新生児軟膜表面エレクトロ

この手順の全体的な目標は、皮表面の神経前駆細胞を遺伝的に標識し、操作することです。これは、まず血漿DNA溶液を充填したガラスピペットを剥離表面領域に挿入することによって達成されます。2番目のステップは、DNAを髄膜腔に注入し、剥離面を覆うことです。

次に、電極は剥離面に適切に電流を流すように配向されます。最後のステップは、電流を印加することにより、DNAが剥離表面前駆細胞にエレクトロポレーションされることです。最終的に、この方法を他の手法と組み合わせて、剥離表面、神経前駆細胞の増殖、移動、および/または分化の自然史と分子決定要因を示すことができます。

この技術がウイルス形質導入などの既存の方法と比較した場合の主な利点は、エレクトロポレーションがより安全で柔軟性があり、ウイルス粒子の作成やパッケージングを必要としないことです。この方法は、神経幹細胞および前駆細胞の分野における重要な疑問、例えば、これらの剥離表面前駆細胞が組織、組織発生、神経回路機能にどのような貢献をしているのかなど、その答えを出すことができます。まず、ピペットプーラーを使用してガラスキャピラリーチューブからピペットを形成し、引っ張ったら鋭利なハサミで先端を切ります。

次に、ろ過されたヌクレアーゼフリーの水を使用して、1%の高速グリーンストック溶液を調製します。エンドトキシンフリー血漿DNAインタレストEDTAバッファーを希釈した後、1%fastグリーン溶液に適切な割合で組み合わせます。標準的なピペットを使用して、注入するプラスミドミックスを所望の量のパラフィンワックスフィルムに置き、参照します。

次に、マイクロインジェクターを使用して、組み立てたガラスピペットをプラスミド混合物の入ったチューブに慎重に挿入します。破損を防ぐため、先端をチューブの端に触れないでください。トランスファーダイヤルをゆっくりと戻して、溶液をピペットに吸引します。

十分な量がロードされたら、圧力がゼロの中立位置に戻るまでダイヤルフォワードします。ヘクター・パスカルス。次に、リファレンスインジェクションの隣にチップを置き、マイクロインジェクターのフットペダルを使用して1つのボリュームを排出します。

量が以前にピペットで移動した基準体積と等しくなるまで圧力を調整します。注入量をキャリブレーションした後、プラスミド注入用の動物を回収します。麻酔の深さを確認したら、利き手の少ない方の親指と人差し指で子犬を抱きしめます。

利き手を使用して目的の領域を狙うと、皮質半球や上丘などの他の表面構造が容易に見える必要があります。正しい位置が特定されたら、ピペットを皮膚と頭蓋骨の向こう側に挿入します。大脳動脈を避けるように注意してください。

ピール面を狙うには、ピペットの前進を直ちに停止します ピペットの先端が正しい位置で頭蓋骨が貫通されたらすぐに、マイクロインジェクターのフットペダルを使用してプラスミド溶液を注入します 注入後、ピペットを慎重に取り外します。注入の合間にチップが乾燥して目詰まりするのを防ぐには、パラフィンフィルム上のテスト液滴にチップを入れます。すべての子犬が注入されるまでこれらの手順を繰り返して、コンダクタンスを高め、皮膚の火傷を防ぎます。

3mmのプラチナピンセットTROをエレクトロポレーションジェルで覆います。次に、皮質への注射の電気設定を調整します。負に帯電したプローブを注入された領域に置き、正に帯電したプローブを目の下の反対側領域の周りに置きます。

電極の向きは、正中線に対して45〜60度の角度にある必要があります。フットペダルを使用して電流をトリガーし、ピンセットTROを3〜5パルス保持します。子犬の年齢と体重に応じて、パルスはDNAを下にある剥離表面細胞に向ける必要があります。

負極は射出領域に掃引できます。パルスの合間に、またはより大きな電極を使用してエレクトロポレーションの直後にエレクトロエリアを増やすことができ、子犬からゲルを慎重に取り除き、約5分間ヒートランプの下に置きます。子犬は、エレクトロポレーション後数分でチアノーゼにより、自然な赤みがかった小指を急激に失います。

子犬をケージに戻すか、上絨毛に注射する前に、子犬が自然な色の回復と正常な動きの開始を観察します。ターゲット領域をラムダのすぐ後方と外側、ほぼ正中線に配置し、示したのと同じ手順に従います。注入が成功すると、プラスミドミックスは自然に上絨毛の輪郭を埋めます。

優れたコーラス注射後に電気操作を行う場合、電極の負に帯電したプローブを注入された領域に置き、正に帯電したプローブを目、鼻、またはあごの周りに置きます。この場合、電極の向きは正中線に対して25〜40度の角度になります。この画像は、clover とタグ付き bfp のメンブレンを発現する蛍光レポータープラスミドのエレクトロポレーション後の背側皮質を示しています。

ここに赤い疑似カラーで示されている2つの核タンパク質。この皮質間ニューロンには、エレクトロポレーションの約2か月後に広範な樹状突起が見られます。EGFP陽性細胞はBRDU陽性であり、エレクトロポレーション手順中に増殖していたことを示しています。

この手法を試みるときは、下にある皮質や血管系の破壊を避けるために、剥離表面の適切なターゲティングに焦点を当てることが重要です。