AFMベースの力分光法のための単一分子の共有結合
March 16th, 2020
原子間力顕微鏡(AFM)片持ち体先端へのプローブ分子の共有結合は、その物理的性質を調査する上で不可欠な技術である。これにより、AFMベースの単一分子力分光法を介して、高い再現性を持つ伸縮力、脱着力、ポリマーの長さを決定することができます。
一分子力分光法により、ポリマーの機械的および接着特性を表す物理的パラメータを測定することができます。AFMベースの力分光法を用いて単一分子を研究する場合、これらの分子をAFMカンチレバーチップに共有結合するための信頼性の高い効率的なプロトコルを持つことは不可欠です。このプロトコルは、輪郭の長さや疎水性に関係なく、多くの異なるポリマーに採用することができます。
すべてのステップは、有機蒸気の吸入を避けるためにヒュームフードで行われるべきです。さらに、耐溶剤性ガラス、ラボコート、および目の保護が必要です。最初に、プラズマチャンバーにAFMカンチレバーチップを配置するために、清潔にしたピンセットを使用してください。
開始を選択してプラズマチャンバー表面活性化プログラムを開始し、はい。プラズマプロセスが正常に動作していることを確認します。酸素含有量の高いプラズマプロセスは、水色を示します。
表面活性化プログラムが実行されている間、トルエン中のシラン-PEGマルを溶解し、1ミリリットル当たり1.25ミリグラムの濃度を得る。溶液の3ミリリットルを平らなペトリ皿に入れます。プラズマプロセスが完了したら、確認を選択してから通気してプラズマチャンバーを換気します。
汚染物質の吸収を防ぐために、直ちに次のステップに進みます。ペトリ皿にチップを入れ、チップを摂氏60度で3時間インキュベートします。オーブンからペトリ皿を取り出し、少なくとも10分間冷まします。
次に、チップをすすいます。PEGまたはポリスチレン結合の場合、トルエンでチップを3回リンスします。ポリニパム結合の場合、チップはトルエンで1回、エタノールで2回リンスする必要があります。
AFM片持ちに対するキャピラリー力の影響を軽減するには、すすいでチップをわずかに傾けます。AFMカンチレバーチップは、実験に影響を与える可能性のある物理的なポリマーの余分を除去するために適切にすすがる必要があります。AFMカンチレバーの損傷を防ぐために、リンスは慎重に行う必要があります。
最後に、少なくとも2つのチップを準備して、共有ポリマー付着を受け取らないコントロールとして機能します。PEGおよびポリスチレンチップに対するコントロールの場合は、エタノールで2回、水で1回リンスします。ポリニパムチップに対するコントロールの場合は、水で2回リンスします。
PEGまたはポリスチレンの共有結合を行うために、1ミリリットル当たり1.25ミリグラムの濃度でトルエン中のポリマー溶液を3ミリリットル調製する。水田皿に溶液とチップを加え、チップを摂氏60度で1時間インキュベートします。PEGまたはポリスチレンでインキュベーションした後、チップを10分間冷却します。
トルエンでチップを2回、エタノールで2回、水で1回リンスします。ポリニパムの共有結合を行うために、1ミリリットル当たり1.25ミリグラムの濃度でエタノール中にポリマー溶液を3ミリリットル調製する。水田皿に溶液とチップを加え、チップを室温で3時間インキュベートします。
ポリニパムでインキュベーションした後、チップをエタノールで2回、水で2回リンスします。実験で使用するまでチップを保存するには、水で満たされた1ミリリットルのペトリ皿に各チップを別々に置きます。ペトリ料理を摂氏4度に保ちます。
まず、機能化されたAFMカンチレバーチップをチップホルダーに挿入します。液体の測定に適したサンプルホルダーに準備された表面を接着します。チップを水に浸すためにピペットを使用します。
サンプル表面をAFMに取り付けます。サンプル表面を水に浸します。チップホルダーをAFMに接続します。
その後、チップをサンプル表面に近付けます。環境パネルを使用して目標温度を設定し、モードとフィードバックのラジオボタンをオンに切り替えます。その後、システムを約15分間平衡させます。
力延長曲線を取るためには、表面にAFM片持ち線先端を近づき、単一の力を選択します。結果の曲線は、ピエゾ距離に対する偏向を表示し、サーフェスへのアプローチを赤で表示し、引き込みを青色で示します。AFM 片持ち線先端のインデントを表す曲線の部分を、下のサーフェスに展開します。
線形フィットを実行するには、アプローチまたはリトラクトカーブにカーソルを設定し、コンテキストメニューから更新INVOLSを選択します。反転光レバー感度値の結果値が左上のパネルに表示されます。この手順を5回以上繰り返した後、逆光レバー感度の平均値を計算し、パネルに平均値を入力します。
AFM片持ち面を約100マイクロメートルの高さに配置し、移動を選択して事前エンゲージします。熱ノイズスペクトルの信号対雑音比を得るためには、平均値を少なくとも10に設定し、可能な限り高い周波数分解能を選択します。次に、キャプチャ熱データを選択して、熱ノイズスペクトルを記録します。
熱ノイズスペクトルを単純な高調波振動器機能でフィットさせるために、最初の共鳴ピークを表す曲線の部分を拡大します。次に、初期化適合を選択します。最後に、適合熱データボタンを使用して適合を調整します。
それぞれの力定数がパネルに表示されます。データの収集を開始するには、実験のパラメータを設定します。1マイクロメートル/秒に引き上げ速度を設定し、1ナノニュートンにトリガーを強制します。
表面にAFM片持ち線先の先端をアプローチし、単一の曲線を記録する単一の力を選択し、パラメータが原稿に記載されているように調整する必要があるかどうかを判断します。マスターパネルから[F マップ]を選択します。100 の曲線を含むフォース マップを取得するには、力点と力線の数を 10 に設定します。
Fマップを実行を選択して、力マップの記録を開始します。ローカル サーフェスの効果を回避し、異なるサーフェス領域を平均化するために、グリッドのような方法で強制的に延長カーブを取ります。実験後、逆光レバー感度とばね定数の判定を繰り返し、システムの一貫性と安定性を確認します。
単一ポリニパムおよびPEGポリマーは、一方の端でAFM片持ち体先端に共有結合し、他方の端に二酸化ケイ素表面にフィシソードした。温度依存性の延伸挙動を測定するために、明確な単一分子ストレッチイベントと、それぞれの力延長曲線の終点での最終的な最大値が同定された。その後、すべての温度に対して単一のマスターカーブが生成されました。
PEGの場合、温度上昇に伴って延伸力の低下が認められた。ポリニパムの場合、反対の傾向が観察された。水のSAM表面からのポリスチレンの脱離は、脱離力および長さを決定するために使用することができる。
ポリマー付着が成功すると、力伸力曲線は一定の力のプラタスを示した。各高原には、脱離力と脱着長を決定するためにシグモイド曲線を取り付けた。観測された脱離力は、以前に得られた値に対応していた。
AFM片持ち板先端に複数のポリマーが付着した場合、力伸力曲線では高原のカスケードが観察された。2つのポリマーが取り付けられた状態で、脱離力が狭い分布を示す一方で、脱着長に対してバイモーダル分布が見つかりました。機能化されたAFM片持ち体先端は液体環境および外部刺激で単一分子の力の応答を定量化するために使用することができる。
クリーンな設備、溶媒、AFMの片持ち先端、および反復洗浄の使用は、説明した制御実験の前に確認されるべき高いレベルの清浄度に達するために非常に重要である。提示されたプロトコルと手順は、刺激応答性ポリマーシステムのより良い理解のための道を開いた。結果は分子動的シミュレーションと直接比較することができる。
概要
この記事では、アトミックフォースマイクロスコープ（AFM）のカンチレバーチップにプローブ分子を共有結合で結合させるプロトコルについて説明します。これは高分子の物理的特性を研究するために重要です。この方法により、伸張力、脱離力、ポリマーの長さを高い再現性で測定することができます。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 生物物理学
- 高分子科学
背景
- 単分子力分光法は、ポリマーの機械的特性を測定するために不可欠です。
- AFMカンチレバーへの確実な共有結合のための信頼性の高いプロトコルが正確な測定のために必要です。
- 有機溶液の取り扱いには安全対策が重要です。
- 適切な洗浄技術は汚染を避けるために重要です。
研究の目的
- AFMカンチレバーへのポリマーの共有結合の詳細なプロトコルを提供すること。
- ポリマーの物理的特性の測定における再現性を確保すること。
- その特性に関係なく様々なポリマーの研究を容易にすること。
使用された方法
- プラズマチャンバーを用いたAFMカンチレバーチップの表面活性化。
- 共有結合のためのポリマー溶液の調製。
- 適切な結合を確保するためのインキュベーションおよび洗浄プロトコル。
- AFMを用いた力拡張曲線の測定。
主要な結果
- PEG、ポリスチレン、およびポリニパムのAFMカンチレバーへの成功した共有結合。
- 力測定における再現性の実証。
- 機能化されたAFMカンチレバーの調製および使用のための包括的な方法の提供。
- 実験における洗浄およびコントロールチップの重要性の強調。
結論
- このプロトコルはAFMを用いたポリマー特性の信頼性の高い研究を可能にします。
- 適切な準備と取り扱いは成功した実験に不可欠です。
- 将来の応用は様々なポリマーの種類と構成に拡張できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Covalent single-molecule attachment enables reproducible force spectroscopy measurements critical for de-risking polymer-based therapeutic candidates. This approach provides quantitative mechanical and adhesive data that supports target validation and lead identification in stimuli-responsive drug delivery systems. By establishing reliable single-molecule benchmarks, the method enhances predictive confidence in preclinical model selection and portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of polymer-surface interactions to clarify binding mechanisms and functional target relevance.
- Operational Value: Provides hundreds of force-extension traces from a single molecule, reducing experimental variability and increasing data robustness.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by quantifying stretching and desorption forces under controlled stimuli, informing structure-property relationships.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative force-extension readouts (stretching force, desorption force, length) suitable for high-content polymer screening.
- Operational Value: Standardized covalent attachment and rinsing protocols ensure assay reproducibility across polymer types and experimental batches.
- Scalability: Functionalized AFM cantilevers can be stored and reused, enabling platform-wide deployment in discovery workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Force spectroscopy data from single molecules can be directly compared to molecular dynamics simulations, bridging scales for predictive modeling.
- Disease-Relevant Systems: Applicable to stimuli-responsive polymers (e.g., PEG, PNiPAM) used in drug delivery, enabling evaluation of temperature- or pH-dependent behavior.
- Preclinical De-risking: Measures desorption events under physiologically relevant conditions, supporting go/no-go decisions for formulation advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early polymer screening to preclinical formulation testing, providing mechanical property data that informs lead optimization and risk-adjusted advancement.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of polymer adhesion and mechanical stability in liquid environments, reducing mechanistic ambiguity.
- Screening: Delivers standardized, quantitative force measurements that enable reliable comparison of polymer candidates across libraries.
- Analytics: Outputs include force and length parameters derived from sigmoidal fitting of plateaus, enabling statistical comparison of polymer batches.
- Translational Research: Connects single-molecule behavior to bulk polymer performance, supporting continuity from discovery to preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Functionalized chips can be prepared in batches, stored at 4°C, and reused across projects, maximizing resource efficiency.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in polymer-surface interactions, increasing confidence in target validation assays.
- Operational Value: High reproducibility through controlled covalent attachment and rigorous rinsing minimizes false positives and experimental noise.
- Strategic Value: Enables data-driven go/no-go decisions in polymer selection, reducing late-stage formulation failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of polymer candidates based on quantified mechanical and adhesive profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in AFM operation, plasma surface treatment, and polymer solution handling.
- Needs plasma chamber, temperature-controlled incubator, solvent-resistant glassware, and AFM with liquid-cell capability.
- Demands standardization of rinsing protocols across teams to prevent capillary force artifacts and contamination.
- Must account for polymer-specific binding conditions (e.g., toluene vs. ethanol, incubation time/temperature) as outlined in the protocol.
- Practical limitation: Successful single-molecule interpretation depends on low surface density to avoid multi-molecule cascades in force traces.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:52
Surface Activation, Silanization, and PEGylation
3:03
Covalent Polymer Attachment
4:21
Determining the Inverse Optical Lever Sensitivity (InVOLS)
6:13
Determining the AFM Cantilever Force Constant
7:06
Data Collection
8:10
Results: Single-Molecule Stretching and Desorption
9:44
Conclusion
