模様の作成3D細胞培養のための2つの成分​​のために温度応答性ハイドロゲルリバース金型の印刷

この手順の全体的な目標は、リバースモールドをプリントして、3D細胞培養用のパターン化された2成分ハイドロゲルを作成することです。これは、最初に、摂氏4度の液体であるが、室温では柔らかいゲルである熱可逆性ポリマーからリバースモールドをプリントすることによって達成されます。この逆型は後で回避できます。

2番目のステップは、選択したバイオポリマーをリバースモールドに充填することです。ここではarosを使用しました。生体高分子は、酵素、UV、または温度架橋のいずれかによって架橋できます。

次に、逆型の型は、型を冷水に浸すことによって暗示されます。このステップの後、得られたAROS金型はさらなる処理の準備が整います。最後のステップは、細胞を含み、酵素、UV光、または温度によって架橋できる2番目の生体高分子で空隙を埋めることです。

最終的に、空間的に組織化されたD細胞培養用スキャフォールドを作成するための再現性のある方法を確立しました。この方法のアイデアを最初に思いついたのは、同僚がOxrを犠牲型として使用することで、Oxrの熱応答特性を活用できると提案したときでした。その手順を実演するのは、私の研究室の大学院生であるMisha Muahです。

まず、60ミリリットルの氷冷PBS溶液をガラス瓶に加え、マグネティックスターを使用して激しく攪拌します。次に、24.5グラムのPaul ERを量り、冷たいPBSに少量加えます。Paul OxrがPBSに部分的に溶解するまで待ってから、さらに追加します。

すべてのPaul Oxrが溶解するまで溶液を攪拌し続けます。次に、最終容量が100ミリリットルに達するまで氷冷PBSを追加し、容量あたりの重量が24.5%の最終濃度になります。次に、混合物がよく混ざるまで混合物をかき混ぜます。

溶液の攪拌を止め、溶液中の泡と泡が消えるまで摂氏4度で一晩休ませます。ゲル内に閉じ込められた気泡はプリンターカートリッジに移され、印刷された犠牲型に欠陥が生じます。滅菌 プレクールフィルターを使用して溶液を印刷カートリッジに直接ろ過し、針を詰まらせる可能性のある不要な粒子を取り除きます。

カートリッジは、実験の30分前まで摂氏4度で保管してください。電磁弁と針を超純水で満たした1.5ミリリットルの微小遠心チューブに別個に入れ、30分間シンジケートして印刷する準備をします。次に、洗浄したバルブをエタノールですすぎ、窒素ガンで乾燥させます。

次に、きれいな電磁弁と針をプリンターに取り付けます。また、空のクリーンプリントカートリッジを取り付けて、システムをテストします。システムに3バールの圧力を加え、取り付けたバルブとニードルから残留液体を圧縮空気で吹き飛ばします。

針径が小さい場合。圧縮空気の出口にフィルターを取り付けて、針を詰まらせる可能性のある小さな粒子の侵入を防ぎます。次に、圧力をオフにします。

圧力がゼロに下がったら、poly oxrがプリロードされたカートリッジを取り付けます。カートリッジを取り付ける約30分前にカートリッジを冷蔵庫から取り出して、まだ液体のpoly oxrが室温に達してゲル化してから印刷できるようにする必要があります。カートリッジを裏返して、poly oxrがゼリー状になっているかどうかを確認します。

次に、システムに3バールの圧力を加え、ポールエマーが針の先端に到達して連続したストランドに押し出されるまでディスペンスします。バイオCADソフトウェアを使用して、プリンターソフトウェアの設定メニューで印刷する構造とほぼ同じ長さの1本の線を引きます。パラメータセクションで電磁弁を50ヘルツの高周波に設定し、高圧設定を3バールに手動で調整します。

次に、ガラス顕微鏡をセットし、プリンターをスライドさせ、掃除機をオンにして所定の位置に固定します。次に、1 本の線の 1 つのレイヤーを、毎分 300 mm のステージ速度で印刷します。手動で圧力を減らし、新しいラインごとにソフトウェアの周波数設定を行うことで、目的のライン幅を取得し、ラインが連続したままであることを確認します。

引かれた線が破線になっている場合は、下限に達しています。目的の幅の連続ラインが達成されたら、印刷されたコンストラクトの欠陥をチェックして、最適なステージ速度と層の厚さを決定します。層の厚さを微調整するために、圧力と周波数もわずかに再調整する必要があるかもしれません。

レイヤーの厚さの設定をテストするには、複数のレイヤーを重ねて印刷し、針が前のレイヤーの上の正しい位置にあることを確認します。各レイヤーが前のレイヤーの上に直接印刷されるように、レイヤーの厚さを調整します。ステージ速度を最適化するには、まずステージ速度を毎分300ミリメートルから段階的に下げて、押し出しレイヤーが前のレイヤーと同じ位置で開始および終了するようにします。

ステージの動きが速すぎると、レイヤーの上部に波のようなパターンが表示されます。柱構造を印刷する場合は、CADソフトウェアで線ではなく1つの点を描画します。次に、圧力と周波数を微調整して、レイヤーの厚さとピラーの直径、およびプリントヘッドのステップ時間を調整し、印刷速度を最大化します。

最適化したら、後で使用するためにパラメータを保存します。まず、このピラー配列のような内部構造をガラス製の顕微鏡スライドに印刷し、乾燥させます。一晩乾燥すると、構造のサイズと厚さが縮小し、構造と基材との間の接着性が向上します。

翌日、避けて埋める予定の構造物を囲む外壁で構成される構造物を描きます。ポリマーの壁は、針の寸法のために、内部構造から少なくとも3.5ミリメートル離して印刷する必要があります。次に、完全に溶解したら電子レンジで加熱することにより、脱イオン水に1%アロスの混合物を準備します。

アグロ溶液を摂氏35度から45度に冷却します。次に、ピペットを使用して犠牲型にアグロ溶液を充填します。これは、壁の内側の構造の破壊を避けるためにゆっくりと行う必要があります。

充填したら、型を摂氏4度に置いてゲルを固めます。約10分後、冷蔵庫からゲルを取り出し、氷浴に10分間入れてポリマー構造を溶出させます。次に、構造物を慎重に取り外し、紙ティッシュで吸い取って残留水を取り除きます。

新しいガラス顕微鏡スライドに構造を慎重に押し付けて、3番目のヒドロゲルの漏れを防ぐ良好なシールを作成します。次に、0.15モルの塩化ナトリウムにアルギン酸メタクリレートの1%溶液を調製します。溶液をボルテックスして、アルギン酸メタクリレートを溶解します。

次に、ボリュームに 2.5%volume を追加します。Alexa、4 88共役フィブリノーゲン、および体積あたり0.05%の重量。リチウムフェニル2 4 6トリメチルベンゾイルホスフェートを使用して、蛍光を介して容易に視覚化できる第3のヒドロゲルを得る。

この溶液を30ゲージの針を備えた0.3ミリリットルの注射器に入れます。次に、シリンジを使用して、逃れたポリマーによって残された空隙を埋めます。各カラムから針を引くときにポリマーを排出して、各カラムを完全に充填してください。

最後に、注入されたポリマーを高強度UVランプで5分間光重合し、次いで落射蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を用いてコンストラクトをイメージングします。ここに示されているのは、ちょうど製造されたものと同様のコンストラクトの3Dザック再構築であり、埋め戻しに使用された蛍光標識されたアルギン酸塩です。柱の形状は緑色の柱として表示され、コンストラクトの外側部分は透明です。

このビデオで紹介する手法は、ここに示す同心円など、さまざまな 3D 配置に幅広く適応できます。分解能は針の直径に依存します。この設計に使用される直径150ミクロンの針は、直径120〜200ミクロンのストランドを生成できます。

このビデオを見た後、oxrの印刷に関連する手順をよく理解しているはずです。我々は、パターンハイドロゲルを作成するための犠牲型としてoxrの使用を実証しましたが、ポリマーの製造関連バージョンが使用されている場合、oxrはUV安定化することもできます。