単一分子タンパク質研究のための表面パッシベーション

本手順の全体的な目的は、高品質な処理済みクォーツスライド表面を得ることにあります。まず、穴あけ加工済みクォーツスライドとカバーガラスを水とアセトンで洗浄します。その後、水酸化カリウムおよびピラニア溶液を用いてスライドをエッチングし、表面の品質を向上させます。

次に、スライドガラスとカバーガラスをアミノ基で機能化し、続いてポリマーを用いて2回の表面処理を行い、ガラス表面を不活性化します。最終ステップとして、ポリエチレングリコールでコーティングされた、あるいはペグ化された表面が互いに向き合うようにして、スライドガラスとカバーガラスからマイクロ流体チャンバーを組み立てます。最終的に、ペグ分子を用いて2回にわたり表面処理を行うという新しい戦略により、単一分子蛍光顕微鏡で観察されるように、パッシベーションの品質が著しく向上します。

本手法の主な利点は、酸化カリウムエッチング後のポリマーコーティングなどの既存手法と比較して、優れた品質が保証されることです。この方法に不慣れな方は、複数の表面処理を行う必要があるため、習得に時間を要します。まず、テキストプロトコルに従って石英スライドを準備します。

スライドをガラス製染色瓶に入れ、洗浄します。通常、1つの瓶に5枚から15枚のスライドを入れることができます。次に、UE waterで3回繰り返しすすぎます。その後、汚れを取り除くためにUE waterを用いて5分間超音波洗浄し、水を廃棄した後、さらに3回UE waterですすぎます。

次に、UE水をアセトンに置き換え、スライドをアセトンで20分以上超音波洗浄します。アセトンを廃棄し、Milli Q水でスライドをすすいでアセトンの残留物を除去してください。続いて、水を1 Mの水酸化カリウムに置き換え、スライドを20分以上超音波洗浄します。過剰なエッチングは表面の質を向上させますが、蛍光イメージングを妨げる可能性のある傷が生じます。

ピラニアエッチングを行うために、Milli Q水でスライドを3回すすぎ、水酸化カリウムの痕跡を除去します。スライドをDuran製スライドホルダーまたはカスタムメイドのテフロン製ホルダーに移し、化学薬品用フード内に設置した1リットルのビーカーに入れます。ビーカーに450 millilitersの硫酸を満たします。

次に、硫酸と過酸化水素の比率が3:1になるように、過酸化水素を150 milliliters加えます。溶液を撹拌して十分に混合させ、ビーカーに触れずに20分間静置します。ピラニア溶液からスライドを取り出し、ミルリュー水を入れたスライドホルダーに入れます。

その間に、ピラニア溶液を所定の廃棄ボトルに廃棄します。室温に達したら、カバーガラスの洗浄手順に従い、スライドをUE waterで3回すすぎます。染色皿のUE waterをメタノールに交換します。スライドとカバーガラスをメタノール中に保存します。

その間に、フラスコに100 millilitersのメタノールを注ぎ、アミノシリル化溶液を調製します。次に、5 millilitersの酢酸と3 millilitersの3-アミノプロピルトリメトキシシランを加え、ゆっくりと振って混ぜ合わせます。スライドとカバーガラスが入った染色皿の中のメタノールを、このアミノシリル化反応液に交換します。

20〜30分間インキュベートし、その間に1分間の超音波処理を1回行います。次に、アミノ島形成反応液をメタノールに置換します。その後、メタノールを捨て、新しいメタノール溶液を加えます。

表面修飾の第1ラウンドとして、この手順を3回繰り返します。まず、ポリマーを用いてスライドガラスとカバーガラスを窒素ガスで乾燥させます。次に、PEG化させる面を上にして、milli Q水が部分的に満たされた清潔なピペットボックスに入れます。続いて、調製済みのPEG溶液に、調製したばかりの反応バッファーを64 µL加えます。

完全に溶解させるために、ピペットで混合液を吸い上げ、吐き出しを繰り返します。次に、16,100 Gで1分間遠心分離します。気泡を取り除くため、ペグ化混合液を70 µL、乾燥させた石英スライドの上に滴下します。

乾燥させたカバーガラスを溶液の上にそっと載せ、スライドを暗所で湿度の高い環境に2時間から一晩インキュベートし、ペグ化されたスライドとカバーガラスを保存します。カバーガラスを横にずらしてスライドとカバーガラスを慎重に分離し、超純水で洗浄した後、窒素ガスで乾燥させます。ペグ化された面が互いに向き合わないようにして、1組のスライドとカバーガラスを50 mLチューブに入れます。

チューブの蓋を半分閉じて真空にし、窒素ガスを充填してから蓋をしっかりと締め付けます。−20 °Cで保存してください。これらの手順により、ペグ化された表面を長期間保存することができます。

マイクロ流路チャンバーを組み立てる直前に、テキストプロトコルに従って2回目のペグ化を行います。ペグ化された面を上にして、クオーツスライドを平らな面に置きます。スライドの上に両面粘着テープを貼ることで、ペグ化された表面に斜めにチャネルを作成します。

穴がチャネルの中央に配置されていることを確認してください。次に、ペグ化されたカバーガラスを上にそっと置き、チャンバーを完成させます。このとき、ペグ化された面を下に向けてください。

両面テープを貼付した箇所に合わせてカバーガラスを押し当て、チャンバーを密封します。水が漏れないよう、丁寧かつ確実に密閉してください。最後に、チャンバーの縁をエポキシ樹脂で封止します。

テキストプロトコルに従い、ストレプトアビジンまたは中性アビジンを固定し、単一分子イメージング用のビオチン化生物分子を添加します。表面処理が正常に完了していれば、観察されるイメージング領域あたりに非特異的に吸着したタンパク質は10個未満となります。1から10 nanomolarの蛍光標識タンパク質をチャンバーに添加した際、洗浄または反応ステップのいずれかが適切に行われていない場合、非特異的に吸着したタンパク質の数は大幅に増加します。例えば、ピラニアエッチングを省略した場合、非特異的吸着が100倍多く観察されます。

二重ペギレーションの優れた特性がここで顕著に示されています。左パネルに示されているように、二重ペギレーションを用いた場合、蛍光分子および溶液からのバックグラウンド信号が大幅に弱くなることが観察されました。これは、二重ペギレーション層によってタンパク質がより効果的に反発されることを示しています。

この手法を習得すれば、適切に実施することで4時間で完了させることができます。AYAの取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施中は、適切な手袋、ゴーグル、エプロンなどの予防策を必ず講じてください。