バイオマスの制限額を使用して効率的なクロマチン免疫沈降

次の実験の全体的な目標は、転写因子などのDNA結合タンパク質の結合または彼の結石修飾のいずれかを検出することです。これは、最初にクロマチンを2番目のステップとして調製することによって達成されます。クロマチン免疫沈降反応は、目的のタンパク質に結合したDNAの断片を引き下げるために設定されます。

次に、目的のタンパク質に結合したDNA断片をPCRにより増幅します。QPCR分析に基づく結果から、目的のタンパク質に結合したDNA断片の倍濃縮が、非結合領域と比較して得られる。この方法は、転写、クロマチン、エピジェネティクスの分野における重要な問題、例えば、異なる修飾タンパク質または非修飾タンパク質がいつ、どこに存在する

DNA上 この方法は、T細胞遺伝子の調節に関する洞察を提供することができます。また、Bリンパ球、白血病サンプル、不死化細胞株などの他のシステムにも適用できます。この実験のクロマチンは、マウス脾臓ナイーブCDの4つのT細胞から調製されます。

この手順を開始するには、DMEM中のCD 4 T細胞懸濁液に最終濃度1%の37%ホルムアルデヒドを加え、室温で15分間静かに振とうします。これにより、DNAタンパク質複合体が架橋されます。架橋を停止し、最終濃度125ミリモルに1モルグリシンを添加します。

室温で5分間揺らし続けます。細胞を200 Gで4°Cで5分間遠心分離して回収します。上清を除去し、プロテアーゼ阻害剤を含有する氷冷PBSの5ミリリットルで細胞を再懸濁し、再び遠心分離し、最終洗浄後にこの方法で細胞を合計3回洗浄し、上清を廃棄し、プロテアーゼ阻害剤を含有する氷冷細胞溶解緩衝液1ミリリットルに細胞を再懸濁する。

細胞懸濁液を1.7ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、氷上で15分間インキュベートします。200 Gで4°Cで5分間遠心分離することにより、核を回収します。上清を慎重に捨て、核を500マイクロリットルの核溶解に再懸濁します。

プロテアーゼ阻害剤を含むバッファーを氷上で15分間インキュベートします。次に、1.6ミリメートルのプローブと出力レベル4を使用して細胞を超音波処理し、15秒間超音波処理します。過熱を防ぐためにサンプルを氷上で1〜2分間冷却し、再度15秒間超音波処理します。

超音波処理と冷却を合計4回遠心分離し、音波クロマチンを16, 000 Gで5分間繰り返します。摂氏4度で4度。透明な上清を新しいマイクロ遠心チューブに集めます。

透明な上清の20マイクロリットルのアリコートを取り除きます。.DNAローディング色素を添加し、2%アグロゲルを介した電気泳動により超音波処理されたDNAを確認します。ほとんどのアプリケーションのための超音波処理DNAの理想的なサイズは200〜500塩基対です。

最後に、UV分光光度計を使用してDNA濃度を測定します。剪断クロマチンは、クロマチン免疫沈降反応を設定するために直ちに使用することができ、またはクロマチン免疫沈降のために摂氏マイナス80度で保存するか、またはプロテアーゼ阻害剤を含むチップ希釈バッファー中のチップ希釈バッファーで、クロマチンを総容量2ミリリットルあたり5〜10マイクログラムのDNA濃度に超音波処理することができます。この手順のすべてのステップは、摂氏0度から4度で実行する必要があります。

10%節約しますこれは、希釈された超音波処理クロマチンのこの例では、残りのサンプルの氷上に450マイクロリットルをアリコート450マイクロリットルを、アイソタイプコントロールおよび目的の抗体としてラベル付けされた4つの1.7ミリリットルマイクロビューチューブのそれぞれにインプットとして格納する200マイクロリットルです。同じアイソタイプの複数の抗体を使用する場合、単一のアイソタイプコントロールで十分です この分析を実行するには、使用する抗体の特異性に応じて、2〜5マイクログラムの特異的抗体またはアイソタイプコントロールをそれぞれのチューブに追加します。チューブを摂氏4度で一晩揺さぶると、翌朝にクロマチン抗体複合体が形成されます。

各混合物に25マイクロリットルのプロテインG磁気ビーズを加え、摂氏4度で少なくとも2時間揺さぶる。次に、フュージ管を磁気スタンドに15〜20秒間置き、ビーズが磁化された側に集まるようにします。ビーズを乱さずに吸引して溶液を慎重に取り除きます。

1ミリリットルの低塩洗浄液を加え、ミューテーター上で5分間穏やかに振とうします。マグネットスタンドでビーズを回収し、洗浄液を取り出します。1ミリリットルの低塩洗浄液を再度加え、5分間静かに揺らします。

低塩洗浄液を取り除いた後、1ミリリットルの高塩洗浄液を加え、5分間揺らします。マグネットスタンドでビーズを回収し、洗浄液を取り出します。高塩分洗浄液で洗浄を繰り返します。

高塩分洗浄液を取り除いたら、1ミリリットルの塩化リチウム洗浄液を加え、5分間揺さぶります。マグネットスタンドでビーズを回収し、洗浄液を取り出します。塩化リチウム洗浄を一度繰り返します。

1ミリリットルのTE溶液を加え、5分間揺さぶります。マグネットスタンドでビーズを回収し、洗浄液を取り出します。ビーズからDNAを溶出するには、250マイクロリットルのelucian緩衝岩を室温で15分間加えます。

EITをピペットで取り外し、この材料を新しい1.7mmフージチューブに保存します。もう一度繰り返して、両方のeluを組み合わせ、ビーズを捨ててクロスリンクを逆にします。逃れたDNAに5モルの塩化ナトリウムを加えて、最終濃度を0.3モルと1マイクロリットルのRNAにします。

A 400マイクロリットルの溶出バッファーを、以前に保存したインプットに追加します。各入力に容量を500マイクロリットルにするには、0.3モル1マイクロリットルのRNAに塩化ナトリウムを追加し、10マイクロリットルの0.5モルEDTA20マイクロリットルの1モルトリス、HCL pH 6.5、および1マイクロリットルのプロテイナーゼK.Sealチューブを密封し、翌朝に乾燥加熱ブロックで摂氏65度で一晩インキュベートします。 チューブを室温まで冷まします。次に、100%エタノールを1ミリリットル加え、マイナス80°Cで2時間から一晩インキュベートします。

DNA遠心分離機を沈殿させるために、チューブを16, 000 Gで15分間。DNA洗浄をペレット化するためには、DNAペレットを70%エタノールで一度風乾し、ペレットを再懸濁し、DNAペレットをオートクレーブ蒸留水の100マイクロリットルで、カヤック、クイックスピンカラムを使用してDNAを精製し、総量50マイクロリットルの溶出緩衝液で溶出します。これで、このDNAをPCR増幅に使用する準備が整いました。

コントロール非結合領域に対する完全な濃縮を得るためのQPCRリザーブの分析は、このプロトコルの最も重要な側面です。QPCRソフトウェアを使用して、エディターに移動し、さまざまな希釈液の入力サンプルを含むウェルに標準曲線値でマークを付けます。また、PCRプレートがレイアウトされているのとまったく同じように、未知のチップサンプルでウェルを標識します。

標準曲線を使用して未知化合物の特異的サンプルおよびアイソタイプサンプル中のDNA量を補間することにより、サンプル中に検出された濃度の範囲にわたって、すべてのプライマーセットの品質と効率を評価し、一致させることができます。サブセットエディターに移動し、インプットサンプルを含むウェルや未知のチップサンプルを含むサブセットをマークします。未知のサンプルは、分析用の入力サンプルの既知の濃度から生成された標準曲線を使用して定量化されます。

PCR増幅が完了したら、ABS定量で解析を行います。2次微分最大。解析するサブセットを選択し、を押します。大丈夫です。

計算を押すと、入力サンプルの既知の濃度を使用して標準曲線が生成され、DNAの品質が良好で、プライマーが標的領域に特異的に結合している場合、PCR効率は2に近いはずの場合、未知のサンプルに存在するDNAの絶対量が表示されます。TMを使用して融解曲線解析を実行し、可能な場合は同じサブセットを呼び出します。1 つのピークは、特定の 1 つの製品のみが増幅されたことを示します。

特定のDNAの増幅は、PCR産物を電気処理し、AROSゲルを介してDNAラダーを使用して試験することもできます。取得したデータはタブ区切りのテキストファイルとしてエクスポートされ、Microsoft Excelで開いてさらに分析することができます。特異的抗体のDNA量を、標的プライマーのアイソタイプコントロールで除算します。

制御領域Primersについてこの手順を繰り返します。同じアイソタイプの複数の抗体を異なる免疫沈降に使用する場合は、それぞれを同じアイソタイプコントロールの値で標準化します。さらに、複数のターゲットプライマーペアを使用する場合は、単一のコントロールプライマー修復セットからのDNA量を各ターゲットの標準化に使用する必要があります。

出力値は、非特異的抗体に対する各位置での特異的抗体免疫沈降の倍率、バックグラウンド免疫沈降、標的プライマーの倍数濃縮とコントロール領域プライマーの倍率濃縮を分けて、コントロール非結合領域に対する濃縮を得るためのものです。重要なことは、各サンプルの総インプットDNAを含む標準曲線を生成するため、標準から補間された各免疫沈降値は、マシンソフトウェアによって総インプットの割合としてすでに正規化され、表されることに注意してください。ここで示したクロマチン免疫沈降プロトコルは、ゲノムの非結合領域を増幅するプライマーペアを使用して、PCRで使用されるDNAの量に違いがある場合はそれを制御し、ローディングコントロールとして機能します。

この例では、マウスβアクチン遺伝子のコード領域を、マウス上の転写因子および脂肪結合部位と目的のタンパク質に結合していない領域として用い、ILの2つのプロモーターを標的領域として用いた。このExcelスプレッドシートのスナップショットは、黄色、緑、紫のボックス内の3つの実験反復と3つのテクニカルリピートからの分析データに記載されている計算プロトコルの使用を示しています。それぞれが倍率濃縮の計算に使用されました。

ゲノムの異なる領域に結合したタンパク質の相対濃縮度は、アイソタイプコントロールと特異的抗体の同じセットを選択した場合に比較できます。抗体の特異性が良好な場合、通常、非結合制御領域に対して2倍から10倍の濃縮が観察されます。この図は、マウスから単離した従来のCD4T細胞と制御性CD4T細胞を用いたチップ実験の結果を示しています。

従来のT細胞のごく一部をPMAとイオンマイシンで30分間刺激しました。IL 2プロモーターにおけるNFA転写因子、N脂肪C1、およびNFA C 2の相対濃縮が観察され、この手順に従って、非結合領域上のフォールド濃縮としてここに描かれています。ChIP-seqなどの他の方法は、転写因子の全球的な占有率や、刺激に応答したエピジェネティックなマークの全球的な変化に対処するために使用することができます。

このビデオを見れば、限られた数の細胞を使用してクロマチン免疫沈降を行う方法や、QPCIデータを解析して、コントロールの非結合領域と比較した転写因子のバンディングを決定する方法について、十分に理解できるはずです。