスター密度強度レベルと焦点品質を評価することが重要です。

サイクル4の後の次の品質チェックポイントをここに示します。これは、各レーンの絶対クラスター密度を示しています。クラスター密度は、サイクル 13 以降、1 平方ミリメートルあたり 850 K を超えてはなりません。

フェーズとプレフェーズの統計が計算されます。一般的な数値は 0.1 から 0.25 の間です。主要な品質評価は、いくつかの品質指標が計算されるサイクル24の後に可能になります。

Q3 を超える読み取りの割合は、ベースに対する信頼度の尺度です。Q スコアが 3 で読み取りを呼び出すと、基本呼び出しが間違っている可能性が 1000 分の 1 であることを意味します。Qスコアは実行が進むにつれて減少しますが、読み取りの95%以上がQ3を満たすかそれを超えることから開始する必要があります。filter または pf を渡すクラスターは、実際のシーケンス データが取得されるクラスターです。

理想的には、これは85%以上である必要がありますクラスターpfは、フェーズ、フェーズ前の強度などの多くの要因に基づいており、実行が進行しても Q3.It は変化しません。アラインド率は、FI x ゲノムにリアルタイムでアラインメントされるリードの尺度です。約 1%FI x ライブラリがサンプルライブラリにスパイクされたため、アライメントされたパーセントは 0.5 から 1 の間である必要があります。

この統計は、ライブラリーの内容がクラスターによってよく表されており、ここにリストされているクラスター生成バイアスはなく、コントロール細胞とトロンビン処理されたヒト肺微小血管内皮細胞の両方で発現遺伝子とアイソフォームが挙げられていることを示しています。特に、約26, 000の新規アイソフォームが検出されており、RN aeqの強度を示しています。未知のRNAを同定することができます。

あるいは、スプライシングされた転写産物や代替プロモーターの使用など、マイクロアレイ技術では検出できないものもあります。RNA-Seqは、マイクロアレイによって不正確、定量化、または検出されない、存在量の少ない転写産物を測定し、別のアプローチを使用してRNA-Seqの結果を検証することもできます。A-Q-R-T-P-C-R実験を行い、RNA-Seqデータ中の3つの異なる遺伝子をアッセイし、TRの1つは自己7.96倍にアップレギュレーションされました。

1つは1.16倍にダウンレギュレーションされ、2つはQ-R-T-P-C-Rデータで1.70倍ダウンレギュレーションされました。これらの対応する数値は、それぞれプラス7.25倍マイナス1.15倍とマイナス2.07倍です。RNA-SeqとQ-R-T-P-C-Rでアッセイしたこれら3つの遺伝子の結果はよく一致しており、RNA-Seqの結果を裏付けています。このプロトコルは、シニア細胞のヒト肺微小血管で治療されたトロビンの1つの時点でのICに特異的ですが、異なる刺激や阻害剤で処理された他の細胞組織でのマルチタイムポイント研究や研究、または健康な状態と疾患状態との間の細胞または組織のトランスクリプトームの比較に容易に適応できます。

これは高SQ 1000に特有のものですが、このプロトコルはHighSeqファミリーまたはゲノムアナライザーのいずれにも適用できます。クラスター生成ステップとシーケンシング試薬をわずかに変更した2つの装置。その他、solidシリーズなどの次世代DNAシーケンシングプラットフォーム。

GSシステムだけでなく、いくつかの新しいシステムもRNA-Seqの目的で採用されています。彼らのライブラリー構築とシーケンシング手順はわずかに異なる場合がありますが、このプロトコルで提示されているRNAハンドリングのヒント、データ解析部分、およびR-T-P-C-Rによる検証は、RNA-Seqアプリケーションにとって参照価値を持つことができます。