Name: 高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-17T13:45:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: 学ぶ 高スループットスクリーニングによるMycobacterium tuberculosisの細胞内増殖測定法。siRNAや低分子化合物の影響を自動共焦点顕微鏡で定量化し、結核治療薬の探索や宿主細胞との相互作用解析に応用できます。

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この作業に対する財政的支援は、欧州共同体(ERC-STG INTRACELLTBグラントn°260901、MM4TBグラントn°260872)、アジェンス・ナショナル・ド・レシェルシュ、フェダー(12001407(D-AL)エクイペックス・イマジックス・バイオメッド)、および地域ノルド・パ・ド・カレーによって提供されました。私たちは、プラットフォームBICeLからガスパール・デロイソン、エリザベス・ヴェルクマイスター、アントニーノ・ボンジョヴァンニ、フランク・ラフォントの技術支援を感謝しています。

1. ハイスループットゲノムワイドsiRNAスクリーニング
緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するMtb H37Rvに感染したヒトII型気球モデルA549細胞系でスクリーニングを行う。この手順の概要は 、図 1Aに示します。
<ol><li>1x siRNAバッファーで保存されている乾燥したsiRNAライブラリ(96ウェルプレート)を4μMの濃度に達し、その混合物の10μlを384ウェルの娘プレート(ドータープレート1)に移します。</li>
	<li>10 μlの1x siRNAバッファーを娘プレート1に加え、siRNAを2倍希釈します。siRNA再懸濁後、プレートは剥離可能なアルミニウムシールで密封され、少なくとも6ヶ月および2〜3年まで-20°Cで保存することができますが、貯蔵時間はsiRNAライブラリメーカーの推奨によって異なる場合があります。</li>
	<li>娘プレート1のsiRNAを娘プレート2に希釈し、500nMの濃度に達した。siRNA再懸濁後、プレートは剥離可能なアルミニウムシールで密封され、少なくとも6ヶ月および2〜3年まで-20°Cで保存することができますが、貯蔵時間はsiRNAライブラリメーカーの推奨によって異なる場合があります。</li>
	<li>使用前に、室温で娘プレート2を解凍する。</li>
	<li>2.5 μlのsiRNAを娘プレート2から取り出し、384ウェルアッセイプレートに入れる。</li>
	<li>ステップ1.5の同じ384ウェルアッセイプレートで、2.5 μlの陰性および正のコントロールsiRNAをそれぞれのウェルに加えます。</li>
	<li>トランスフェクション試薬を1x D-PBSで希釈して、各ウェルに0.1μlトランスフェクション試薬を提供するのに十分な溶液を得て、希釈トランスフェクション溶液を室温で5分間前キューバ化します。</li>
	<li>トランスフェクション試薬/PBS溶液混合物をアッセイプレートの各ウェルに7.5 μl添加し、室温で30分間インキュベートします。</li>
	<li>10%のウシ胎児血清(FBS)を添加したRPMI 1640培地に懸濁したA549細胞(1,500細胞/ウェル)の40 μlを加えます。5%CO2を含む雰囲気中で37°Cで3日間培養期間の細胞を維持する。これらの細胞は24時間ごとに分裂し、したがって約12,000個の細胞がトランスフェクションの3日後にウェル内にある。</li>
	<li>2週間前のGFP発現 Mtb H37Rv培養物をD-PBS(MgCl2 およびCaCl2から無料)で4,000 x gで5分間遠心して洗浄を廃棄します。このステップを 3x. 繰り返します(GFP-Mtb H37Rv カルチャ条件の場合はプロトコル 3 を参照してください)。</li>
	<li>10%FBSを添加したRPMI 1640培地の10mlで細菌ペレットを懸濁し、室温で1時間デカントして、細菌凝集体を堆積物にできるようにします。</li>
	<li>細菌の上清を収集し、測定OD600(OD 600 は0.6-0.8の間でなければならない)とGFP-蛍光(RFU値)をマイクロプレートリーダーを使用して細菌の濃度を決定します。同じ条件で調製された別の培養物に対して実験前に生成されたRFU値=f(CFU値)を表示する参照回帰線を用いて懸濁液の力価を算出する。感染の多重度(MOI)5に対応する2.4 x 106 個の細菌/mlを含む細菌懸濁液を調製します。</li>
	<li>384ウェルアッセイプレート内の培地を取り出し、25μlの新たに調製した細菌懸濁液を加えます。</li>
	<li>384ウェルアッセイプレートを5%CO2を含む雰囲気で5時間37°Cでインキュベートする。</li>
	<li>培地を取り出し、10%FBS 3xを添加したRPMI培地で細胞を静かに洗います。</li>
	<li>残りの細胞外細菌を殺すために、5%CO2を含む大気中で、50μg/mlのアミカシンを含む50μlの新鮮なRPMI-FBS培地を37°Cで1時間処理する。</li>
	<li>培地含有アミカシンを取り出し、10%FBSを添加した新鮮なRPMI培地を50μl加えます。384ウェルアッセイプレートを5%CO2を含む雰囲気で5日間、37°Cでインキュベートする。</li>
	<li>画像取得前に、PBSで作りたての30μg/mlのDAPI(最終濃度5μg/ml)を10 μl加え、37°Cで10分間インキュベートします。</li>
	<li>プレートを自動共焦点顕微鏡に積み込みます。 <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_1highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a></li>
	<li>露出パラメータを設定します。放出フィルター520 nmを用いた励起レーザー450nmおよびGFP蛍光を用いた励起レーザー405 nmを用いたDAPI蛍光を記録する。 <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a></li>
	<li>取得する各ウェルのウェルとフィールドを選択し、レイアウトパラメータとサブレイアウトパラメータと呼びます。 <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a></li>
	<li>手順 1.20 および 1.21 のパラメータを使用して実験ファイルを生成し、自動取得を実行します。 <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a></li>
	<li>リモート サーバーにイメージを転送します。 <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_5highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a></li>
	<li>画像解析ソフトウェアを使用して画像を評価します。ピクセル強度特性アルゴリズムを用いて、核検出アルゴリズムとGFPチャンネルからの細菌領域を用いてDAPIチャネルから細胞核を検出する(図4A)。</li>
</ol>注: このプロトコルは、細胞内 Mtb 成長に対する遺伝子サイレンシングの効果を調べるように最適化されています。 Mtb は、最適な条件で20時間ごとに分割する低成長細菌です。感染後5日後、細胞外 Mtb の量は、細胞内のリシスがない場合にはまだ少なく、分析の質に影響を与えなかった。このプロトコルは、広範囲に放出され、新しい細胞に感染することができる マイコバクテリアススメグマティスや大腸菌 のような急速成長細菌を使用してsiRNAスクリーンに適応する抗生物質治療およびインキュベーション時間の長さの点で最適化されなければならない。
2. ハイスループット複合スクリーニング
Mtb H37Rv感染宿主細胞に対してスクリーニングを行った。この手順の概要は 図 1Bで説明しています。
<ol><li>DMSO 100%で可溶化した化合物ライブラリーを含む384ウェルのマザープレートを解凍する。10%FBSを添加したRPMI 1640培地10μlを含む384ウェルのドータープレートに0.5 μlの化合物を移します。</li>
	<li>2週間前のGFP発現 Mtb H37Rv培養物をD-PBS(MgCl2 およびCaCl2から無料)で4,000 x gで5分間遠心して洗浄を廃棄します。このステップ 3x を繰り返します(GFP-Mtb H37Rv カルチャ条件の場合は、プロトコル 3 を参照してください)。</li>
	<li>10%FBSを添加したRPMI 1640培地の10mlで細菌ペレットを懸濁し、室温で1時間デカントして、細菌凝集体を堆積物にできるようにします。</li>
	<li>細菌の上清を収集し、マイクロプレートリーダーを使用してOD600(OD 600は0.6-0.8の間でなければならない)とGFP蛍光(RFU値)を測定します。実験前に生成されたRFU値=f(CFU値)を表示する参照回帰線を用いて懸濁液の力価を計算する。典型的な濃度は1 x 108の細菌/mlである。</li>
	<li>収穫 6 日古い初代ヒトマクロファージRPMI 1640 培地で 10% ウシ胎児血清 (FBS) および 50 ng/ml 組み換えヒト M-CSF (ヒト末梢血単球細胞の精製およびマクロファージ分化についてはプロトコル 4 参照) を補充した。</li>
	<li>希釈した一次細胞を異なるMOIで、1〜5の範囲で、37°Cで2時間90rpmで軽度の揺れを伴う懸濁液でインキュベートする。</li>
	<li>感染した細胞を350xgで遠心分離して洗浄し、細胞外細菌を除去する。各遠心分離工程の後、10%FBSを添加したRPMI 1640培地中のペレットを再懸濁する。この手順を 2x 繰り返します。</li>
	<li>10%FBSとアミカシンを50 μg/mlで補充したRPMI 1640培地中の感染細胞を一時停止し、37°Cで1時間の軽い揺れを伴う懸濁液をインキュベートする。</li>
	<li>アミカシンを含む培地を350xgで遠心分離して除去し、10%FBSおよび50ng/ml組み換えヒトM-CSFを添加した完全なRPMI 1640培地で感染細胞を洗浄する。1 回繰り返します。</li>
	<li>ステップ2.1の同じアッセイプレートに40μlの感染マクロファージ懸濁液を加え、すでに10μlの化合物希釈液を含んでいる。各ウェルのDMSOの最終濃度は1%に達しました。</li>
	<li>5%CO2を含む雰囲気の中で37°Cで5日間アッセイプレートをインキュベートする。</li>
	<li>細胞透過性の遠赤色蛍光色素で生細胞を染色する。</li>
	<li>プレートを自動共焦点顕微鏡に積み込みます。 <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_1highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a></li>
	<li>露出パラメータを設定します。発光フィルター520 nmを用いた励起レーザー488nmを用いた発光フィルター690 nmおよびGFP蛍光を用いた励起レーザー640 nmを用いた極赤色蛍光を記録する。 <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-1highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_2-2highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a></li>
	<li>取得する各ウェルのウェルとフィールドを選択し、レイアウトパラメータとサブレイアウトパラメータと呼びます。 <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-1highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_3-2highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a></li>
	<li>手順 2.14 および 2.15 のパラメータを使用して実験ファイルを生成し、自動取得を実行します。 <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-1highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a> <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_4-2highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a></li>
	<li>リモート サーバーにイメージを転送します。 <img fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51114/screenshot_5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51114/screenshot_5highres.jpg" target="_blank">ここをクリックすると、より大きな画像が表示されます。</a></li>
	<li>画像解析ソフトウェアを使用して画像を評価します。ピクセル強度特性アルゴリズムを使用して、GFPチャンネルから、ピクセル強度特性アルゴリズムと細菌領域を用いて遠赤色チャネルから細胞領域を検出する(図4B)。</li>
</ol>注:このプロトコルは、蛍光タンパク質を発現する変異体(1つのウェル/ワン変異体)によって化合物を置換することによってMtb変異ライブラリースクリーニングに適応することができる(図1C、Brodinらも参照)。4)蛍光変異体は、まずウェル(ウェルあたり20μlの細菌懸濁液)に播種される。細菌は、その後、細胞懸濁液の30 μlによって回収されます。350xgで1分間遠心分離した後、プレートを5%CO2を含む雰囲気中で37°Cでインキュベートする。インキュベーション時間とMOIはアッセイに依存します。例として、ファゴソーム酸性化などの初期の細胞事象を可視化するために、細胞は1〜20の範囲のMOIで2時間感染することができる。リソソームは、5%CO2を含む雰囲気の中で37°Cで1.5時間2μMのリソトラッカー色素を使用して染色され、10%ホルマリンまたは4%パラホルムアルデヒド(PFA)で固定されます。共焦点画像は、リソソーム検出および細胞内局在化のための適切なアルゴリズムを特徴とする画像解析スクリプトを用いて取得し、最終的に解析される。
3. 緑色蛍光タンパク質結核菌H37Rv(GFP-H37Rv)の培養条件を発現
長期保存のために、GFP-H37RvはD-PBSで凍結した(バイアルあたり約1 x 108 マイコバクテリア)。
<ol><li>ミドルブルックOADC濃縮10%、グリセロール0.5%、Tween-80 0.05%、ハイグロマイシンB(50μg/ml)を添加した7H9スープ培地50mlを含むエルレンマイヤーフラスコ中のGFP-H37Rvの冷凍在庫バイアルを再懸濁します。</li>
	<li>37°Cで8日間インキュベートする。</li>
	<li>GFP-H37Rv培養のOD600 を測定する。</li>
	<li>GFP-H37Rv培養液を希釈して、ミドルブルックOADC濃縮10%、 グリセロール0.5%、Tween-80 0.05%、ハイグロマイシンB(50μg/ml)を添加した新鮮な7H9ブロス培地でOD 600=0.1を得る。</li>
	<li>GFP-H37Rvを37°Cで8日間インキュベートしてから、アッセイに使用してください。</li>
</ol>4. 全血またはバフィーコート調製からのヒト末梢血単球細胞精製
<ol><li>1%FBSを含む1x D-PBS(MgCl 2およびCaCl2から解放)で血液ポーチ2xを希釈します。</li>
	<li>400 x g で Ficoll 密度勾配遠心分離により 20 分間、単球を分離します。</li>
	<li>単球を収集します。</li>
	<li>1x D-PBS(MgCl2 およびCaCl2から自由)で1%FBSを含む1%FBSを室温で10分間400xgで遠心分離して、単球3xを洗浄します。</li>
	<li>細胞を1 x 107の細胞 /mlまで濃縮します。</li>
	<li>メーカーのプロトコルに従ってCD14磁気ビーズを使用して単球を精製します(材料を参照)。</li>
	<li>CD14-単球精製後、細胞を1.5 x 106細胞/ml RPMI 1640で播種し、10%FBSおよび40ng/mlのヒトマクロファージコロニー刺激因子(hM-CSF)を補い、5%CO2を含む雰囲気で37°Cで4日間インキュベートした。</li>
	<li>4日後、培地を新鮮なRPMI 1640で交換し、10%FBSと40ng/mlのhM-CSFで補い、5%CO2を含む雰囲気中で37°Cで2日間インキュベートした。</li>
	<li>6日後、細胞はアッセイに使用することができる。</li>
</ol>

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</ol>

利益相反は宣言されていません。

ここでは、蛍光標識された宿主細胞に感染するためにGFP発現 Mtb H37Rv株を用いた表現型アッセイに必要な方法を説明し、高含有量/ハイスループットスクリーンに適しています。このプロトコルは、広範囲の化合物、蛍光プローブおよび Mtb 変異体に適用することができる。上述した各プロトコルについて、画像取得前に固定および免疫標識のステップを行うことができた。20X(NA 0.70)または60X(NA1.2)の水レンズを搭載した自動蛍光共焦点顕微鏡を使用して画像を取得します。共焦点顕微鏡は405、488、561および640 nmの励磁レーザーが装備されている。放出された蛍光は450-690 nmの範囲の検出波長をカバーするフィルターのセットに関連付けられる3つのカメラを使用して捕獲される。顕微鏡の励起と発光の設定の調整は、各実験で使用される染料または蛍光色素の種類によって異なることを注意することが重要です。表現型アッセイの場合、DAPIまたはHoechstは核を染色するために10分間5μg/mlで一般的に使用されます。しかし、細胞は、細胞質、膜または細胞骨格の検出に特異的な異なる蛍光色素で染色することもで...

過去数年間に報告された新興および再興性感染病原体の中で、結核菌(Mtb)は、2011年に140万人の死亡と870万人の新しい感染症の原因となる著名な場所を保持しています(世界結核レポート2012、www.who.int/topics/tuberculosis/en/)。多剤療法の利用可能性にもかかわらず、感染者数は依然として増加しており、多剤耐性(MDR)ならびに広範囲に薬剤耐性(XDR)Mtbは急速に世界中に広がっている1。また、Mtb抗原の存在を考慮すると、全世界の人口の3分の1がMtbによって潜感染していると考えられることは明らかである。したがって、Mtbと戦う新しい手段が緊急に必要とされています。この文脈で、我々は、自動共焦点蛍光顕微鏡3によるMtbの浸潤および増殖を宿主細胞に監視することに頼るインビトロ視覚表現型アッセイを開発した。384ウェルマイクロタイタープレートでのアッセイの適応は、自動画像取得および分析と組み合わせて、化合物、siRNAおよび細菌変異体の中規模ライブラリーの高含有量/ハイスループットスクリーニング(HC/HTS)を可能にした。この表現型アッセイに関するゲノムワイドRNAiライブラリのスクリーニングにより、Mtb人身売買や細胞内複製に関与する主要な宿主因子の同定が可能になっただけでなく、結核菌によって悪用される宿主経路の解明も可能になった。この特定の表現形学アッセイのもう一つの適応は、Mtbの食前体内持続性に不可欠な細菌因子の同定であった。例えば、ファゴソーム成熟の逮捕は、マクロファージにおけるMtbの生存および複製を促進する主要なメカニズムの1つと考えられている。蛍光標識酸性コンパートメントにおけるMtbノックアウト変異体の細胞内局在のモニタリングにより、生存プロセス4に関与する細菌遺伝子の同定が可能となった。最後に、Mtbの高含有イメージングは、細胞内細菌増殖などの様々な現象を阻害するための薬剤効率を定量化する優れた方法も提供する3。全体として、このタイプの高スループット表現型アッセイは、結核に対する創薬を加速することを可能にし、これらの異なるアプローチによって収集されたデータは、Mtbによって行われるホスト操作のより良い理解に寄与する。

<table><tbody><tr><td>&マイクロ;クリアプレートブラック、384ウェル</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781091</td><td>127.8/86/15 MM 蓋付き、TC処理</td></tr><tr><td>CellCarrier 384ウェルプレート</td><td>PerkinElmer</td><td>6007550</td><td>ブラック、クリアボトム、蓋付き、TC処理</td></tr><tr><td>Vボトムホワイト、384ウェルプレート</td><td>Greiner Bio-One</td><td>781280</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>シーリングテープ、通気性、滅菌</td><td>Corning</td><td>3345</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>リポフェクタミン RNAiMax</td><td>Life Technologies</td><td>13778150</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシ</td>ド <td>Sigma-Aldrich</td><td>34943</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 + GlutaMAX-I</td><td>Life Technologies</td><td>61870-010</td><td>細胞培養培地</td></tr><tr><td>D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2</td><td>Life Technologies</td><td>14190-094</td><td>ダルベッコ&#039;リン酸塩基</td></tr><tr><td>バッファーD-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2</td><td>Life Technologies</td><td>14190-091</td><td>Dulbecco&#039;リン酸塩分緩衝液</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ライフテクノロジー</td><td>ズ2610040-79</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Ficoll Paque PLUS</td><td>Dutscher</td><td>17-1440-03</td><td>Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells Purification</td></tr><tr><td>CD14 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi</td><td>130-050-201</td><td>Purification of CD14+ Monocytes</td></tr><tr><td>Human M-CSF, premium gr. (1000 &mu;g)</td><td>Miltenyi</td><td>130-096-493</td><td>マクロファージコロニー刺激因子</td></tr><tr><td>LSカラム</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td>CD14+単球単離用カラム</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Euromedex</td><td>2002-A</td><td>マイコバクテリア培養</td></tr><tr><td>グリセロール高純度&nbsp;</td><td>Euromedex</td><td>50405-EX</td><td>マイコバクテリア培養</td></tr><tr><td>&nbsp;ミドルブルックOADC濃縮</td><td>ベクトン・ディキンソン</td><td>211886</td><td>マイコバクテリア培養</td></tr><tr><td>7H9</td>ベ<td>クトン・ディキンソン</td><td>W1701P</td><td>マイコバクテリア培養</td></tr><tr><td>Versene 1x</td><td>Life Technologies</td><td>15040033</td><td>非酵素的細胞解離溶液</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td>核<td>色素</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>核色素</td></tr><tr><td>Syto60</td><td>Life Technologies</td><td>S11342</td><td>核/細胞質色素</td></tr><tr><td>ホルマリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5014</td><td>細胞固定液</td></tr><tr><td>siRNA 標的 Dectin-1</td><td>Santa-Cruz</td><td>sc-63276</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>*siGenome* ノンターゲットsiRNAプール&nbsp;</td><td>ダルマコン</td><td>D-001206-14</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>リファンピシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>イソニアジド (INH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I3377-50G</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>ハイグロマイシン B</td><td>ライフ テクノロジー</td><td>ズ 10687-010</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>アミカシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1774</td><td>抗生物質</td></tr><tr><td>全米共焦点顕微鏡 OPERA</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>画像取得</td></tr><tr><td>コロンバス 2.3.1 サーバー データベース</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>データ転送、保存、分析</td></tr><tr><td>アカペラ 2.6 ソフトウェア</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>画像ベースの分析</td></tr><tr><td>GraphPad Prism5 ソフトウェア</td><td>GraphPad</td><td></td><td>統計分析</td></tr><tr><td>Excel 2010</td><td>マイクロソフト</td><td></td><td>統計分析</td></tr></tbody></table>

高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

治療とワクチンが利用できるにもかかわらず、結核(TB)は世界で最も致命的で広範囲にわたる細菌感染症の1つです。数十年以来、多剤および広範囲に薬剤耐性株の突然のバーストは、結核の制御のための深刻な脅威です。そのため、結核の原因 物質である結核 菌(Mtb)にとって重要な新しい標的や経路を特定し、結核薬となりうる新しい化学物質を探ることが不可欠です。1つのアプローチは、干し草の山で針の検索を可能にする大規模なライブラリの遺伝的および化学的スクリーンに適した方法を設定することです。そのために、自動共焦点顕微鏡を用いて蛍光標識された宿主細胞内で蛍光標識 Mtb を検出することに頼る表現型アッセイを開発しました。この インビトロ アッセイは 、Mtbのホストへのコロニー形成プロセスの画像ベースの定量化を可能にし、siRNA-、化学化合物、または Mtb 変異体ライブラリのスクリーンに適した384ウェルマイクロプレート形式に最適化されました。その後、画像はマルチパラメトリック分析のために処理され、宿主細胞内の Mtbの病因に関する読み取り結果を提供します。

ハイスループットゲノムワイドsiRNAスクリーニング
Mtb は、他のいくつかの肺上皮細胞と同様 に、インビトロで 免疫細胞を植民地化することができる。例えば 、Mtbは、ヒトII型肺球5-7のモデルとして一般的に使用されているA549上皮細胞に感染し、損傷を与えることができる。Dectin-1は 、Mtb 取り込み、A549細胞における細胞内抗菌増殖に対する炎症反応および抗菌作用に関与する宿主細胞受容体として報告された。プロトコル1に記載されたsiRNA条件は、サイレンシング効率の85%につながった(データは示さなかった)。siRNAによるデクチン-1発現のサイレンシングは、A549細胞における細胞内マイコバクテリア量の減少につながった。実際、3日間のサイレンシングと5日間の感染後、非標的スクランブルsiRNAをトランスフェクトした細胞と比較して、1デクチン-1のA549細胞で感染細胞の割合が2回減少する(図2A および ...

ここでは、小干渉合成RNA(siRNA)、化学化合物、および 結核 菌変異体ライブラリーのハイスループット/高含有スクリーンに適用可能な表現型アッセイについて述べている。この方法は、自動共焦点顕微鏡を用いた蛍光標識された宿主細胞内の蛍光標識型 結核 の検出に依存している。

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

この手順の全体的な目的は、ホスト遺伝子のサイレンシングなどの表現型モジュレーターや、低分子化合物の影響が、結核菌（mycobacterium tuberculosis）の細胞内複製に及ぼす効果を測定することです。まず、低分子化合物を384ウェルプレートに分注するか、あるいはsiRNAを細胞に導入してトランスフェクション複合体を形成させることでこれを達成します。次のステップとして、緑色蛍光タンパク質を発現する結核菌（GFP-Mtb）を細胞に感染させ、これらの細胞を低分子化合物を含むウェルに添加し、マイクロプレートを5日間インキュベートします。RNAiアプローチでは、RNAiトランスフェクション複合体を含むウェルに細胞を添加します。マイクロプレートを3日間インキュベートした後、G-F-P-M-T-Bを発現するmycobacterium tuberculosisを細胞に感染させます。細胞を染色した後、最終ステップとして自動共焦点顕微鏡を用いてプレートを読み取ります。最終的に、自動蛍光顕微鏡観察とそれに続く画像ベースの解析を用いて、G-F-P-M-T-Vの細胞内増殖の変化を測定します。コロニー形成単位（CFU）の計測などの既存の手法と比較して、この手法の主な利点は、長い培養期間を省くことができ、スループットを向上させられる点にあります。この手順のデモンストレーションは、Christophe KevalまたはSONGと、私の研究チームの博士研究員3名が担当します。siRNAライブラリースクリーニングおよび化合物ライブラリースクリーニングのプロトコルでは、GFPを発現する培養2週目のMYCOBACTERIUM tuberculosis H 37 RV培養物を使用します。GFP-MTB菌懸濁液を調製するには、まず培養物を4,000 ×gで5分間遠心分離し、上清を捨てます。培養物をDPBSで再懸濁し、同様の手順で再度遠心分離します。培養物をDPBSで3回洗浄します。3回目の洗浄後、上清を廃棄し、細菌ペレットを10% FBS含有RPMI 1640培地10 millilitersで再懸濁します。細菌凝集体を沈殿させるため、懸濁液を室温で1時間放置します。細菌上清を回収し、600 nanometersにおけるODおよびGFP蛍光を測定します。マイクロプレートリーダーを用いて細菌濃度を測定し、600 nmにおけるOD値を0.6から0.8の間に調整します。同一条件で調製した別の培養液を用いて実験前に作成した、CFU値の関数としてRFU値を表示する参照回帰線に基づき、懸濁液のタイターを算出します。一般的な濃度は1×10⁸ bacteria/mLです。96ウェルマザープレートに保存されている乾燥siRNAライブラリーを1x siRNAバッファーで再懸濁し、濃度を2 µMにします。この混合液10 µLを384ウェルドータープレートの各ウェルに分注します。次に、ドータープレートの各ウェルから2.5 µLのsiRNAを384ウェルアッセイプレートの各ウェルに分注します。陰性コントロールおよび陽性コントロールのiRNAを、それぞれ対応するウェルに2.5 µLずつ添加します。ドータープレートをすぐに使用しない場合は、剥離可能なアルミシールで密封してください。密封したプレートは-20 °Cで保存でき、iRNAの種類によっては少なくとも6か月間、場合によっては2～3年まで保存可能です。ライブラリー製造元の推奨事項に従います。トランスフェクション試薬を1X DPBSで希釈し、各ウェルに0.1 µLずつ分注できる十分な量の溶液を調製します。希釈したトランスフェクション溶液を室温で5分間プレインキュベートします。希釈したトランスフェクション溶液7.5 µLを、10%胎児牛血清を添加したRPMI 1640培地に懸濁したヒト2型肺胞上皮細胞 A549細胞 40 µLが入った384ウェルアッセイプレートの各ウェルに加え、室温で30分間インキュベートします。その後、細胞を5%二酸化炭素含有雰囲気下、37 °Cで3日間培養します。これらの細胞は24時間ごとに分裂するため、トランスフェクションの3日後には各ウェルに約12,000個の細胞が存在することになります。A549細胞にsiRNAを導入して3日後、既述の方法に従い、MTBH 37 RV GFP細菌懸濁液を調製します。懸濁液は1 mLあたり2.4 × 10⁶個の細菌を含むようにし、これは感染多重度（MOI）5に相当します。384ウェルアッセイプレート内の培地を除去し、1ウェルあたり25 µLの細菌懸濁液を添加します。384ウェルアッセイプレートを、5% CO₂含有雰囲気下、37 °Cで5時間インキュベートします。5時間後。培地を除去し、細胞に残存する細胞外細菌を死滅させるため、10% FBSを添加したRPMI培地で細胞を3回緩やかに洗浄します。各ウェルの細胞に50 µLを投与します。50 µg/mLのアミカシンを含む新鮮なRPMI-FBS培地を用います。5% CO₂雰囲気下、37 °Cで1時間インキュベートします。最後に、アミカシンを含む培地を除去し、10% FBSを添加した新鮮なRPMI培地を1ウェルあたり50 µL加えます。共焦点顕微鏡によるスクリーニングの前に、アッセイプレートを5%二酸化炭素含有雰囲気下、37 °Cで5日間インキュベートします。この手順を開始するには、100% DMSOで溶解した化合物ライブラリーを含む384ウェルマザープレートを室温で融解し、マザープレートから0.5 µLの化合物を、10% FBSを添加したRPMI 1640培地を1ウェルあたり10 µL含む384ウェルドータープレートに分注します。次に、6日齢のヒト初代マクロファージを、RPMI 1640中で4 × 10⁵ cells/mLの密度で回収します。10% FPSおよび50 ng/mLのリコンビナントヒトMCSFを添加した培地を用います。希釈した一次細胞を、1から5の異なるMOIの範囲で菌液とともに懸濁し、37 °Cで90 RPMの緩やかな振盪条件下で2時間インキュベートします。遠心分離（350 ×g、5分間）により感染細胞を洗浄し、細胞外の細菌を除去します。RPMI 1640培地（10% FPS添加）でペレットを再懸濁し、遠心分離します。この操作を繰り返し、最終洗浄後、さらに2回洗浄します。感染細胞を、10% FBSおよび50 µg/mLのアミカシンを添加したRPMI 1640培地で再懸濁します。この懸濁液を37 °Cで1時間、緩やかに振盪しながらインキュベートし、350 ×gで5分間遠心分離します。アミカシンを含む培地を除去し、完全RPMI 1640で感染細胞を洗浄します。10% FBSおよび50 ng/mLのリコンビナントヒトMCSFを添加した培地。この洗浄を1回繰り返す。あらかじめ準備し、化合物の希釈液を10 µLずつ分注してある384ウェルアッセイプレートに、感染マクロファージ懸濁液を1ウェルあたり40 µLずつ加えます。これにより、各ウェルの最終DMSO濃度は1%になります。siRNAライブラリーの共焦点顕微鏡スクリーニングを行う前に、アッセイプレートを5% CO2含有雰囲気下、37 °Cで5日間インキュベートします。画像取得前のスクリーニングとして、PBSで調製した新鮮な30 µg/mL DPIを各ウェルに10 µLずつ加え、37 °Cで10分間インキュベートします。化合物スクリーニングでは、画像取得の前に、細胞透過性遠赤色蛍光染料を用いて生細胞を37 °Cで30分間染色します。アッセイプレートを自動共焦点顕微鏡にロードします。露光パラメータを設定し、励起レーザー 405 nm、放出フィルター 450 nmを用いてDPI蛍光を記録します。励起波長488 nmのレーザーを用い、透過波長520 nmのエミッションフィルターを使用してGFP蛍光を記録します。取得対象となるウェルと各ウェル内の視野を選択し、これらをそれぞれレイアウトおよびサブレイアウトとして設定します。設定したパラメータに基づいて実験ファイルを作成し、自動取得を実行します。本ケースでは、同一のウェルおよび視野から4枚の異なる画像を記録し、それらの画像をリモートサーバーに転送します。その後、siRNAスクリーニングのため、acapella 2.6画像解析ソフトウェアを用いて画像を評価します。各視野には2つのチャンネル（色）が含まれています。緑色が細菌、青色が細胞を示しています。「Nuclei」は、核検出アルゴリズムを用いてDAPIチャンネルから細胞核を検出し、画素強度の特性アルゴリズムを用いてGFPチャンネルから細菌領域を検出します。チャンネルを統合し、細菌と細胞の両方に共有される画素数をカウントすることで、細胞内細菌を定量化します。4つの視野の平均として算出される最終結果は、総細菌面積、総細胞数、感染細胞の割合、および細胞あたりの細菌面積である。化合物スクリーニングにおいて、各視野は2つのチャンネル（色）で構成され、細菌は緑色、細胞は遠赤色で表示される。ピクセル強度特性アルゴリズムを用い、遠赤色チャンネルから細胞面積を、GFPチャンネルから細菌面積を検出して、核と細胞質を特定する。チャンネルを統合し、細菌と核の両方に共有されるピクセル数をカウントすることで、細胞内細菌を定量化します。4つの視野の平均として算出される最終的な結果は、細菌の総面積、細胞の総面積、細胞内細菌の総面積、および細胞の総面積に対する細胞内細菌面積の比率です。ハイスループット・ゲノムワイドsiRNAスクリーニングの代表的な結果をここに示します。siRNAを用いてdin1の発現を抑制したところ、5 49細胞における細胞内マイコバクテリア量が減少しました。非標的iRNAまたはdinone特異的siRNAを導入し、GFP発現MTBを5日間感染させた5 49細胞の代表的な共焦点画像に示されているように、GFP MTB H37Rvは緑色で、細胞は赤色で可視化されました。細胞数および細胞内GFP-MTB H37Rv負荷量は、画像解析ソフトウェアを用いて決定されました。このグラフは、青色の円で示されたscramble siRNAの5つの反復試行と、赤色の円で示されたdin one siRNAにおける、感染したa 5 49細胞の割合を示しています。サイレンシングから3日後、感染から5日後において、din oneをサイレンシングしたa 5 49細胞の感染細胞率は、非標的のscramble siRNAをトランスフェクションした細胞と比較して半分に減少しています。Zスコアを定義するために、scrambleと比較したDIN one標的siRNAのサンプルベースの正規化が適用されました。標的とするDIN1のsiRNAにおいて、Zスコアの平均は約-15でした。アスタリスク3つは、P値が0.0001未満であることを示しています。これらの結果は、ハイスループット化合物スクリーニングにおいて、DIN1のshRNAと同等の表現型を示すMTB定着および肺胞細胞に関与する他の新規宿主因子を探索するためのスクリーニングにおいて、DIN1を陽性対照として使用できることを示しています。細胞内細菌の増殖に対する化合物の効率は、線量反応曲線（DRC）を作成し、陽性および陰性の参照化合物に対して正規化することで評価した。本例では、GFP発現MTB H37Rv株に感染させたヒト一次マクロファージを、陰性対照として1% DMSOで、または2つの参照化合物であるイソニアジド（INH）およびリファンピシン（RIF）の濃度を段階的に上げて培養した。マクロファージは赤色蛍光染料で標識されており、緑色はMTBを示す。感染したヒトマクロファージの共焦点蛍光画像の解析により、活性化合物が宿主細胞内でのMTBの複製に影響を与え、マイコバクテリア量（細胞内のGFPシグナルの面積に相当）の減少をもたらすことが明らかになった。細胞内細菌領域と全細胞領域の比率を算出し、化合物濃度の関数としてプロットしてDRCを作成しました。ここに示されているのは、各グラフにおけるisidおよびリファンピシンのDRCです。化合物のDRCは、陰性対照である1%DMSOおよび陽性対照である0.1 micrograms per milliliterのisidに対して正規化されました。これらの曲線により、細菌のコロニー形成を50%抑制するために必要な濃度と、細菌の複製を99%抑制するために必要な最小濃度の両方を決定することが可能です。本手法は合計10時間で完了でき、内訳は以下の通りです。細胞のトランスフェクションまたは化合物の調製に2時間、細胞への感染およびマイクロプレートへの分注に6時間、そして画像取得の維持に2時間を要します。これらを8日間にわたって行います。結核菌（mycobacterium tuberculosis）の取り扱いは極めて危険であるため、本手順の実施に際しては、マスクを含む個人用保護具の着用などの予防措置を常に講じることを忘れないでください。

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高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

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