高スループット/高含有スクリーニングに適応した細胞内マイコバクテリアの定量化のための顕微鏡表現型アッセイ

この手順の全体的な目標は、宿主遺伝子のサイレンシングなどの表現型モジュレーターの影響、または結核菌、細胞内複製に対する小分子の影響を測定することです。これは、最初に低分子と384ウェルプレートを分注するか、細胞をirnaでトランスセクトし、複合体にトランスフェクションすることで達成されます。次のステップは、結核菌またはG-F-P-M-T-Bを発現する緑色蛍光タンパク質を細胞に感染させ、低分子の含有ウェルに細胞を添加し、マイクロプレートを5日間インキュベートすることです。

RNAiアプローチでは、RNAiトランスフェクション複合体を含むウェルに細胞を添加します。マイクロプレートを3日間インキュベートした後、結核菌を発現するG-F-P-M-T-Bを細胞に感染させます。細胞を染色した後、最後のステップは、自動共焦点顕微鏡を使用してプレートを読み取ることです。

最終的には、自動蛍光顕微鏡法とそれに続く画像ベースの分析を使用して、G-F-P-M-T-Vの細胞内増殖の変化を測定します。コロニー形成ユニハンティングのような既存の方法のこの技術の主な利点は、長いインキュベーション期間を節約でき、より多くのスループットを可能にすることです。この手順を実証するのは、Christophe KevalまたはSONGと私の研究チームから3人のポスドクフェローです。

SI RNAライブラリースクリーニングおよび化合物ライブラリースクリーニングのプロトコルは、結核菌H 37 RV培養物を発現する2週間前のGFPを利用します。G-F-P-M-T-B細菌懸濁液を調製するには、まず4, 000Gで培養物を5分間遠心分離し、上清Resusを廃棄し、培養物をDPBSに懸濁し、この方法で再度遠心分離します。DPBSで培養物を3回洗浄します。

3回目の洗浄後、スーパーナートを廃棄し、RPMI 1640培地を含む10ミリリットルの10mLに細菌ペレットを再懸濁します。.懸濁液を室温で1時間放置して、細菌の凝集体を沈殿させます。細菌のスーパーナトを収集し、600ナノメートルのODとGFP蛍光を測定します。

マイクロプレートリーダーを使用して細菌濃度を測定すると、600ナノメートルでの外径は0.6〜0.8である必要があります。参照回帰直線を使用して懸濁液の力価を計算し、RFU値を同じ条件で調製された別の培養物での実験前に生成されたCFU値の関数として表示します。一般的な濃度は、1ミリリットルあたり10〜8個のバクテリアの1倍です。

この手順は、Resusが96に保存されている乾燥したSI RNAライブラリーを懸濁することから始めます。ウェルマザープレートは、2マイクロモルの濃度に1つのX-S-I-R-N-Aバッファーを備えています。混合物の10マイクロリットルを384ウェルドータープレートの各ウェルに移し、ドータープレートの各ウェルから2.5マイクロリットルのSI RNAを384ウェルアッセイプレートに同じアッセイプレートに移します。

ネガティブコントロールとポジティブコントロールIRNAをそれぞれ2.5マイクロリットルずつそれぞれのウェルに加えます。ドータープレートを使用しない場合は、すぐに剥がせるアルミシールで密封してください。密封されたプレートは、マイナス20°Cで少なくとも6ヶ月間、場合によってはIRNAによっては最大2〜3年間保管できます。

ライブラリの製造元の推奨事項。トランスフェクション試薬を1つのX-D-P-B-Sで希釈して調製し、それぞれに0.1マイクロリットルを提供するのに十分な溶液を生成します。希釈したトランスフェクション溶液を室温で5分間事前にインキュベートします。

希釈したトランスフェクション溶液7.5マイクロリットルを384ウェルアッセイプレートの各ウェルに加え、ヒト2型肺細胞、A 5 4 9細胞をRPMI 1640培地に懸濁し、10%ウシ胎児血清を添加したアッセイプレートの各ウェルに室温で30分間インキュベートします。5%の二酸化炭素を含む雰囲気で摂氏37度のインキュベーション期間3日間細胞を維持します。これらの細胞は24時間ごとに分裂するため、トランスフェクションの3日後には約12,000個の細胞が各ウェルに存在します。

siの3日後。5 49細胞のRNAトランスフェクションは、MTBH 37 RV GFP細菌懸濁液を調製します。前に示したように。

懸濁液は、1ミリリットルあたり10〜6個の細菌の2.4倍を含有すべきであり、これは5個の感染の多様性に対応する。384ウェルアッセイプレートの培地を取り出し、ウェルごとに25マイクロリットルの細菌懸濁液を追加します。384ウェルアッセイプレートを摂氏37度で、二酸化炭素5%を含む雰囲気中で5時間インキュベートします。

5時間後。培地を取り出し、10%FBSを添加したRPMI培地で細胞を3回優しく洗浄して、残りの細胞外細菌を死滅させます。各ウェルの細胞を50マイクロリットルで処理します。

アミカシンのミリリットルあたり50マイクログラムを含む新鮮なR-P-M-I-F-B-S培地。5%の二酸化炭素を含む雰囲気中で摂氏37度で1時間インキュベートします。最後に、アミカシンを含む培地を取り出し、10%FBSを添加した新鮮なRPMI培地を50マイクロリットル加えます。まぁ。

アッセイプレートを摂氏37度で5%二酸化炭素を含む雰囲気中で5日間インキュベートしてから、共焦点顕微鏡でスクリーニングします。この手順を開始するには、室温で100%DMSOに可溶化された化合物ライブラリーを含む384ウェルの母プレートを解凍し、母プレートから0.5マイクロリットルの化合物をRPMI 1640のウェルあたり10マイクロリットルを含む384ウェルの娘プレートに移します。10%FPSを添加した培地は、RPMI 1640のミリリットルあたり5細胞に10倍の4倍で6日齢の初代ヒトマクロファージを収穫します。

10%FPSと50ナノグラム/ミリリットルを補充したミディアム。組換えヒトMCSFは、希釈した初代細胞を1から5の異なるMOIの基底細胞とインキュベートし、懸濁液中で90RPMで37°Cで2時間軽度に振とうします。感染した細胞を350 GSで5分間遠心分離して洗浄し、細胞外細菌を除去します。

ResusはRPMI 1640でペレットを懸濁します。10%FPSと遠心分離機を添加した培地。再度、これを繰り返し、最後の洗浄後に2回洗浄します。

Resusは、10%FBSと50マイクログラム/ミリリットルを添加したRPMI 1640培地に感染細胞を懸濁します。アミカシンは、350GSの摂氏37度の遠心分離機で1時間、5分間、軽度の振とうで懸濁液をインキュベートします。アミカシンを含む培地を取り出し、感染した細胞を完全なRPMI 1640で洗浄します。

10%FBSとミリリットルあたり50ナノグラムを補充した培地。組換えヒトMCSF。この洗浄を一度繰り返します。

感染したマクロファージ懸濁液のウェルあたり40マイクロリットルを、以前に調製した同じ384ウェルアッセイプレートに加えます。これはすでに化合物の希釈液の10マイクロリットルを含んでいます。各ウェル中のDMSOの最終濃度は1%になりました5%二酸化炭素を含む雰囲気で37°Cでアッセイプレートを5日間インキュベートしてから、共焦点顕微鏡でSI RNAライブラリをスクリーニングします。画像取得に先立ってスクリーニングを行い、アッセイプレートの各ウェルに、新たに調製した30マイクログラム/ミリリットルDPIのPBS溶液を10マイクロリットル加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。

化合物スクリーニングの場合 画像取得の前に、細胞透過性の遠赤色蛍光色素で生細胞を37°Cで30分間染色します。アッセイプレートを自動共焦点顕微鏡にロードします。405ナノメートルの励起レーザーと450ナノメートルの発光フィルターを使用して、露出パラメータレコードDPI蛍光を設定します。

488ナノメートルの励起レーザーと520ナノメートルの蛍光フィルターを使用してGFP蛍光を記録します。取得する各ウェルのウェルとフィールドを選択します。これらは、レイアウトおよびサブレイアウトと呼ばれます。パラメータは、設定されたパラメータを使用して実験ファイルを生成し、自動取得を実行します。

この場合、同じ井戸とフィールドの4つの異なる画像が記録され、リモートサーバーに転送画像が転送されます。その後、SI RNAスクリーニング用の画像解析ソフトウェアacapella 2.6を使用して画像を評価します。各フィールドには、2 つのチャネルまたは色が含まれています。

緑はバクテリア、青は細胞です。核は、核検出アルゴリズムを使用してDAPIチャネルから細胞核を検出し、ピクセル強度特性アルゴリズムを使用してGFPチャネルから細菌領域を検出します。チャネルを統合し、細菌と細胞の両方が共有するピクセルの数をカウントすることにより、細胞内細菌が定量化されます。

4つのフィールドの平均として表される最終結果は、総細菌面積、総細胞数、感染細胞の割合、および細胞あたりの細菌面積です。化合物スクリーニングの場合、各フィールドには2つのチャネルまたは色が含まれ、細菌は緑、細胞は遠赤色です。核と細胞質は、ピクセル強度特性アルゴリズムを使用して、遠赤色チャネルから細胞領域を検出し、GFPチャネルから細菌領域を検出します。

チャネルをマージし、細菌と核の両方が共有するピクセル数をカウントすることにより、細胞内細菌が定量化されます。4つのフィールドの平均で表される最終結果は、全細菌面積、全細胞面積、細胞内細菌総面積、および細胞内細菌面積と細胞総面積の比率です。ここでは、ハイスループットのゲノムワイドSI RNAスクリーニングの代表的な結果を示し、SI RNAによるdin ONEの発現をサイレンシングすると、5 49細胞の細胞内マイコバクテリア量が減少しました。

これらの代表的な共焦点画像に示されているように、非標的IRNAまたはdin1に特異的なSI RNAをトランスフェクトし、MTBを発現するGFPに5日間感染した5 49細胞の共焦点画像。GFP MT BH 37 RVは緑で、セルは赤で視覚化されました。細胞数と細胞内G-F-P-M-T-B-H 37 RV負荷は、画像ベースの解析ソフトウェアを使用して決定しました。

このグラフは、青い円で表されるスクランブルIRNAと赤い円で表される1つのIRNAの5回の複製における5 49細胞の感染率を示しています。3日間のサイレンシングと5日間の感染の後、感染細胞の割合は、非標的スクランブルIRNAでトランスフェクションされた細胞と比較して、5 49個の細胞をサイレンシングした1個で半分に減少します。SI RNAを標的とするDINの1つのサンプルベースの標準化をスクランブルと比較して適用し、Zスコアを定義しました。

Zスコアの平均は負の15前後で、SIはターゲットのDINのものであった。3 つのアスタリスクは、0.0001 未満の P 値を表します。これらの結果は、DIN oneをsiのポジティブコントロールとして使用できることを示しており、MTBのコロニー形成に関与する他の新規宿主因子や、高含有量化合物のスクリーニングにおいてdins IRNAと同じ表現型を持つ可能性のある肺細胞を発見するためのスクリーニングとして利用できます。

細胞内細菌増殖に対する化合物効率は、用量反応曲線またはDRCを確立し、参照陽性および陰性化合物に正規化することによって評価されました。この例では、MTBH 37 RV株を発現するA GFPに感染したヒト初代マクロファージを、ネガティブコントロールとして1%DMSOとインキュベートするか、または2つの参照化合物、isid、INHおよびリファンピシンの濃度を上げてインキュベートしました。リフ。マクロファージは赤色の蛍光色素で標識され、緑色は感染したヒトマクロファージの共焦点蛍光画像のMTB分析により、活性化合物が宿主細胞でのMTBの細胞内複製に影響を与え、細胞内のGFPシグナルの領域に対応するマイコバクテリア負荷の減少につながることが明らかになりました。

細胞内細菌領域と全細胞領域の比率を計算し、化合物濃度の関数としてプロットしてDRCを生成しました。ここに示されているのは、各グラフのイシドとリファンピシンのDRCです。化合物のDRCは、ネガティブコントロールである1%DMSOとポジティブコントロールであるミリリットルあたり0.1マイクログラムに正規化されました。これらの曲線は、細菌のコロニー形成の50%を阻害するために必要な濃度と、細菌の複製の99%を阻害するために必要な最小濃度の両方を決定できるようにする。

これは、この手法を次のように分けて10時間、細胞トランスフェクションまたは化合物調製に2時間、細胞感染とマイクロプレートへの分注に6時間、画像取得の維持に2時間で行うことができます。これは8日間にわたって、結核菌との作業はアーティストとして非常に重要であり、マスクを含む個人用保護具を着用するなどの早熟な作業は、この手順を実行する際に常に行う必要があることを忘れないでください。