単一分子タンパク質研究のための表面パッシベーション
April 24th, 2014
我々は、ポリエチレングリコール（PEG）を用いてガラス表面を不動態化するための方法を記載している。このプロトコルは、表面洗浄、表面機能化、およびPEGコーティングをカバーしています。私たちは、既存の方法に比べて不動態の優れた品質が得られ2回のラウンドでのPEG分子で表面を処理するための新たな戦略を、ご紹介します。
この手順の全体的な目標は、優れた品質の石英スライド面を生成することです。これは、最初にドリルで開けられた石英スライドとカバースリップを水とアセトンで洗浄することによって達成されます。次に、スライドに水酸化カリウムとピラニア溶液をエッチングして、表面の品質を向上させます。
次に、スライドとカバースリップをアミン基で官能基化し、続いてポリマーを使用して2ラウンドの表面化を行い、ガラス表面を不活性にします。最後のステップは、スライドからマイクロ流体チャンバーを組み立て、ポリエチレングリコールコーティングまたはペグ表面を互いに向き合わせてスリップを覆うことです。最終的に、表面をPEG分子で2ラウンドにわたって処理する新しい戦略により、単一分子蛍光顕微鏡で観察される不動態化の品質が著しく向上します。
この技術または酸化カリウムエッチング後のポリマーコーティングなどの既存の技術の主な利点は、この技術が優れた品質を保証することです。この方法に不慣れな人は、複数のサービス治療を行う必要があるため、苦労するでしょう。ドリルを開始すると、テキストプロトコルに詳述されているように、クォーツがスライドします。
スライドをガラス製の染色瓶に入れて、スライドを清掃します。通常、5〜15枚のスライドを1つの瓶に入れることができます。次に、すすぎを3回繰り返した後、スライドをUE水ですすぎ、スライドをUE水で5分間超音波処理して汚れを取り除き、水を処分し、スライドをUE水でさらに3回すすぎます。
次に、UE水をアセトンに交換し、スライドをアセトンで20分以上超音波処理し、アセトンを廃棄し、スライドをMilli Q水ですすいでアセトン残留物を取り除きます。次に、水を1モルの水酸化カリウムに交換し、スライドを20分以上超音波処理します。過度のエッチングは表面の品質を向上させますが、蛍光イメージングを妨げる可能性のある傷が発生します。
スライドをMilli Q水で3回すすぎ、微量の水酸化カリウムを取り除き、ピラニアエッチングを行います。スライドをデュランスライドホルダーまたはカスタムメイドのテフロンホルダーに移し、ケミカルフードにある1リットルのビーカーに入れます。ビーカーに450ミリリットルの硫酸を入れます。
次に、150ミリリットルの過酸化水素を加えて、硫酸と過酸化水素の比率を3対1にします。溶液を攪拌して適切に混合し、ビーカーを20分間そのままにしておきます。ピラニア溶液からスライドを取り出し、ミリユーウォーターが入ったスライドホルダーに入れます。
その間、ピラニア溶液は指定された廃液ボトルに捨てます 室温に達したら、カバースリップのクリーニング後にスライドをUE水で3回すすいでください。染色皿のUE水をメタノールと交換します。スライドとカバースリップはメタノールで保管してください。
その間に、フラスコに100ミリリットルのメタノールを注いでアミノアイランド化溶液を調製します。その後、5ミリリットルの酢酸と3ミリリットルの3アミノプロピル、トリメチルを加え、振とうして穏やかに混ぜます。スライドとカバースリップを含む染色皿のメタノールをアミノシロ化反応混合物と交換します。
インキュベーション中に20〜30分間インキュベートし、1分間1回超音波処理します。次に、アミノアイランド化反応をメタノールに置き換えます。次に、メタノールを捨てて、新しいメタノール溶液を追加します。
表面化の最初のラウンドでこの手順を3回繰り返します 最初にポリマーを使用して、窒素ガスを使用してスライドとカバースリップを乾燥させます。次に、部分的にミリQ水で満たされた清潔なピペットボックスに、ペグする必要がある側面が上を向くように置きます。次に、調製したばかりの反応緩衝液64マイクロリットルを調製したペグ溶液に加えます。
混合物を上下にピペットで動かして、完全に溶解させます。その後、16, 100 Gで1分間遠心分離します。気泡を取り除くには、70マイクロリットルのペグ化混合物を乾燥した石英スライドに落とします。
乾燥したカバースリップを溶液の上にそっと置き、スライドを暗くて湿度の高い環境で2時間から一晩インキュベートして、ペグ化されたスライドとカバースリップを保管します。スライドとカバースリップを慎重に分解し、カバースリップを横にスライドさせ、UE水ですすいでから窒素ガスで乾燥させました。スライドとカバースリップのペアを50ミリリットルのチューブに入れ、ペグ化された表面が互いに反対側を向くようにします。
チューブを部分的に閉じて真空にしてから、窒素ガスを充填し、蓋をしっかりとねじ込みます。マイナス20°Cで保管してください。これらの手順は、ペグ化された表面を長期間保持するのに役立ちます。
スライドを使用してマイクロ流体チャンバーを組み立てる直前に、テキストプロトコルに記載されているように2回目のPEGYLATIONを実行します。ペグ加工された面を上に向けて、平らな面にクォーツスライドを置きます。スライド上に両面粘着テープを貼って、ペグ化された表面に斜めにチャネルを作成します。
穴がチャネルの中央に配置されていることを確認してください。次に、ペグ加工されたカバースリップを上にそっと置き、チャンバーを完成させます。ペグ加工された面を下に向けて。
両面テープが置かれている領域にカバースリップを押して、チャンバーを密閉します。チャンバーが水密に密閉されるように、優しく、しかし徹底的に行ってください。最後に、チャンバーの端をエポキシ接着剤で閉じます。
ストレプトアビジンまたは中性トラバインを固定化し、テキストプロトコルに記載されているように、ビオチン化生体分子を単分子イメージング用に添加し、表面化が成功裏に行われた場合、観察されるイメージング領域ごとに10個未満の非特異的に吸収されたタンパク質があります。1〜10ナノモルの蛍光標識タンパク質をチャンバーに添加すると、洗浄または反応ステップのいずれかが適切に行われていないと、非特異的に吸収されたタンパク質の数が大幅に増加します。例えば、ピラニアエッチングをスキップすると、100倍の非特異的吸収が観察されます。
ダブルペグレーションの優れた性質は、ここで顕著に示されています。蛍光分子と溶液からのバックグラウンドシグナルは、左のパネルに示すようにダブルペグ化を使用した場合、はるかに弱いことが観察されました。これは、タンパク質が二重ペグ化層によってより効果的に反発されることを示しています。
一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば4時間で完了することができます。AYAでの作業は、この手順を実行する際に、適切な手袋、ゴーグル、エプロンなどの非常に危険な予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。
概要
この記事では、ポリエチレングリコール（PEG）を使用してガラス表面を不活性化する新しい方法について説明します。このプロトコルには、表面の洗浄、機能化、そして不活性化の質を向上させる2回のPEGコーティング戦略が含まれています。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 表面の不活性化
- マイクロ流体工学
- 蛍光顕微鏡法
背景
- 不活性化は蛍光イメージングにおける非特異的結合を減少させるために重要です。
- 従来の方法では最適な表面の質が得られない可能性があります。
- PEGは不活性な性質で知られており、この応用に適しています。
- 改良された表面処理は実験結果を向上させることができます。
研究の目的
- ガラス表面を洗浄し不活性化する信頼性の高い方法を開発すること。
- 2回のPEG処理の有効性を示すこと。
- 研究者が従うための詳細なプロトコルを提供すること。
使用した方法
- 水とアセトンで石英スライドを洗浄すること。
- 水酸化カリウムとピラニャ溶液でエッチングすること。
- アミン基で表面を機能化すること。
- 高品質の不活性化を確保するためにPEGを2回塗布すること。
主な結果
- 2回のPEG処理は表面の不活性化を大幅に改善します。
- 単分子蛍光顕微鏡法により非特異的結合の減少が示されます。
- プロトコルの適切な実行により最適な結果が得られます。
- 手順に従わないと非特異的タンパク質吸着が増加する可能性があります。
結論
- 記述された方法はガラス表面の不活性化のための優れた代替案を提供します。
- 研究者はこのプロトコルでより良いイメージング結果を達成できます。
- 洗浄と処理プロセスの詳細に注意を払うことが不可欠です。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Surface passivation is a critical enabler for reliable single-molecule protein studies, directly impacting data quality in target interaction assays. Inadequate surface treatment introduces confounding non-specific binding, undermining mechanistic interpretation and increasing false-positive rates in early discovery. This protocol addresses a key technical bottleneck by delivering a robust, reproducible method to generate inert surfaces, thereby improving predictive confidence in downstream screening and validation workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables specific observation of protein-protein and protein-nucleic acid interactions by minimizing surface-induced artifacts.
- Operational Value: Provides a standardized surface preparation method that reduces variability across experiments and laboratories.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Supports assay readiness by ensuring low background (<10 non-specifically absorbed proteins per imaging area) for accurate ligand binding measurements.
- Operational Value: The two-round PEGylation strategy improves coating consistency, enhancing reproducibility in high-content screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates mechanistic de-risking by allowing precise quantification of binding kinetics and affinities in disease-relevant systems.
- Operational Value: Enables long-term storage of passivated slides at -20°C, supporting batch preparation and workflow continuity.
Pipeline & Workflow Integration
This surface passivation method fits within the early discovery continuum, specifically supporting target validation and assay development stages by providing a reliable foundation for single-molecule imaging.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing through clean visualization of specific biomolecular interactions without surface interference.
- Screening: Enables quantitative, reproducible readouts essential for comparing compound effects in primary and secondary screens.
- Analytics: Generates low-background fluorescence data that improves signal-to-noise ratio, facilitating accurate statistical analysis of binding events.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by ensuring that observed interactions reflect true biology rather than assay artifacts.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized surface preparation platform applicable across multiple projects and target classes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing false positives from non-specific surface interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through a well-defined, step-by-step protocol with clear quality benchmarks.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by improving data reliability in early-stage target assessment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by providing higher-quality mechanistic data for lead selection.
Implementation Considerations
- Requires expertise in surface chemistry and fluorescence microscopy to execute multi-step treatments correctly.
- Dependent on access to piranha solution handling equipment and nitrogen gas for drying and storage.
- Necessitates standardized training to ensure consistent amine functionalization and double PEGylation across users.
- Must be adapted to different slide materials (e.g., quartz vs. standard glass) while maintaining PEG density and passivation quality.
- Limited by the hazardous nature of piranha solution, requiring strict safety protocols and waste management procedures.
