単一分子タンパク質研究のための表面パッシベーション

この手順の全体的な目標は、優れた品質の石英スライド面を生成することです。これは、最初にドリルで開けられた石英スライドとカバースリップを水とアセトンで洗浄することによって達成されます。次に、スライドに水酸化カリウムとピラニア溶液をエッチングして、表面の品質を向上させます。

次に、スライドとカバースリップをアミン基で官能基化し、続いてポリマーを使用して2ラウンドの表面化を行い、ガラス表面を不活性にします。最後のステップは、スライドからマイクロ流体チャンバーを組み立て、ポリエチレングリコールコーティングまたはペグ表面を互いに向き合わせてスリップを覆うことです。最終的に、表面をPEG分子で2ラウンドにわたって処理する新しい戦略により、単一分子蛍光顕微鏡で観察される不動態化の品質が著しく向上します。

この技術または酸化カリウムエッチング後のポリマーコーティングなどの既存の技術の主な利点は、この技術が優れた品質を保証することです。この方法に不慣れな人は、複数のサービス治療を行う必要があるため、苦労するでしょう。ドリルを開始すると、テキストプロトコルに詳述されているように、クォーツがスライドします。

スライドをガラス製の染色瓶に入れて、スライドを清掃します。通常、5〜15枚のスライドを1つの瓶に入れることができます。次に、すすぎを3回繰り返した後、スライドをUE水ですすぎ、スライドをUE水で5分間超音波処理して汚れを取り除き、水を処分し、スライドをUE水でさらに3回すすぎます。

次に、UE水をアセトンに交換し、スライドをアセトンで20分以上超音波処理し、アセトンを廃棄し、スライドをMilli Q水ですすいでアセトン残留物を取り除きます。次に、水を1モルの水酸化カリウムに交換し、スライドを20分以上超音波処理します。過度のエッチングは表面の品質を向上させますが、蛍光イメージングを妨げる可能性のある傷が発生します。

スライドをMilli Q水で3回すすぎ、微量の水酸化カリウムを取り除き、ピラニアエッチングを行います。スライドをデュランスライドホルダーまたはカスタムメイドのテフロンホルダーに移し、ケミカルフードにある1リットルのビーカーに入れます。ビーカーに450ミリリットルの硫酸を入れます。

次に、150ミリリットルの過酸化水素を加えて、硫酸と過酸化水素の比率を3対1にします。溶液を攪拌して適切に混合し、ビーカーを20分間そのままにしておきます。ピラニア溶液からスライドを取り出し、ミリユーウォーターが入ったスライドホルダーに入れます。

その間、ピラニア溶液は指定された廃液ボトルに捨てます 室温に達したら、カバースリップのクリーニング後にスライドをUE水で3回すすいでください。染色皿のUE水をメタノールと交換します。スライドとカバースリップはメタノールで保管してください。

その間に、フラスコに100ミリリットルのメタノールを注いでアミノアイランド化溶液を調製します。その後、5ミリリットルの酢酸と3ミリリットルの3アミノプロピル、トリメチルを加え、振とうして穏やかに混ぜます。スライドとカバースリップを含む染色皿のメタノールをアミノシロ化反応混合物と交換します。

インキュベーション中に20〜30分間インキュベートし、1分間1回超音波処理します。次に、アミノアイランド化反応をメタノールに置き換えます。次に、メタノールを捨てて、新しいメタノール溶液を追加します。

表面化の最初のラウンドでこの手順を3回繰り返します 最初にポリマーを使用して、窒素ガスを使用してスライドとカバースリップを乾燥させます。次に、部分的にミリQ水で満たされた清潔なピペットボックスに、ペグする必要がある側面が上を向くように置きます。次に、調製したばかりの反応緩衝液64マイクロリットルを調製したペグ溶液に加えます。

混合物を上下にピペットで動かして、完全に溶解させます。その後、16, 100 Gで1分間遠心分離します。気泡を取り除くには、70マイクロリットルのペグ化混合物を乾燥した石英スライドに落とします。

乾燥したカバースリップを溶液の上にそっと置き、スライドを暗くて湿度の高い環境で2時間から一晩インキュベートして、ペグ化されたスライドとカバースリップを保管します。スライドとカバースリップを慎重に分解し、カバースリップを横にスライドさせ、UE水ですすいでから窒素ガスで乾燥させました。スライドとカバースリップのペアを50ミリリットルのチューブに入れ、ペグ化された表面が互いに反対側を向くようにします。

チューブを部分的に閉じて真空にしてから、窒素ガスを充填し、蓋をしっかりとねじ込みます。マイナス20°Cで保管してください。これらの手順は、ペグ化された表面を長期間保持するのに役立ちます。

スライドを使用してマイクロ流体チャンバーを組み立てる直前に、テキストプロトコルに記載されているように2回目のPEGYLATIONを実行します。ペグ加工された面を上に向けて、平らな面にクォーツスライドを置きます。スライド上に両面粘着テープを貼って、ペグ化された表面に斜めにチャネルを作成します。

穴がチャネルの中央に配置されていることを確認してください。次に、ペグ加工されたカバースリップを上にそっと置き、チャンバーを完成させます。ペグ加工された面を下に向けて。

両面テープが置かれている領域にカバースリップを押して、チャンバーを密閉します。チャンバーが水密に密閉されるように、優しく、しかし徹底的に行ってください。最後に、チャンバーの端をエポキシ接着剤で閉じます。

ストレプトアビジンまたは中性トラバインを固定化し、テキストプロトコルに記載されているように、ビオチン化生体分子を単分子イメージング用に添加し、表面化が成功裏に行われた場合、観察されるイメージング領域ごとに10個未満の非特異的に吸収されたタンパク質があります。1〜10ナノモルの蛍光標識タンパク質をチャンバーに添加すると、洗浄または反応ステップのいずれかが適切に行われていないと、非特異的に吸収されたタンパク質の数が大幅に増加します。例えば、ピラニアエッチングをスキップすると、100倍の非特異的吸収が観察されます。

ダブルペグレーションの優れた性質は、ここで顕著に示されています。蛍光分子と溶液からのバックグラウンドシグナルは、左のパネルに示すようにダブルペグ化を使用した場合、はるかに弱いことが観察されました。これは、タンパク質が二重ペグ化層によってより効果的に反発されることを示しています。

一度習得すると、このテクニックは適切に実行すれば4時間で完了することができます。AYAでの作業は、この手順を実行する際に、適切な手袋、ゴーグル、エプロンなどの非常に危険な予防措置を常に講じる必要があることを忘れないでください。