遺伝子発現とE4orf4誘発細胞死にノックダウン効果の測定のための条件付きノックダウン細胞株の作製

次の実験の全体的な目標は、ACF 1またはSNF 2のHノックダウンがE、4、または4の誘導細胞死に及ぼす影響を観察することです。これは、ドキシサイクリンの添加によりACF 1またはSNF 2 H srnaの発現が条件付きで活性化され、第2のステップとしてACF 1またはSNF 2のHタンパク質のレベルが低下する細胞株の作製によって達成されます。得られた細胞株の細胞は、ドキシサイクリンで処理してACF 1またはSNF 2のH発現を低下させるか、または未処理のまま放置します。

次に、E-H-R-N-A耐性ACF1またはSNF2の有無にかかわらず細胞でE H.In 4または4の誘導細胞死の結果が得られ、ACF1またはSNF2のHがE、4または4の毒性に及ぼす影響を示す結果が得られ、JYアッセイを用いたアポトーシス形態を持つ核のカウントに基づいてE、4、または4の毒性に対するACF1またはSNF2のHレベルの影響を示す結果が得られる。この手法がRNAの一過性トランスフェクションなどの他の方法よりも優れている主な利点は、すべての細胞がS-H-R-N-Aを発現し、従来のプラスミドと共発現する細胞の割合が高いことです。この方法は、4 0 4が細胞死を誘発した場合の根底にあるメカニズムについての洞察を提供しますが、他のプロトン性タンパク質の研究にも適用できます。

アナ・レイフに加えて、私の研究室の研究者がこの手順の一部を実演します 誘導性細胞株プレートT-Rex 2 9 3細胞を約5倍の密度で生成する手順を開始するために 10センチメートルプレートあたり6個の細胞 10センチメートルプレートあたり8ミリリットルのDMEMに含まれる血清を含まないテトラサイクリンを含まない血清で、ブラスターの5マイクログラムミリリットルで 37°Cでプレートを一晩インキュベートし、翌日に5%二酸化炭素。トランスフェクション前に、培地を8ミリリットルの新鮮な培地と交換してください。トランスフェクション用のプラスミドは、テトラサイクリン誘導性H oneプロモーターによって駆動されるACF oneまたはSNF 2 H-S-H-R-N-AをコードするP superior neo plus GFPプラスミド、ならびにGFPを融合させ、構成的PGKプロモーターによって駆動されるネオマイシン耐性遺伝子である。

10マイクログラムのプラスミドDNAを500マイクロリットルの150ミリモル塩化ナトリウムとボルテックスに加えます。次に、DNA1マイクログラムあたり2マイクロリットルのジェットPY試薬を、500マイクロリットルの150ミリモル塩化ナトリウムとボルテックスを含む別のチューブに加えます。ジェットパイ溶液をDNAに加え、ボルテックスしてよく混ぜます。

室温で15分間インキュベートします。15分後、DNA複合体を70〜80%のコンフルエンスを含む10cmプレートに静かにピペットで移します。T-Rex 2 9 3細胞を翌日に混合します。

この例のDMEMでは、前と同様に、G4 18のミリリットルあたり500マイクログラムを含む選択的な培地と媒体を交換します。次の2週間、細胞を監視します。コロニーが現れるまで、3〜4日ごとに選択培地を同様の新鮮な培地と交換します。

コロニーを目で識別し、色付きのマーカーを使用してプレートの底にその位置をマークします。顕微鏡でコロニーが十分に分離されていることを確認します。コロニーは、顕微鏡なしで視覚化できるほど大きくなれば、分離できます。

この手順を成功させるためには、コロニーの分離中に十分に分離されたコロニーを選択することが重要です。滅菌フードで、プレートから培地を吸引します。PBSでやさしくすすぎ、残っているすべての液体をよく吸引します。

EDTAの0.25%tripsの3マイクロリットルをプレート上の1つのコロニーにペットで加え、細胞がプレートから剥離するまで繰り返しトリップをペットで。細胞を24ウェルプレートのウェル内の選択培地に移します。プレート上の他のいくつかのコロニーについてもこれを繰り返します。

細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%でウェルを満たすまで成長させます。次に、各元のコロニーの細胞を別々の12ウェルプレートでそれぞれ3つのウェルに分割し、翌日に一晩インキュベートします。1つのプレートの培地を、二重蒸留水で調製したストック溶液から1ミリリットルあたり1マイクログラムのドキシサイクリンを含む培地と交換します。.

コントロールプレート内の培地をドキシサイクリンを含まない培地と交換します。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で72時間インキュベートします。次に、処理されたウェルと未処理のウェルから1つの細胞を回収し、ウェスタンブロット分析を行い、ACF 1またはSNF 2の効率を判断します Hノックダウン 代表的な結果がここに示されている。

このブロットは、SNF 2 Hおよびαチューブリンに対する抗体で染色しました。後者は、クローンのうちの2つをロード制御する役割を果たします。4番と5番は、ドキシサイクリン誘導時にSNF 2 Hが大幅に減少したことを示したため、次のセグメントで実証されるノックダウン実験で使用するために選択されました。

3 番目のプレートの未処理の細胞は、選択した細胞株を増殖するために使用され、それらの細胞のアリコートはその後凍結されます。さらに、10センチメートルプレートの選択培地中でACF 1またはSNF 2 Hプレートセルのノックダウンを誘導するために、プレートの半分に1ミリリットルあたり1マイクログラムのドキシサイクリンを添加し、摂氏37度、5%二酸化炭素を48〜72時間インキュベートします。プレートの各グループは、各ポイントのDPIアッセイ用の2つの複製と、各サンプルのウェスタンブロット分析用の1つのプレートを含む、12枚の6cmプレート用の細胞を提供する必要があります。

誘導トリプシン鼻の48から72時間後、細胞の各グループからの細胞を、それらを数えた後、ドキシサイクリンの有無にかかわらず、同じ培地で6センチメートルプレートあたり6細胞に1.5倍の10をプレートします。細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%で翌日一晩インキュベートし、細胞をトランスフェクションします。示されているように。

未処理の細胞とドキシサイクリン処理した細胞は、どちらも4つの方法で三回トランスフェクションされます。1つは、エンプティプラスミドとGFPを発現するプラスミドと1つ、2つはエンプティプラスミド、1つはSHRA耐性を発現するベクター、1つはGFPまたはSNFを2つ、HGFPは3つ、プラスミドはEをコードする4つまたは4つとGFPを発現するプラスミドと、Eをコードするプラスミドは4つ、すべて4つ。また、トランスフェクション後にSHRA耐性ACF one GFPまたはSNF two HGFPを発現するベクターは、すべてのプレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で一晩インキュベートします。

細胞のトランスフェクションの翌日に、ウェスタンブロット分析のためにサンプルごとに1つのプレートからタンパク質を抽出し、ACF 1またはSNF 2 Hが効率的にノックダウンされ、E 4または4が異なるサンプルで等しく発現したことを確認します。残りの 16 枚のプレートは DPI アッセイに使用されます。DPIアッセイ用のプレートから培地を吸引し、化学フード内でPBSで細胞を穏やかに洗浄します。

PBSで調製した4%パラホルムアルデヒドを1ミリリットル加えて細胞を覆い、室温で15分間振とうせずにインキュベートします。パラホルムアルデヒドを吸引し、室温で5分間振とうしながらPBSで洗浄します。3回目のPBS洗浄後、合計3回の洗浄を繰り返し、80%エタノールを摂氏マイナス20度に保ち、摂氏マイナス20度で少なくとも1時間インキュベートします。

エタノールを吸引し、細胞をPBSで2回洗浄し、室温で5分間振とうし、その後、室温で5分間、0.5%BSAおよび0.05%を20またはP-B-S-B-Tの間で含有するPBSで1回洗浄します。また、振とうをしながら非特異的抗体の結合を防ぎます。10%ヤギ血清を含む1ミリリットルのP-B-S-B-T緩衝液で細胞を室温で振とうしながら20分間ブロックします。

次に、各洗浄5分間のP-B-S-B-Tで細胞を2回洗浄します。細胞を一次抗体(この場合はE、4、または4特異的抗体)と1ミリリットルのP-B-S-B-Tで室温で1時間インキュベートします。その後、P-B-S-B-Tで2回、0.1%BSAを含むPBSで1回5分間洗浄します。

次に、適切な二次蛍光標識抗体と1ミリリットルあたり0.5マイクログラムを含むPBS 0.1%BSAを1ミリリットル細胞に加えます。DPIの最終濃度を、暗所で室温で振とうしながら40分間インキュベートします。最後に、PBSで5分間洗います。

吸引してウェルを乾燥させ、プレートをさらに1時間から一晩逆さまにして、完全な乾燥を実現し、フローラマウントG溶液を使用してセル上のスライドをアルミホイルマウントカバーで覆います。カウントする準備ができるまで、プレートを暗闇で摂氏4度に保ちます。プロトコールに記載されているさまざまな処理を受けたアポトーシス核細胞を固定し、E 4または4つの特異的抗体とDPIで染色して、トランスフェクションした細胞の核を視覚化しました。

この図は、E 4または4を発現する細胞の例を示し、パネルAは制御GFPタンパク質の発現のみを示し、パネルBはEを示す4または4の発現DAPI染色核をパネルCに示し、結合した画像をパネルDに示します。赤い矢印は、アポトーシス核としてカウントされない不規則な形状の核を示し、アスタリスクは有糸分裂核、またはDAPIによって視覚化された凝縮または断片化された核の数を除いただけの核を示します。トランスフェクションされた細胞集団内のアポトーシス形態を持つ核の割合を計算するために染色をカウントし、試験の最適な客観性を維持しました。

種々のサンプル中のアポトーシス核のカウントは、カウントする人がサンプルの同一性を知らなかったブラインド方式で行われた。E 4または4の発現細胞では核の異常の割合が高いことが観察され、T 4または4が細胞死を誘導することが確認されました。核異常の最も高い割合は、ACF 1のレベルがSHRによって減少し、ACF 1のノックダウンがE、4または4、Inge細胞死が細胞内のE、4または4の毒性を増強することを示す媒介ノックダウンによって、E、4、または4を発現する細胞で

ACF 1の低レベルを発現しても、ウェスタンブロットで見られるようにE、4、または4のレベルの増加によるものではありませんでした。この手順を実行する際には、DPIによるアポトーシス核ステントのアドバイズカウントを容易にし、この核の同定に厳格な基準を適用することを覚えておくことが重要です。この手順に加えて、この手順に続いてDA pseの結果を検証するために、クローンジェニックアッセイなどの他の方法を実施することができる。

他の方法、例えばco免疫沈降アッセイは、追加の質問に答えるために実施することができます。たとえば、調査対象のタンパク質間に物理的な相互作用があるかどうかなどです。