ペプチドエピトープの定量分析のための高スループット、MHC II結合アッセイ
March 25th, 2014
組換えヒトMHC II分子と生化学的アッセイは、免疫原性エピトープ同定、削除、または設計に迅速かつ定量的な洞察を提供することができます。ここで、384ウェルプレートにスケーリングペプチド-MHC II結合アッセイが記載されている。この費用対効果の高い形式は、タンパク質の脱免疫やワクチンの設計と開発の分野で有用であることを証明する必要があります。
この手順の全体的な目標は、ハイスループットの3 84ウェルプレートアッセイを使用して、短いペプチドとヒトMHC 2つの免疫タンパク質との結合を定量化することです。これは、まず、目的のペプチドとの溶液相競合結合アッセイを行うことによって達成されます。第2ステップでは、平衡化したペプチドMHC 2複合体を、高結合ELIZAプレートに固定化された抗MHC 2抗体で捕捉します。
次に、捕捉された複合体を標識されたストレプトアビジンとインキュベートし、次に結合していないストレプトアビジンを洗い流し、捕獲したアヘンを活性化します。最終的には、時間分解蛍光法を使用して、捕捉されたMHC 2つのコントロールペプチドのレベルを定量化できます。この方法は、標的タンパク質の免疫原性の可能性に関する予備的な洞察を提供することができます。
これは、in silicoプレディクターの出力を検証するために特に有用であり、3 84の各ウェルに25マイクロリットルの新たに希釈したL2 43抗体溶液を添加して手順を開始します。高結合性の白色ELIZAプレートは、ポリエステルフィルムでプレートを密封し、摂氏4度で一晩インキュベートします。次に、各テストの10ミリモルストックから始めます。
ペプチドとDMSOは、3 84ウェルポリプロピレンプレートを使用して、次の希釈シリーズとクエン酸リン酸塩バッファーを作成します。図に示すように、完全な3 84ウェルポリプロピレンプレートには3つの別々のEIAプレートが必要であることに注意してください。次に、選択したMHC 2つのストック溶液を、15ミリリットルのコニカルチューブを使用して、反応バッファー中の101ナノモル濃度に希釈します。
次に、新たに調製したMHC 2マスターミックスでコントロールペプチドを20マイクロモルから1対100の比率に希釈し、コントロールペプチドを含むMHC 2マスターミックスの21.5マイクロリットルをポジティブコントロールに加えます。ウェル3 84ウェルポリプロピレンプレートに、MHC 2つのマスターミックスを含むコントロールペプチドを各試験ペプチド希釈液に1対1の比率で加えると、このときも結合反応が生じる。最後に、結合反応をポリエステルフィルムで密封し、プレートを非二酸化炭素制御インキュベーターで摂氏37度で振とうせずに12〜24時間インキュベートします。
翌日、結合反応ウェルを3 84で希釈します。中和バッファーと1対1の比率でウェルプレート。次いで、PBSのウェル当たり60マイクロリットルで3回洗浄し、次の20回の移送の間に、384ウェルプレートから各中和結合反応溶液25マイクロリットルを抗体被覆384に三重に
洗浄する。その後、エリザプレートは、インキュベーション後一晩で摂氏4度のポリエステルフィルムで覆われたエリザプレートをインキュベートします。先ほど示したようにELIZAプレートを3回洗浄し、それぞれに希釈したばかりの連鎖球菌酸アヘンを25マイクロリットル加えます。ポリエステルフィルムで覆われたプレートを室温で暗所で1時間よくインキュベートします。
インキュベーション中に、プレートあたり10ミリリットルの強化溶液を1時間後にも暗所でも室温に戻し、示されているようにELIZAプレートを洗浄し、次に各ウェルに25マイクロリットルの強化溶液を追加し、ポリエステルフィルムで覆われたプレートを暗闇で10〜15分間インキュベートします。最後に、アヘン設定の時間分解蛍光プレートリーダーで蛍光を読み取ります。この代表的な実験では、エンテロバクターCloe P nine nineβ-ラクタマーゼの成熟ペプチド配列を分析し、MHC 2対立遺伝子に対するペプチド結合剤と推定されるものを探しました。
DRB 1 15 oh 1 117 non or peptidesは、MHC 2が5%の閾値でのみ結合するために必要な位置1の必須のP 1アンカー残基とともに同定された。スコアが2.6以上のペプチドは、バインダーである可能性が高いです。したがって、5%の閾値では、上位11のペプチドのみがMHC 2 DRB 1 15 0 1に結合すると予測されます。
予測されたエピトープの代表的なパネルを、このMHC 2結合アッセイでの分析のために選択しました。これらの15残基のβ-ラクタマーゼペプチド断片は、推定ノナマーMHCの2つのエピトープがそれらの合成タンパク質断片内に埋め込まれるように化学合成されました。次に、これらの合成ペプチドがビオチン化ミエリン塩基性タンパク質Bコントロールペプチドと競合する能力をMHC 2 DRB 1 15 0 1に結合する能力を、今実証したように分析しました。
ここでは、合成ペプチドの競合結合曲線を示しています。IC 50の値は、プリズムの1サイト競合結合非線形フィット関数を使用して対数変換データをフィッティングすることにより計算しました。グラフに見られるように表に示されているように、ペプチドは自然に3つのグループに分割され、IC50が1マイクロモル未満である強い結合剤、1マイクロモル以上100マイクロモル以上のIC50を持つ中程度の結合剤、および100マイクロモル以上のIC50を持つ弱い結合剤が100マイクロモル
以上である。この技術は、分子免疫学およびバイオ医薬品設計の分野の研究者が、ヒト患者の抗タンパク質免疫応答の根底にある主要な分子認識イベントをより完全に探求する道を開きました。
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概要
この記事では、384ウェルプレートを使用して、短いペプチドとヒトMHC IIタンパク質の結合を定量化するための高スループットペプチド-MHC II結合アッセイについて説明します。この方法は、免疫原性エピトープの特定に関する迅速な洞察を提供し、特にタンパク質の非免疫化とワクチン開発に有用です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 免疫学
- ワクチン開発
- 生化学的アッセイ
背景
- ヒトMHC II分子は免疫反応において重要な役割を果たします。
- 免疫原性エピトープの特定はワクチン設計に不可欠です。
- 高スループットアッセイは研究プロセスを加速できます。
- 免疫学の分野ではコスト効率の良い方法が必要です。
研究の目的
- ペプチドとMHC IIタンパク質の結合を定量化すること。
- 免疫原性エピトープの特定を容易にすること。
- ワクチン設計と開発の取り組みを支援すること。
使用された方法
- ペプチドを用いた溶液相競合結合アッセイ。
- 抗MHC II抗体を用いたペプチド-MHC II複合体の捕捉。
- オピウム標識ストレプタビジンによるインキュベーション。
- 時間分解蛍光測定を用いた定量化。
主な結果
- このアッセイはペプチド-MHC II結合に関する定量的データを提供します。
- ペプチドの免疫原性ポテンシャルの評価を可能にします。
- この方法はスケーラブルでコスト効率が高いです。
- 結果は将来のワクチン開発戦略に情報を提供できます。
結論
- 説明されたアッセイは免疫学研究のための価値あるツールです。
- ペプチド-MHC相互作用の理解を深めます。
- このアプローチはワクチン設計の進歩につながる可能性があります。
