Name: 飛行性能の正確かつ迅速な測定のための改善された方法でのショウジョウバエ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: 学ぶ ショウジョウバエの飛行性能を迅速かつ正確に測定する方法。デジタルカメラと画像解析ソフトウェアを用いて着陸高度を定量化し、高スループットスクリーニングで遺伝子変異や神経変性を評価できます。

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この作品は、国立衛生研究所によってサポートされていましたF32 NS078958（DTB）とR01 AG033620（BG）が付与されます。

1。フライトテスターを組み立てる<ol><li>リングへの安全な飛行シリンダーチェーンクランプを使用して1スタンド。 （お皿の重量を量るためのシリンダーの下に約3cmのままにしておきます。） （注：我々が使用する飛行シリンダー13.5センチ、直径90センチです。） </li><li>飛行シリンダーの下にミネラルオイルの薄い層で、皿の重さに挿入します。 </li><li>リングへの安全な漏斗をリングクランプを使用して2スタンドとクランプ爪。漏斗の底が飛行シリンダーの上部と同じ高さになるように、漏斗の高さを調整します。 （注：漏斗の先端径は、バイアルが通過落下しないよう、ドロップチューブに入れ、バイアルの外径よりも小さくなければなりません。） </li><li>漏斗の上に落下管を挿入し、爪クランプを使って固定します。 （注：私たちは、長さ25cmで落下管を使用してこの高さから落下飛ぶ含有するバイアルに均一な力を持つすべてのハエの一貫したインク吐出が可能な落下管の内径はスライでなければなりません。バイアルが自由にドロップできるようにバイアルの外径よりもTLY大きくなります。） </li><li>適当な大きさにポリアクリルアミドシート（​​S）をカット。 （注：挿入したシートを除去することを助けるために、幅が飛行シリンダの内周面よりも僅かに小さくあるべきである）。 </li><li>シートにもつれトラップの薄い層を適用します。使用前に1時間放置することができます。 （注：挿入/除去のためのシートを把握することがコーティングされていないシート（約3cm）の上部と下部に十分な余地を残している） </li><li>飛行シリンダ内のポリアクリルアミドシートを挿入します。 </li><li>松のサポートブラケットを使用してカメラトラックを組み立てます。 （注：トラックの底部がレンズをブロックすることなく、カメラをサポートできることを確認してください。図1（b）参照。） </li><li>ストッパーを追加し、所定の位置にねじ込みます。 （注：場所をカメラがパノラマモードで、全体のプラスチックシートを表示することができます場所にストッパー。） </li></ol> 2。走行実験<ol> &lt;李&gt;試験しようとするハエのバイアルを収集します。最良の結果を得るには、せいぜい20ハエ/バイアルを使用しています。 </li><li>優しく落下管とリリースバイアル内に挿入して、抜いて、バイアルの底にハエをタップします。 （注：これは、狭い漏斗開口部に当たるまで、バイアルは、落下管に倒れバイアル漏斗に当たると、ハエは飛行シリンダー内に噴射される。） </li><li>空のバイアルを削除するには落下管を持ち上げます。 （注：同じテストグループのハエの複数のバイアルは、単一のポリアクリルアミドシートにアッセイすることができる私たちは、最大200ハエ（20ハエそれぞれの10バイアル）は一枚のシートでテストされ、容易に画像化することができることがわかります。。 </li><li>プラスチックシートを取り外し、平らな白い面に置きます。 （注：ベンチトップが暗色であれば白のポスターボードを使用することができる。） </li><li>プラスチックシートの上にカメラトラックを組み立てます。カメラは、視野内のシートの頂部および底部の両方を有するように、シートの上に十分に高くあるべきである。 </li><li>目に沿ってカメラをスライドさせます電子軌道のパノラマ画像を取得する「捕捉」ボタンを押したまま。 </li><li>油に着陸ハエの数は、各試験のために手動でカウントしてもよい。 </li><li>繰り返しは、指定された実験ではすべての条件のための2.2から2.7を繰り返します。ハエは、各試行間のシートから取り外すことができます。あるいは、いくつかのシートを各試験のために新しいシートを、使用することができる。 </li></ol> 3。データ収集<ol><li> ImageJソフトウェアを使用して開いている画像ファイル。 </li><li>クロップ画像は着陸表面積を含める必要がある場合。 （これはもつれトラップにコーティングされた領域です。） </li><li> 8ビットグレースケールに画像を変換します。 </li><li>白い背景をフィルタリングする「しきい値」を作成します。 （画像→→スレッショルドを調整）。 </li><li> 「粒子を分析」メニューを使用して、各ハエを識別するためにパラメータを設定します。 粒子を識別するために使用するパラメータを定義します（粒子を分析→分析）。私たちは、セットアップにより、我々は見つけることが使用して5〜90ピクセル2および0.4〜1.0の円形の領域を正確にすべてのサンプルを識別します。 </li><li>各粒子の座標の生成されたリストを使用して、各ハエの位置を測定します。 x座標（ピクセル単位）は、着陸の高さを計算するためにセンチメートルに変換することができる。 </li><li> （Microsoft Excelなど）スプレッドシートにテーブルをインポートします。 </li></ol>

<ol><li>Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Am%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of behavior.</a> Sci. Am. 229, 24-37 (1973).</li>
<li>Ali, Y. O., Escala, W., Ruan, K., Zhai, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assaying+locomotor%2C+learning%2C+and+memory+deficits+in+Drosophila+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Assaying locomotor, learning, and memory deficits in Drosophila models of neurodegeneration.</a> J. Vis. Exp. , e2504(2011).</li>
<li>de Vries, S. E., Clandinin, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+Stimulation+of+Escape+Behavior+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster.</a> J. Vis. Exp. , e50192(2013).</li>
<li>Mundiyanapurath, S., Certel, S., Kravitz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+aggression+in+Drosophila+%28fruit+flies%29%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Studying aggression in Drosophila (fruit flies).</a> J. Vis. Exp. , e155(2007).</li>
<li>Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+assay+Drosophila+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Methods to assay Drosophila behavior.</a> J. Vis. Exp. , e3795(2012).</li>
<li>Shiraiwa, T., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proboscis+extension+response+%28PER%29+assay+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila.</a> J. Vis. Exp. , e193(2007).</li>
<li>Lloyd, T. E., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flightless+flies%3A+Drosophila+models+of+neuromuscular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Flightless flies: Drosophila models of neuromuscular disease.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1184, e1-e20 (2010).</li>
<li>Atkinson, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+separation+of+two+behavioral+phenotypes+by+a+mutation+affecting+the+promoters+of+a+Ca-activated+K+channel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular separation of two behavioral phenotypes by a mutation affecting the promoters of a Ca-activated K channel.</a> J. Neurosci. 20, 2988-2993 (2000).</li>
<li>Atkinson, N. S., Robertson, G. A., Ganetzky, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+component+of+calcium-activated+potassium+channels+encoded+by+the+Drosophila+slo+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A component of calcium-activated potassium channels encoded by the Drosophila slo locus.</a> Science. 253, 551-555 (1991).</li>
<li>Elkins, T., Ganetzky, B., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Drosophila+mutation+that+eliminates+a+calcium-dependent+potassium+current%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Drosophila mutation that eliminates a calcium-dependent potassium current.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83, 8415-8419 (1986).</li>
<li>Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+iterative+negative+geotaxis+%28RING%29%3A+a+new+method+for+assessing+age-related+locomotor+decline+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila.</a> Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).</li>
<li>Fry, S. N., Rohrseitz, N., Straw, A. D., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+control+of+flight+speed+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visual control of flight speed in Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 212, 1120-1130 (2009).</li>
<li>Mronz, M., Lehmann, F. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+free-flight+response+of+Drosophila+to+motion+of+the+visual+environment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">The free-flight response of Drosophila to motion of the visual environment.</a> J. Exp. Biol. 211, 2026-2045 (2008).</li>
</ol>

著者らは、開示することは、特別の利害関係はありません。

ここに記載される方法を用いて、我々は、以前に可能であったよりも高い効率を提供し、迅速にショウジョウバエの変異体の多数の飛行性能を評価することができた。我々の実験のために、我々は日常的に男性と女性とを分離し、翼を損傷する可能性が攻撃を制限するために、低濃度（20未満のハエ/バイアル）でそれらを発生させます。もう一つの重要な考慮事項は、遺伝的背景の違いによる飛行性能の違いを適切に制御することです。我々はまた、それが前に飛行試験に二酸化炭素で麻酔から回復するためにハエを24時間の最小値を可能にするために役立ちます見つける。代替的に、ハエは、潜在的行動に影響を与えることなく、迅速な復旧を可能にするために、低温（4℃）への暴露により麻酔してもよい。 このプロトコルの律速段階は、試験間のプラスチックシートからハエを削除しています。効率を増加させる一つの方法は、多数oをを使用することである同時にFシート、それらが使用されているようにシートを確保しておくと、データの収集、次のすべてを一度に清掃。底に落ちたハエは、彼らがシートに含まれませんように、手動でカウントする必要があります。...

ショウジョウバエは、長い行動1の遺伝的基礎を研究するために使用されており、研究者は行動2-6の様々なタイプを分析するための多数の方法を考案した。ハエは、神経筋疾患7の有用なモデルを提供するのに特に有用であった。運動行動を研究するために使用される一般的なアッセイは、飛行性能である。オリジナルの飛行試験機は、飛行欠損変異株を識別するための飛行能力1の定量的評価に有用であるが、それはハイスループットスクリーニングへの応用を制限するいくつかの欠点があります。油でコーティングされたシリンダーの使用は面倒で煩雑であるなどの特定の機能を可変力を有するチューブ内にシリンダとハエの導入の長さは、定量的な精度を低下させると、それは、テスタからのライブハエを回収することは困難である。これらの制限を克服するために、我々は多数の改良を含むように飛行試験を変更している。私たちは、 &quot;ドロップTUを追加しました実験とユーザ間のばらつきを排除するためにハエを導入すること」である。我々は、簡単にクリーンアップし、個々のハエの回復を可能にする接着剤を塗布した取り外し可能なアクリルシートを使用して我々は、定量的な精度と信頼性を向上させるために、飛行管の長さを増加して、最終的に、我々は、ハエの着地高さを計算するために、デジタルカメラと画像処理ソフトウェアを使用しています。我々は、これらの改善は、飛行性能に欠陥のための大規模な遺伝子スクリーニングを実施することに興味の任意の研究室に有用であると考えています。

<table><tbody><tr><td>パテナイフ</td><td>ホームデポ</td><td>630147</td><td><a href="http://www.homedepot.com">www.homedepot.com</a></td></tr><tr><td>パインバックバンドモールディング (2x)</td><td>ホームデポ</td><td>156469</td><td><a href="http://www.homedepot.com">www.homedepot.com</a></td></tr><tr><td>Furring Strip Board</td><td>ホームデポ</td><td>164704</td><td><a href="http://www.homedepot.com">www.homedepot.com</a></td></tr><tr><td>Tangle-Trap Ingret Trap Coating</td><td>BioControl Network</td><td>268941</td><td><a href="http://www.biconet.com">www.biconet.com</a</td></tr><tr><td>>ラップトップコンピュータ&nbsp;</td><td>Apple</td><td></td><td><a href="http://www.apple.com/mac/">www.apple.com/mac/</a></td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td></td> <td>BP26291<a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>白いポスターボード</td><td>ステープルズ</td><td>247403</td><td><a href="http://www.staples.com">www.staples.com</a</td></tr><tr><td>>ポリスチレン計量皿</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S67091A</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a</td></tr><tr><td>>ImageJ Software</td><td>国立衛生</td><td></td>研究所<td><a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a></td></tr><tr><td>デジタルカメラ</td><td>ソニーDSC-TX7</td><td></td><td><a href="http://www.store.sony.com">www.store.sony.com</a></td></tr><tr><td>ファイン鉗子</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td><a href="http://www.finescience.com">www.finescience.com</a></td></tr><tr><td>ポリカーボネートシリンダー(ドロップチューブ)</td><td>McMaster-Carr</td><td>8585K62</td><td><a href="http://www.mcmaster.com">www.mcmaster.com</a></td></tr><tr><td>フライトシリンダー(アクリル)</td><td>McMaster-Carr</td><td>8486K943</td><td><a href="http://www.mcmaster.com">www.mcmaster.com</a></td></tr><tr><td>ポリカーボネートシート</td><td>McMaster-Carr</td><td>85585K25</td><td><a href="http://www.mcmaster.com">www.mcmaster.com</a</td></tr><tr><td>>リングスタンド (2x)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S47808</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>リングサポート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S47791</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>3極延長クランプ(x2)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>05-769-7Q</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>Funnel</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>10-500-3</td><td><a href="http://www.fishersci.com">www.fishersci.com</a></td></tr><tr><td>チェーンクランプ(2x)</td><td>VWR</td><td>21573-275</td><td><a href="http://www.vwr.com">www.vwr.com</a</td></tr><tr><td>>ガラスバイアルVWR</td><td></td><td>66020-198</td><td><a href="http://www.vwr.com/">www.vwr.com</a></td></tr></tbody></table>

飛行性能の正確かつ迅速な測定のための改善された方法での<em&gt;ショウジョウバエ</em

An Improved Method for Accurate and Rapid Measurement of Flight Performance in Drosophila

ショウジョウバエは、飛行を含む行動の分析に有用なモデル系であることが証明されている。最初の飛行試験機は、油でコーティングされたにハエを落とす関与メスシリンダーに、着陸の高さは、はるかにハエがシリンダーの壁と接触するために十分な推力を発生する前に落ちるか評価することにより、飛行性能の尺度を提供した。ここでは、4の主要な改善と飛行試験機の更新版について説明します。まず、我々はすべてのハエがユーザー間でのばらつきをなくし、試験間で類似の速度で飛行シリンダーに入ることを保証するために、「落下管」を追加しました。第二に、我々はもつれトラップ、生きた昆虫を捕獲するよう​​に設計され、接着剤でコーティングされた取り外し可能なプラスチックシートにオイルコーティングを取り替えた。第三に、我々は、飛翔能力のより正確な識別を可能にするために、より長いシリンダーを使用しています。第四に、我々は飛行性能の採点を自動化するために、デジタルカメラと画像処理ソフトウェアを使用しています。これらの改良は、ラップを可能にID、飛行挙動の定量的評価、大規模なデータセットおよび大規模な遺伝子スクリーニングに便利。

<html> 図1Aは、更新された飛行試験器アセンブリの概略図を示す。 図1Bは、トラックの設計がカメラの視野を遮断することなく、パノラマ画像を撮影できるように示している。代表的な結果は、欠陥8-10公知のフライトを有するもどかしい変異体ハエの飛行性能は、野生型カントン-Sハエと比較される図2に示されている。コントロールは、一貫して個人間ではほとんど普及して73±2.0 cmで平均着地高さ、円柱の上部付近に土地を飛ぶ。これとは対照的に、 もどかしいハエは44±4.1 cmで平均し、はるかに多様な着陸の広がり、および有意に低い土地が表示されます。全てのハエは、3日齢であった室温（23℃）で調達した。 s/ftp_upload/51223/51223fig1.jpg &quot;幅=&quot; 600PX &quot;/&gt; <b...

ここでは、ハイスループットスクリーニングを可能にする、 ショウジョウバエの飛行性能を迅速かつ正確に測定するための方法を記載している。

Drosophila has proven to be a useful model system for analysis of behavior, including flight. The initial flight tester involved dropping flies into an ...

この手順の目的は、ショウジョウバエ（Drosophila）の飛行性能を迅速かつ正確に測定することです。まず、ハエを飛行シリンダーの中に落下させます。次に、デジタルカメラを用いて着地面を撮影します。最終ステップは、イメージングソフトを使用して各ハエの着地高を測定し、データを分析することです。最終的に、この手順は、飛行能力を損なう変異や、加齢、神経変性などの状態の特定に役立ち、飛行パフォーマンスの定量化を可能にします。従来の飛行テスターなどの既存の手法に対するこの技術の主な利点は、変異体や飛行能力を低下させるその他の条件に関するハイスループットスクリーニングに適していることです。元のフライトテスターを用いて多数の遺伝子型を試験するのに、いかに多くの時間を要するかに気づいたことが、この手法を考案したきっかけとなりました。チェーンクランプを使用して、フライトシリンダーをリングスタンドに固定します。シリンダーの下に、シャーレを置くためのスペースを約3 cm空けてください。ウェイディッシュにミネラルオイルを薄く張り、フライトシリンダーの下に滑り込ませます。漏斗を2本目のリングスタンドに固定します。漏斗の底がフライトシリンダーの上端と同じ高さになるように、漏斗の高さを調整してください。漏斗の最も狭い部分は、ショウジョウバエ用バイアルよりも狭くなければなりません。ドロップチューブの直径は、バイアルが自由に落下できるよう、バイアルよりもわずかに広くする必要があります。ドロップチューブを漏斗の上部に挿入し、クランプで固定します。次に、ポリアクリルアミドシートから、長さはフライトシリンダーと同等で、幅がフライトシリンダーの内周よりわずかに小さい長方形の断片を切り出します。シートを保持するために上下に十分な未塗布領域を残し、Tangle Trap 粘着剤を薄く塗布します。シート上の粘着剤を1時間乾燥させた後、粘着面を内側にしてシートをフライトシリンダーに挿入します。次に、パイン材の支持ブラケットを使用してカメラトラックを組み立てます。トラックの底面が、レンズを遮ることなくカメラを支持できることを確認してください。その後、カメラからプラスチックシートへの視界を妨げない位置にストッパーをネジで固定します。1本あたり20匹までとなるように、テスト用のショウジョウバエをバイアルに回収します。バイアルを軽く叩いて、ハエを底に集めます。バイアルの栓を抜き、ドロップチューブに挿入します。バイアルを放します。バイアルが絞り込まれた漏斗の壁に当たると、ハエが飛行シリンダー内へと排出されます。ドロップチューブを持ち上げて空のバイアルを取り除き、必要に応じてさらにハエを投入します。10本のバイアルから最大200匹のハエを単一のポリアクリルアミドシート上にロードして、簡便にテストおよびイメージングを行うことができます。次に、プラスチックシートを取り外し、平らな白い表面に置きます。ベンチトップの色が濃い場合は、白いポスターボードを使用できます。プラスチックシートの上にカメラトラックを組み立てます。カメラは、シートの上下両方が視野に入る十分な高さに設置してください。キャプチャボタンを押しながらカメラをトラックに沿ってスライドさせ、パノラマ画像を取得します。飛行チャンバー下のディッシュ内のオイルに落下したハエの数を手動でカウントできます。各試行の間で、ハエをシートから取り除くことで、シートを再利用できます。ImageJソフトウェアで画像ファイルを開き、必要に応じて、着陸表面領域（Entangleトラップがコーティングされた領域）のみが含まれるように画像をクロップします。画像を8ビットのグレースケールに変換し、しきい値を設定します。これにより、白い背景を除去します。各個体を識別できるようパラメータを設定してください。「粒子解析（analyze particles）」メニューを使用して、パラメーターを定義します。これは、デモンストレーション装置を用いて粒子を特定するために使用されます。面積を5～90ピクセル平方、円形度を0.4～1.0に設定することで、すべてのサンプルを正確に特定できます。次に、各粒子の座標リストを用いて、各ショウジョウバエの位置を測定します。ピクセル単位のX座標はセンチメートルに変換可能です。着地高を算出するには、表をスプレッドシートにインポートして解析を行ってください。飛行能に欠陥があることが知られているslow poke変異体ショウジョウバエの飛行性能を、野生型のcanton sショウジョウバエと比較しました。すべてのハエは室温で飼育された3日齢の個体でした。対照群のハエは一貫してシリンダーの上部付近に着陸しましたが、slow poke変異体では着陸地点の分散が大幅に大きくなりました。cantonの平均着地高は73 cmであり、slow poke変異体の44 cmよりも有意に高くなりました。この手順に続き、組織学などの追加の手法を用いることで、飛行筋、運動ニューロン、または神経筋接合部の構造的完全性に関するさらなる疑問を明らかにすることができます。このビデオを視聴することで、ophにおける飛行性能を迅速に評価する方法について十分に理解できたはずです。

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