Name: 単一分子タンパク質研究のための表面パッシベーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: 学ぶ単一分子蛍光顕微鏡のためのガラス表面パッシベーション法。ポリエチレングリコールを用いた二段階処理により、非特異的結合を低減し、高品質なイメージングを実現します。

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SDC、ACH、そしてCJは、欧州研究評議会を通じて補助金（ERC-STG-2012から309509）を起動した状態でのサポートされていました。 J.-MNは、韓国国立研究財団（NRF）（2011から0018198）によってサポートされていました。パイオニア研究センタープログラム（2012-009586）韓国NRFを通して科学省、ICT、および将来の計画（MSIP）によって資金を供給。この作品は、グローバルフロンティアプロジェクト（H-GUARD_2013-M3A6B2078947）、韓国のMSIPによって資金を供給BioNanoヘルスガードセンターによってサポートされていました。 YKLとJ.-HHはソウル市、韓国のソウル科学フェローシッププログラムによってサポートされていました。ラベルされたRepタンパク質は、博士スアミョンからの寛大な贈り物だった。

1。準備とクリーニングをスライドさせて マイクロ流体チャンバは、石英スライドとカバーガラスで構成されている。プリズム型全反射蛍光（TIRF）顕微鏡法では、石英スライドの表面が撮像される。したがって、十分にH 2 O、アセトン、KOH、およびピラニア溶液を使用して石英スライドをきれいにすることが重要である。 Thが、多段階の洗浄は、単一分子蛍光測定を妨害表面に蛍光性有機分子を排除している。さらに、ピラニアエッチングは、ヒドロキシル基を生成することにより石英表面を親水性にする。遊離ヒドロキシル基は、工程3におけるアミノ-シラン化反応のために必須である。 <ol><li>掘削石英スライド。 3月4日ミリのダイヤモンドドリルビット（ 図2a）と石英スライドへの正孔の対を開けます。複数のチャネルが必要な場合は、より多くのパドリルIRSの孔（ 図2b）。これらの穴は、ステップ7でマイクロ流体チャンバー内に溶液を注入するために使用される。 <ol><li>掘削中のH 2 O中の湿ったドリルビットを保持します。ドリルビットの寿命を増加させる潤滑剤としてH 2 Oを行う。 </li><li>時折ドリルビットの先端をふくと、掘削穴に役立ちます。 </li><li>穴あけした後、PEG化プロセスの間に容易に識別するためのスライドの片側をマーク。マーカーは後で混乱を避けるために基準として使用することができる。マーキングについては、ダイヤモンドドリルビットを使用することができる。インクが表面に得るかもしれないので、任意のペンを使用しないでください。 </li></ol></li><li> H 2 Oで洗浄するガラス染色ジャーにスライドを置きます。典型的には5〜15のスライドは、単一のジャーの中に配置することができる。ミリQ、H 2 Oでスライドをすすぐそれを3回繰り返し、汚れを除去するために5分間のMilliQ H 2 Oでスライドを超音波処理。水を配置して、再度3回スライドをすすぐミリQ H 2 Oは、130 Wは、このプロトコルで使用超音波処理能力であることに注意してください。高い超音波処理パワーは、石英スライドの寿命を低下させる可能性があります。 </li><li>アセトンで清掃。アセトンでのMilliQ H 2 Oを交換してください。 20分以上スライドをアセトンで超音波処理する。 </li><li> H 2 Oですすいだアセトンを破棄し、ミリQ、H 2 Oでスライドをすすぐ任意の残留アセトンを除去するために3回それを繰り返す。 </li><li> KOHでクリーニング。 1MのKOHで水を交換して、20分以上のスライドを超音波処理。過度のエッチング（ 例えば一晩KOH処理）は、表面の質を向上しますが、蛍光イメージングを妨害する可能性があり、傷を、ご紹介します。 </li><li> H 2 OですすいだKOHの痕跡を除去するために3回のMilliQ H 2 Oでスライドを洗浄します。 </li><li>ピラニアエッチング。 <ol><li>デュランのスライドホルダーやカスタムメイドのテフロンホルダーとPLにスライドを転送する化学フードに位置して、ビーカー（1L）でそれらをエース。 </li><li> H 2 SO 4の450ミリリットルビーカーを埋める。 </li><li> H 2 SO 4との間の3:1の比及びH 2 O 2に対するH 2 O 2を150mlを加える。ソリューションは自然に沸騰し始めると、温度が90℃とともに増加必ずH 2 O 2溶液は、反応を開始する前に室温であることを確認してください。そうでなければ、沸騰溶液の温度を90℃より低くてもよい</li><li>適切な混合のためのソリューションを撹拌し、ビーカーを20分間乱さしてみましょう。 </li><li>スライドホルダーと一緒にピラニア溶液からスライドを取り、ミリQ H 2 Oを含むスライドホルダーに入れてそれが室温に達する一方、指定された廃液ボトルにピラニア溶液を捨てる。 </li><li>ミリQ、H 2 Oでスライドを3回すすぎ細心の注意は、さらにステレオに注意が必要ですスライドの任意の可能な汚染を避けるためにピコ。 3に進みます。これは、すぐに次の手順を続行することをお勧めします。 *注意：ピラニア溶液は非常に反応性である。このソリューションの取り扱いには特別な注意を払うべきである。また、時にアセトン等の有機溶剤と混合して誤って、それが爆発の原因となります。 </li></ol></li></ol> 2。カバースリップのクリーニング マイクロ流体室は石英スライドとカバーのリップで構成されている。プリズム型TIRF顕微鏡を用いる場合には、カバースリップの表面が画像化されていない。したがって、唯一のH 2 O及びKOHでカバーガラスを清掃するのに十分である。ケースでカバーガラス（例えば客観型全反射顕微鏡を介して）画像化される必要がある、それはピラニア溶液（ステップ1.7）でカバースリップを治療することをお勧めします。カバースリップ表面のPEG化は、高品質ではない場合、それはタンパク質のためのシンクとして作用し得ることに留意されたいタンパク質濃度の変動を生じさせるdは。 <ol><li> H 2 Oですすいだ場所カバースリップガラス染色ジャー（24×30、24×40、または24×50ミリメートル2）。典型的には5〜15カバースリップは、単一のジャーに入れることができる。ミリQ、H 2 Oでカバーグラスを3回すすぎ</li><li> KOHでクリーニング。 1M KOHで水を交換して、20分以上カバースリップを超音波処理。 </li><li> H 2 OですすいだKOHの痕跡を除去するためのMilliQ H 2 Oでカバーグラスを3回すすいでください。 3に進みます。 </li></ol>スライドとカバーガラスの3。アミノ - シラン化 アミノ-シラン化化学を介してアミン基と石英スライドとカバースリップの表面を官能化する。メタノールはアミノ-シラン化反応の触媒としての溶媒と酢酸として使用される。 <ol><li>メタノールですすいだ。 Sから（染色皿にミリQ H 2 Oを交換してくださいメタノールでTEPS 1および2）。ステップ3.3までメタノールのスライドとカバースリップを保つ。メタノール中の不純物が表面に吸着するので、（ 例えば数時間）の時間を不必要に長期間スライドとメタノール中でカバースリップを保管しないでください。 </li><li>アミノシラン化溶液を調製する。 <ol><li>メタノールでパイレックスフラスコを数回すすいでください。 5分以上のメタノールで、フラスコを超音波処理。それは清浄に保たれている専用のフラスコを持っていることをお勧めします。 </li><li>フラスコにメタノール100mlを注ぐ。 </li><li>酢酸5mlを追加します。 </li><li> APTESの3ミリリットル（3 - アミノプロピルトリメトキシシラン）を追加し、軽く振って混和する。 </li></ol></li><li>アミノ - シラン化。 aminosilanizationの反応混合物とスライドとカバースリップが含まれている染色皿にメタノールを交換してください。 <ol><li> 20から30分間インキュベートします。インキュベーション中、1分間超音波処理一度。 </li></ol></li><li>メタノールですすいだ。 Aを交換してくださいメタノールとminosilanization反応。メタノールを捨て、新鮮なメタノール溶液を加える。この手順を3回繰り返します。 </li></ol>ポリマー（1回戦）を使用する4。表面パッシベーション NHS-エステル、ポリエチレングリコール（PEG）を結合することによって石英スライドとカバースリップのアミン被覆表面を不動態化する。この反応物を一晩、pH8.5のPEG溶液の飽和濃度を用いて行われる。 <ol><li>スライドとカバースリップを乾燥させる。スライドとN 2ガ ​​スを使用してカバーグラスを乾燥させ、PEG化である必要があります側が上を向いているような方法で、きれいなピペットのボックスに配置します。ピペットボックスは部分的にミリQ H 2 Oで満たされているこの湿った環境では、一晩のインキュベーションの間に乾燥からPEG化ソリューションを防ぐことができます。 </li><li>反応バッファーを調製した。 10ml中の炭酸水素ナトリウム84mgを溶解することによって、新鮮な炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH8.5）中の0.1 Mを調製ミリQ H 2 O pHを調整する必要がない。この溶液を次の利用（ 例えば、工程6.1）のために凍結保存することができる。 </li><li> PEG化溶液を調製する。 <ol><li> 1.5mlチューブ中のNHS-エステルのmPEG（5000 Da）でのNHS-エステルPEG（5000 Da）で13と8 mgのビオチン化0.2mgのPEGの混合物を準備します。スライドの数Nを調製する場合、単一のチューブ内でPEG混合物のN倍大きい量を準備する。 </li><li>新たに調製されたバッファ（ステップ4.2）の64μL（またはN回スライドのN個の数の64μL）を追加します。完全に溶解させるために上下にピペット。 </li><li>気泡を除去するために1分間、16,100×gで遠心分離して。その後ピペットないでください。そうでなければ、気泡は、ステップ4.4でPEG化干渉する形成する。 </li></ol></li><li> PEG化。 <ol><li>ステップ4.1からの乾燥石英スライドにPEG化混合物の70μlをドロップします。 24×50ミリメートル2 COV例に90μlを使用するerslip。 </li><li>ゆっくりと溶液上にステップ4.1からの乾燥カバースリップを配置。 </li><li> 、PEG化の均一で高い品質を持つように、気泡を導入しないように注意してください。表面張力により、気泡の大部分は自然に表面張力により5分以内に反応容積を残すことができる。 </li><li>暗くて湿気の多い環境でのスライドをインキュベートします。我々はpH8で使用するNHS-エステルPEGの半減期は約1時間である。最低でも、2時間のためにそれらをインキュベートする。一晩のインキュベーションは、PEG化（データは示さず）のより高い品質をもたらす。 </li></ol></li></ol> 5。長期保存 -20ºCでPEG化スライドや、N 2中のカバースリップを保存する <ol><li>スライドとカバースリップを乾燥させる。慎重に、側にカバースリップをスライドさせて、スライドとカバーガラスを分解をMilliQ H 2 Oでそれらをすすぎ、およびN 2とそれらを乾燥させます。 </li><li>スライドとカバースリップを保存する。フォーRすぐに使用、ペグ（ステップ6）の第二ラウンドのための手順に従ってください。長時間保管するために、次の手順に従います。 <ol><li>一対のスライド及びPEG化された面が互いに離れる対向するよう50mlチューブ中でカバースリップを置く。 </li><li>部分的に、チューブを閉じ、チューブを真空した後、N 2でそれを埋める。これらのステップは、長時間のPEG化された表面を維持するのに役立ちます。しっかりとチューブをねじ込み、-20℃で保管しスライドの品質は、最大3ヶ月（ 図3a、右 ）こだわりのまま。 </li></ol></li></ol>ポリマー（2回戦）の使用6。表面パッシベーション PEG層の密度の高いをすると、表面上の任意の残りのアミン基をクエンチするPEG化の追加のラウンド。ショートNHS-エステルPEG分子（333ダルトン）の使用は、既存のPEG層に浸透するのに有効であり得る。これはRECです右側のスライドを使用する前に、PEG化のこの第二ラウンドを行う奨。 <ol><li>反応バッファーを調製した。新鮮な炭酸水素ナトリウム緩衝液（pH 8.5）の0.1 Mを準備します。ステップ4.2からの凍結溶液を使用することもできる。 </li><li> PEG化溶液を調製する。炭酸水素ナトリウム緩衝液の63μlの250 mMのT4-PEGの7μLを溶解する。 </li><li> PEG化。ステップ4.4と同様の手順に従ってください。晩まで30分間インキュベートします。 </li><li>スライドとカバースリップを乾燥させる。一対のスライドとカバーガラスを分解し、ミリQ H 2 Oで、それらを洗い流し、N 2でそれらを乾燥し、きれいなピペットボックスに保管してください。ステップ7で、マイクロ流体チャンバーの組み立てに進みます。 </li></ol> 7。マイクロ流体チャンバーの組み立て PEG化された石英スライドとカバースリップのペアを使用してマイクロ流体チャンバを組み立てる。両面粘着テープがスペーサーとして使用される。室はそのように、エポキシ接着剤で密封しているlutionsは石英スライドの穴を通って導入されています。 <ol><li> PEG化面を上にして平らな面に石英スライドを置きます。 </li><li>スライド上で、両面粘着性のテープを入れて斜めにPEG化表面上のチャネル（7ミリメートル、幅5）を作る。ホールはチャンネルの中心に位置していることを確認してください。チャンバーを製造するプロセスの間、PEG化表面を損なわないように注意してください。これは、（ 図2参照）を配置し、異なって両面粘着性テープを貼り付けることによって、マルチチャネルスライドすることが可能となる。 </li><li>優しく室を完成させる上でPEG化カバースリップを配置。 PEG化側が下に向けなければならない。 </li><li>両面テープが配置される領域の上にカバースリップを押すことによって、チャンバをシールする。チャンバーは水密閉なるように慎重に徹底的にそれを行う。 </li><li>エポキシ接着剤をチャンバーの端を閉じます。 </li><li>上ストレプトアビジンまたはニュートラを固定化P200ピペットを用いて、T50において、ストレプトアビジン又はニュートラアビジン溶液（10mMトリス-HCl [pH8.0中]、50 mMのNaCl緩衝液）の0.1 mg / mlの50μlの添加することによりビオチン化PEG層。 T50緩衝液100μlと同一平面のインキュベーションの1分後。 </li><li>あなたの1分子イメージングのためのビオチン化の生物学的分子を追加します。 </li></ol> 8。リサイクルをスライドさせます 石英スライドをリサイクルする。使用済みのスライドをカバーグラスや、両面粘着性のテープを外すことによってリサイクルされています。 <ol><li>使用後は、水道水に室に保管してください。水中での長期的なインキュベーションチャンバーの分解が容易になります。 </li><li>マイクロ波を用いた水道水室を沸かす。パイレックスビーカーを使用してください。 10分以上煮る。 </li><li>カミソリの刃を使用してカバースリップし、両面粘着性のテープを脱ぐ。その平面に垂直な石英スライドを押さないでください。それ以外の場合は、分割します。離れてチャネルからかみそりの刃を保つ。 OTherwise、チャネル上の傷が導入されています。 </li><li>指で擦って家庭用洗剤を使用してスライドを洗浄します。 </li><li>ガラス染色ジャーにスライドを置きます。典型的には5〜15のスライドは、単一のジャーの中に配置することができる。 10％の家庭用洗剤を追加し、20分以上のスライドを超音波処理。タブ多量の水でスライドを洗浄します。 </li><li> 1.2に進みます。 </li></ol>

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</ol>

我々は、開示することは何もありません。

このプロトコルの中の重要なステップ これは、アミノ - シラン化反応の前に表面を親水性にすることが不可欠である。これは、ガラス/石英表面上の遊離ヒドロキシル基を生成するピラニアエッチングによって達成された。表面の親水性は徐々にダウンしたので、それが長期間にわたって、H 2 Oまたは空気のいずれかにさらさピラニアエッチングされた表面を維持しないことをお勧めします。 NHS-エステルPEG分子が反応性である。それは、-20ºCで一定分量を行い、窒素下でそれらを格納することをお勧めします室温でAPTES化学物質の貯蔵寿命が短い。これは、毎月新しいものと交換することをお勧めします。 このプロトコルの改変 何か実用的な理由でピラニアエッチングを使用できない場合には、長時間のKOHを用いてエッチング（ 例えば Overnight）、ヒドロキシル基を露出させるであろう。この代替アプローチの落とし穴は、スライドが深刻な傷が原因、数リサイクルの後に使用できなくなることである。 これは、しばしば蛍光性有機材料7を除去するのに有効であるプロパントーチを使用して、ガラス/石英表面を焼くために実施される。それはピラニアエッチングに冗長であるため、この手順は、このプロトコルには含まれていませんでした。この手順は、潜在的にヒドロキシル基の酸化につながることに注意してください。表面はKOHまたはピラニア溶液を用いてエッチングした後そのため、この手順が行われるべきではない。 7未満のpHを有する緩衝液は、単一分子イメージングのために使用される場合、PEGのコンフォメーションは、不動態化の程度を減少させる「ブラシ」と「マッシュルーム」から変化する。 7.0より低いpHが使用される場合、したがって、それはさらにジスクシンイミジル酒石酸を用いて表面を不動態化することが推奨される&lt;SUP&gt; 7。 展望 この作品は、高品質な表面パッシベーションを達成するための堅牢なプロトコルを提供してきました。このプロトコルは、タンパク質14、ならびに細胞抽出物および免疫沈降物15内でのタンパク質複合体に関与している単一分子蛍光研究のために有用であろう。これは、広くそのような力分光法とトルク分光16のような他の単一分子技術に使用される。また、表面17に吸着するから細胞を予防するために有用であろう。 この作品では提供されたプロトコルは、多段階の手順については、要求している。脂質-PEG 8およびポリリジン、PEG 9を用いた表面パッシベーションは、別のアプローチとして使用できます。日時は、それは実装が容易である任意の化学反応を必要としない。しかしながら、不動態化の程度は、化学MODIFを介して達成されるほど高くはない表面のication。

単一分子タンパク質の研究を行う際には、実験は、任意の表面に誘導されるタンパク質の機能不全又は変性1,2から自由になるように表面パッシベーションの高品質を達成するために不可欠である。例えば、ウシ血清アルブミンなどの界面活性剤で処理されたガラス表面は、一般に単一分子核酸試験3のために使用されているが、その不動態化の程度は、タンパク質の研究のために十分に高くない。ポリマー（ポリエチレングリコール、PEG）でコーティングされたガラス表面は、パッシベーション性能4-6に優れている。これにより、それは、単一分子蛍光研究7月10日に導入されて以来、単一分子タンパク質研究のための普遍的に使用されるようになった。ポリマーコーティング手順は、複数の表面処理7,11,12を必要とする。したがって、詳細な指示なしで全体の手順に従うことは困難である。多くの場合、表面保護の程度は、どのプロトコルIに依存して変化するSが続いた。ここでは、単一分子、タンパク質研究の主要なボトルネックの1が削除され、ステップ·バイ·ステップの手順、堅牢なプロトコルを提示する。概要については図1を参照してください。

<table><tbody><tr><td colspan="4">1.スライドの準備とクリーニング</ストロング></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>Sigma</td><td>32201</td><td>1 L</td></tr><tr><td>カバースリップ</td><td>VWR</td><td>631-0136 631-0144 631-0147</td><td>24 x 32 mm2, 22 x 40 mm2, 24 x 50 mm2 &nbsp;(No.1&frac12;、長方形)</td></tr><tr><td>ダイヤモンドドリルビット</td><td>MTN-Giethoorn、オランダ</td><td>LA-0564-00DB</td><td>3/4 mm</td></tr><tr><td>Duranスライド</td><td>ホルダーLGS、オランダ</td><td>213170003</td><td></td></tr><tr><td>ガラス染色皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>300101</td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>ブーム</td><td>6233905</td><td>1 L、過酸化水素30%. 開封したボトルは4°Cで保存する必要があります。</td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>ブーム</td><td>80900627.9010</td><td>硫酸 95-98%</td></tr><tr><td>KOH</td><td>シグマ</td><td>30603</td><td>水酸化カリウム</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>シグマ</td><td>32213</td><td>1 L</td></tr><tr><td>ソニケーター</td><td>ブランソン</td><td></td><td>卓上超音波洗浄機、3510</td></tr><tr><td>クォーツ</td><td>スライド Finkenbeiner</td><td></td><td>1" x 3", 1mm thick</td></tr><tr><td colspan="4">2.カバースリップクリーニング</strong</td></tr><tr><td>>Duranスライド</td><td>ホルダーLGS、オランダ</td><td>213170003</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>シグマ</td><td>30603</td><td>水酸化カリウム</td></tr><tr><td>ソニケーター</td><td>ブランソン</td><td></td><td>卓上超音波洗浄機、3510</td></tr><tr><td colspan =" 4">3。スライドとカバーガラスのアミノシラン化</強力</td></tr><tr><td>>酢酸</td><td>シグマ</td><td>320099-500ML</td><td>酢酸、氷河</td></tr><tr><td>APTES</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>281778-100ML</td><td>3-アミノプロピルトリメトキシシラン. 室温で N2.月に一度交換してください。</td></tr><tr><td>フラスコ(200ml)</td><td>VWR</td><td>フラスコ(200ml)</td><td>パイレックスフラスコ. アミノシラン化専用のフラスコを1つ用意してください。</td></tr><tr><td>メタノール</td><td>シグマ</td><td>32213</td><td>1 L</td></tr><tr><td>ソニケーター</td><td>ブランソン</td><td></td><td>卓上超音波洗浄機、3510<</td></tr><tr>td colspan="4">4。ポリマーを使用した表面不動態化(第1ラウンド)</td></tr><tr><td>Biotin-mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>Bio Biotin-PEG-SVA-5000-100mg</td><td>Biotin-PEG-SVA, MW 5,000&nbsp;Da. -20°Cで1-2mg(スライド10枚分)のアリコートを保存;N2の下のC。</td></tr><tr><td>mPEG</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td>mPEG-スクシンイミジル吉草酸エステル (SVA)、MW 5,000 Da. -20 > で 80 mg (スライド 10 枚分) のアリコートを保管します。N2の下のC。</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S6014-500G</td><td></td><</tr><tr>td colspan =" 4">5。表面不動態化(第2ラウンド)</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418-100ML</td><td>ジメチルスルホキシドBioReagent、分子生物学用、&ge;99.9%</td></tr><tr><td>DST</td><td>Pierce</td><td>20589</td><td>酒酸ジスクシンイミジル</td></tr><tr><td>MS4-PEG</td><td>Pierce</td><td>22341</td><td>Short NHS-ester PEG, MW 333 Da. 100 mg MS4-PEG を 1.1 ml DMSO に溶解します。ストア20&マイクロ;-20°Cのlアリコート。</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S6014-500G</td><td></td><</tr><tr>td colspan="4">6。マイクロ流体チャンバーの組み立て</td></tr><tr><td>ダブル粘着テープ</td><td>スコッチ</td><td></td><td>10 mm 幅</td></tr><tr><td>エポキシ</td><td>Thorlabs</td><td>G14250</td><td>Devcon 5 分エポキシ</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888-1 KG</td><td>塩化ナトリウム</td></tr><tr><td>ニュートラアビジン</td><td>ピアス</td><td>31000</td><td>免疫純粋ニュートラアビジン ビオチン結合タンパク質. H2O の 5 mg/ml のストック4°Cで。</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン</td><td>Invitrogen</td><td>S-888</td><td>H2O または T50 で 4 >C で 5 mg/ml をストック。</td></tr><tr><td>トリズマベース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1 KG</td><td>トリス</td></tr></tbody></table>

単一分子タンパク質研究のための表面パッシベーション

Surface Passivation for Single-molecule Protein Studies

単一分子蛍光分光法は、ナノスケールでの生物学的現象の広い範囲を理解する上で器械であることが証明された。この技術は生物科学にもたらすことができるものの重要な例は、タンパク質 - タンパク質及びタンパク質 - 核酸相互作用メカニズムの洞察である。タンパク質の相互作用は、単一分子レベルでプローブされる場合、タンパク質またはそれらの基質は、しばしば長期の観察を可能にするガラス表面上に固定化される。この固定化スキームは、望ましくない表面アーティファクトを導入することができる。したがって、それが不活性にするガラス表面を不動態化することが不可欠である。ポリエチレングリコール（PEG）を用いた表面コーティングは、非特異的にガラス表面と相互作用するタンパク質を防止する上で高いパフォーマンスを得るために際立っている。しかしながら、ポリマーコーティング手順は、表面には表面処理を必要とする一連の厳しい要件から生じる合併症のために、困難である手順の最後に任意の蛍光分子を含まない。ここでは、ステップ·バイ·ステップの手順で堅牢なプロトコルを提供する。これは、ピラニアエッチング、アミン基を有する表面官能化、および最終的にPEGのコーティングを含む表面洗浄を覆っている。 PEG層の高密度化を得るために、我々は、著しく不動態化の品質を向上させる二回にわたってPEG分子で表面を処理する新たな戦略を紹介する。誰もが高品質な表面パッシベーションを達成できるように、私たちは、代表的な結果だけでなく、それぞれの重要なステップのための実践的なアドバイスを提供します。

マイクロ流体チャンバアセンブリ後（ステップ7.1 - 7.6）ステップ7.7を行う前に、それがPEG化された表面の品質管理を行うことが推奨される。 表面不動態化が正常に行われた場合には、10未満が非特異的に撮像面積当たりのタンパク質が吸着される（25ミリメートル×25ミリメートル）1〜10nMの蛍光標識されたタンパク質は（ 左図3a）チャンバーに添加されたときに観察した。 洗浄または反応ステップのいずれかが正しく行われていない場合には、非特異的の数が有意に増加するタンパク質を吸着させ、CCD画面は蛍光信号によって飽和されてもよい。ピラニアエッチングがスキップされる場合、観察された非特異的吸着の100倍の量が存在する（図3a;中間残さコンペア）。二PEG化ステップがスキップされると、約3時間がありましたsaの非特異的吸着が観察さ多量の（ 図3b）。 PEG化の程度が低い（数ヶ月間、室温で保存例えば APTES）が満了化学物質が（データは示していない）が使用される場合に観察される。かなりの時間、それがPEG化されてから通過した場合に、その表面の質もドロップダウンし（ 図3a、右と左を比較してください）。 当社の認知する限り、それはPEG化の2回は、単一分子の研究のために導入されたのは今回が初めてである。 PEG化の2回は、PEG層形成（ 図3b）の最高の品質を保証します。二重PEG化の優れた性質が顕著に（ 動画1Bと一緒に映画1aと比較）映画の中で示されている。これらの映画では、溶液中の蛍光分子からのバックグラウンド信号は、二重PEG化だったときに非常に弱いことが観察されている<html>タンパク質は二重にPEG化層により、より効果的に反発されていることを示している、使用。この2段階のプロセスを強くお勧めしますが、あなたの実験は、最適でない不動態に許容される場合は、2番目のPEG化ステップは省略されることがあります。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig1highres.jpg" width="500" /> 図1：表面処理の回路図（a）の顕微鏡スライドをアセトン、KOH、およびピラニア溶液で洗浄される。これは、NHS-エステルPEGでAPTESおよびPEG化で官能化されている。必要に応じて、（b）は、カバースリップをピラニア溶液でKOH、並びに洗浄する。これは、NHS-エステルPEGでAPTESおよびPEG化で官能化されている。 fig2highres.jpg &quot;幅=&quot; 500 &quot;/&gt; 図2：マイクロ流体室（A）のシングルチャネル室。顕微鏡のスライドには、掘削穴が2つあります。これは、両面粘着テープの2スライスを使用してカバーガラスで組み立てられる。 （b）は、3チャンネルチャンバ。顕微鏡スライドは、掘削6穴があります。これは、両面粘着テープの4つのスライスを使用してカバーガラスで組み立てられる。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50549/50549fig3highres.jpg" width="500" /> 図3：溶液中の色素標識タンパク質で撮影したCCD画像 。 （a）は、CCDイメージが溶液中で10nMのCy3標識labeld担当して60X対物レンズを用いたプリズム型全反射蛍光顕微鏡によって撮影した。 （左）表面は、この資料に記載されているプロトコールに従って調製した。 （中央）表面はPREPAたこの資料に記載されているプロトコールに従って、赤が、ピラニアエッチングはスキップされました。 （右）表面は、この資料に記載されているプロトコールに従って調製し、窒素下-20℃で3ヶ月間保存した。 （b）は、溶液中で10 nMのCy3でlabeld担当で撮影したCCD画像。 （左）表面は、この資料に記載されているプロトコールに従って調製した。 （右）表面は、この資料に記載されているプロトコールに従って製造したが、PEG化の第二ラウンドはスキップされました。スケールバー=5μmである。 映画1：溶液中の色素標識タンパク質で撮影したCCDの映画 。 CCDムービーは、溶液中で10nMのCy3標識labeld担当して60X対物レンズを用いたプリズム型全反射蛍光顕微鏡によって撮影した。時間分解能は100ミリ秒である。 （a）は、表面がこの資料に記載されているプロトコールに従って調製した。 （b）は、表面がこの資料に記載されているプロトコールに従って調製したが、PEGylの第二ラウンドATIONはスキップされました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1a.avi" target="_blank">こちらをクリックして</a>動画1Aを表示および<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50549/Movie1b.avi" target="_blank">こちらをクリックして</a>動画1Bを表示する。

我々は、ポリエチレングリコール（PEG）を用いてガラス表面を不動態化するための方法を記載している。このプロトコルは、表面洗浄、表面機能化、およびPEGコーティングをカバーしています。私たちは、既存の方法に比べて不動態の優れた品質が得られ2回のラウンドでのPEG分子で表面を処理するための新たな戦略を、ご紹介します。

Single-molecule fluorescence spectroscopy has proven to be instrumental in understanding a wide range of biological phenomena at the nanoscale. Important ...

本手順の全体的な目的は、高品質な処理済みクォーツスライド表面を得ることにあります。まず、穴あけ加工済みクォーツスライドとカバーガラスを水とアセトンで洗浄します。その後、水酸化カリウムおよびピラニア溶液を用いてスライドをエッチングし、表面の品質を向上させます。次に、スライドガラスとカバーガラスをアミノ基で機能化し、続いてポリマーを用いて2回の表面処理を行い、ガラス表面を不活性化します。最終ステップとして、ポリエチレングリコールでコーティングされた、あるいはペグ化された表面が互いに向き合うようにして、スライドガラスとカバーガラスからマイクロ流体チャンバーを組み立てます。最終的に、ペグ分子を用いて2回にわたり表面処理を行うという新しい戦略により、単一分子蛍光顕微鏡で観察されるように、パッシベーションの品質が著しく向上します。本手法の主な利点は、酸化カリウムエッチング後のポリマーコーティングなどの既存手法と比較して、優れた品質が保証されることです。この方法に不慣れな方は、複数の表面処理を行う必要があるため、習得に時間を要します。まず、テキストプロトコルに従って石英スライドを準備します。スライドをガラス製染色瓶に入れ、洗浄します。通常、1つの瓶に5枚から15枚のスライドを入れることができます。次に、UE waterで3回繰り返しすすぎます。その後、汚れを取り除くためにUE waterを用いて5分間超音波洗浄し、水を廃棄した後、さらに3回UE waterですすぎます。次に、UE水をアセトンに置き換え、スライドをアセトンで20分以上超音波洗浄します。アセトンを廃棄し、Milli Q水でスライドをすすいでアセトンの残留物を除去してください。続いて、水を1 Mの水酸化カリウムに置き換え、スライドを20分以上超音波洗浄します。過剰なエッチングは表面の質を向上させますが、蛍光イメージングを妨げる可能性のある傷が生じます。ピラニアエッチングを行うために、Milli Q水でスライドを3回すすぎ、水酸化カリウムの痕跡を除去します。スライドをDuran製スライドホルダーまたはカスタムメイドのテフロン製ホルダーに移し、化学薬品用フード内に設置した1リットルのビーカーに入れます。ビーカーに450 millilitersの硫酸を満たします。次に、硫酸と過酸化水素の比率が3:1になるように、過酸化水素を150 milliliters加えます。溶液を撹拌して十分に混合させ、ビーカーに触れずに20分間静置します。ピラニア溶液からスライドを取り出し、ミルリュー水を入れたスライドホルダーに入れます。その間に、ピラニア溶液を所定の廃棄ボトルに廃棄します。室温に達したら、カバーガラスの洗浄手順に従い、スライドをUE waterで3回すすぎます。染色皿のUE waterをメタノールに交換します。スライドとカバーガラスをメタノール中に保存します。その間に、フラスコに100 millilitersのメタノールを注ぎ、アミノシリル化溶液を調製します。次に、5 millilitersの酢酸と3 millilitersの3-アミノプロピルトリメトキシシランを加え、ゆっくりと振って混ぜ合わせます。スライドとカバーガラスが入った染色皿の中のメタノールを、このアミノシリル化反応液に交換します。20〜30分間インキュベートし、その間に1分間の超音波処理を1回行います。次に、アミノ島形成反応液をメタノールに置換します。その後、メタノールを捨て、新しいメタノール溶液を加えます。表面修飾の第1ラウンドとして、この手順を3回繰り返します。まず、ポリマーを用いてスライドガラスとカバーガラスを窒素ガスで乾燥させます。次に、PEG化させる面を上にして、milli Q水が部分的に満たされた清潔なピペットボックスに入れます。続いて、調製済みのPEG溶液に、調製したばかりの反応バッファーを64 µL加えます。完全に溶解させるために、ピペットで混合液を吸い上げ、吐き出しを繰り返します。次に、16,100 Gで1分間遠心分離します。気泡を取り除くため、ペグ化混合液を70 µL、乾燥させた石英スライドの上に滴下します。乾燥させたカバーガラスを溶液の上にそっと載せ、スライドを暗所で湿度の高い環境に2時間から一晩インキュベートし、ペグ化されたスライドとカバーガラスを保存します。カバーガラスを横にずらしてスライドとカバーガラスを慎重に分離し、超純水で洗浄した後、窒素ガスで乾燥させます。ペグ化された面が互いに向き合わないようにして、1組のスライドとカバーガラスを50 mLチューブに入れます。チューブの蓋を半分閉じて真空にし、窒素ガスを充填してから蓋をしっかりと締め付けます。−20 °Cで保存してください。これらの手順により、ペグ化された表面を長期間保存することができます。マイクロ流路チャンバーを組み立てる直前に、テキストプロトコルに従って2回目のペグ化を行います。ペグ化された面を上にして、クオーツスライドを平らな面に置きます。スライドの上に両面粘着テープを貼ることで、ペグ化された表面に斜めにチャネルを作成します。穴がチャネルの中央に配置されていることを確認してください。次に、ペグ化されたカバーガラスを上にそっと置き、チャンバーを完成させます。このとき、ペグ化された面を下に向けてください。両面テープを貼付した箇所に合わせてカバーガラスを押し当て、チャンバーを密封します。水が漏れないよう、丁寧かつ確実に密閉してください。最後に、チャンバーの縁をエポキシ樹脂で封止します。テキストプロトコルに従い、ストレプトアビジンまたは中性アビジンを固定し、単一分子イメージング用のビオチン化生物分子を添加します。表面処理が正常に完了していれば、観察されるイメージング領域あたりに非特異的に吸着したタンパク質は10個未満となります。1から10 nanomolarの蛍光標識タンパク質をチャンバーに添加した際、洗浄または反応ステップのいずれかが適切に行われていない場合、非特異的に吸着したタンパク質の数は大幅に増加します。例えば、ピラニアエッチングを省略した場合、非特異的吸着が100倍多く観察されます。二重ペギレーションの優れた特性がここで顕著に示されています。左パネルに示されているように、二重ペギレーションを用いた場合、蛍光分子および溶液からのバックグラウンド信号が大幅に弱くなることが観察されました。これは、二重ペギレーション層によってタンパク質がより効果的に反発されることを示しています。この手法を習得すれば、適切に実施することで4時間で完了させることができます。AYAの取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施中は、適切な手袋、ゴーグル、エプロンなどの予防策を必ず講じてください。

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化学

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単一分子タンパク質研究のための表面パッシベーション

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