軟寒天コロニー形成アッセイ
2014年10月27日
軟寒天コロニー形成アッセイは、in vitroで細胞の足場に依存しない増殖を確認するために使用される方法です。このプロトコルの目的は、形質転換細胞の腫瘍形成可能性および形質転換細胞に対するタンパク質の腫瘍抑制効果を検出するための厳密な方法を説明することです。
この手順の全体的な目標は、細胞の足場に依存しない成長を定量化することです。これは、最初に寒天の層を細胞培養プレートに播種し、それを硬化させることによって達成されます。2番目のステップは、前の寒天層の上に寒天中の細胞の混合物をプレートすることです。
次に、細胞は数週間にわたってコロニーを形成することが許されます。最後のステップは、可視化と定量のためにコロニーを染色することです。最終的に、軟寒天コロニー形成アッセイは、細胞形質転換の指標としてアンカレッジに依存しない増殖を示すために使用されます。
この手法がClonジェニックアッセイなどの他の方法よりも優れている主な利点は、軟寒天コロニー形成アッセイでは、細胞がアンカレッジに依存しない方法でコロニーを形成する必要があることです。処理した組織培養の各ウェルにラベルを付けることから手順を開始します。調査対象の各細胞株または条件に適した6ウェルプレート。
次に、1グラムの粉末培地と0.2グラムの重炭酸ナトリウムを脱イオン水に溶解して、2つのXcel培地を調製し、最終容量50ミリリットルにします。この媒体を0.2ミクロンのフィルターに通します。目的の細胞株の通常の培養に必要な追加のコンポーネントを追加します。
例えば、10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシン溶液を添加したRPMI 1640培地でCMT 1 67細胞株を増殖させます。使用前に温水浴で中温から摂氏37度まで温めてください。次に、Xcel培地を1つ調製します。
次に、100ミリリットルの脱イオン水に1グラムの貴貴な寒天を加えて、1%貴貴な寒天を調製します。その後、0.6ミリリットルの脱イオン水に0.6グラムの貴貴な寒天を加えて、0.6%貴貴な寒天を調製します。次に、貴寒天混合物をオートクレーブします。
その後、コロニーを染色する目的で、1 つの XPBS で 1 ミリグラム/ミリグラムのニトロ ブルー テトラ発煙硫酸塩ストック溶液を作成します。この手順では、1%貴金属寒天のボトルを電子レンジで加熱しながら約1〜2分間電子レンジで加熱します。沸騰しないように溶液を注意深く監視してください。
次に、寒天が完全に溶解して溶液が透明になるまで、断続的に加熱と混合を続けます。その後、溶かした寒天溶液とプレウォーム2x培地を42°Cで満たされた氷のバケツに入れます。水道水。
さらに、50ミリリットルの円錐形のチューブをアイスバケツのチューブホルダーに入れ、お湯を入れます。次に、バケツを細胞培養フードに移します。次に、6ミリリットルの培地と6ミリリットルの1%貴金属寒天溶液を50ミリリットルの円錐管に加えます。
ピペットを数回上下させて混ぜます。速いペースで作業することで、柔らかい寒天の早期硬化を防ぐことができます。その後、5ミリリットルの血清ピペットで約5.5ミリリットルの混合物を引き出します。
気泡がピペットカラムの上部まで上昇するのを待ちます。次に、1.5ミリリットルの混合物を各ウェルに堆積させ、気泡の堆積を防ぎます。プレートを覆い、寒天混合物を室温で細胞培養フード内で30分間固化させます。
まず、トリプシンで細胞を採取し、培養液で1〜5個希釈し、培地を15ミリリットルの円錐管にします。細胞を数え、この時点で最終的な細胞懸濁液を調製するためにウェルごとに必要な細胞数を計算します。次に、0.6%寒天溶液を電子レンジで溶かします。
お湯の入った氷の入ったバケツに入れ、50ミリリットルの円錐形チューブをチューブホルダーに入れ、最終的なセル懸濁液を入れます。次に、0.6%寒天を溶かしたアイスバケツを細胞培養フードに移し、その後のステップで行います。6ウェルプレート用の総量12ミリリットルの細胞懸濁液を調製するには、まず、6ミリリットルの細胞懸濁液を50ミリリットルのコニカルチューブにピペットします。
次に、チューブに6ミリリットルの0.6%寒天を加えます。混合物を摂氏42度に保ち、早期の早期硬化を避け、細胞の生存率を最大化します。その後、混合物をすばやく、2〜3回ピペットで動かして細胞を分散させます。
5ミリリットルの血清ピペットで5.5ミリリットルの混合物を引き出し、気泡がピペットカラムの上部に上昇するのを待ちます。次に、それぞれに1.5ミリリットルの混合物を堆積させます。細胞寒天混合物を細胞培養フード内で室温で30分間固化させてから、摂氏37度の加湿細胞培養インキュベーターに入れます。
乾燥を防ぐために、週に2回、寒天の上層に100マイクロリットルの成長培地を追加し、適切なコロニー形成のために約21日間待ちます。細胞を染色するには、各ウェルに200マイクロリットルのニトロブルーテトラ発煙硫酸塩溶液を加え、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。コロニーが染色されたら、イメージャーを使用して井戸の写真を撮り、画像分析ソフトウェアを使用してコロニーをカウントします。
ここに示されているのは、CMT 1 67 LNCX LPC X細胞を発現するベクターとCMT 1 67 LLの軟寒天コロニー形成アッセイであり、発現細胞に対して7つまたは縮れた9つが生じました。CMT 1 67 L および CXL PC X 細胞と CMT 1 67 LL を発現するベクターは、7 a f 縮れました。軟質寒天培地形成アッセイでプレーティングした9つの過剰発現細胞、CMT1、67 LLは、7つの縮れた9つの細胞が、その開発後にコロニー形成の顕著な減少を示した。
この技術は、がん研究の分野の研究者がin vitroで細胞形質転換を探求する道を開きました。このビデオを見れば、アンカレッジに依存しない細胞増殖について細胞を評価する方法について十分に理解できるはずです。
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概要
ソフトアガーコロニー形成アッセイは、in vitroにおける細胞の anchorage-independent growth（足場独立性増殖）を確認するために用いられる手法です。本プロトコルでは、形質転換細胞の腫瘍形成能および、これらの細胞に対するタンパク質の腫瘍抑制効果を検出するための厳格な方法を解説します。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞生物学
- 腫瘍学
- 細胞培養技術
背景
- ソフトアガーコロニー形成アッセイは、がん研究において広く用いられている手法です。
- この手法は、細胞の非接着増殖能を評価するのに役立ちます。
- 本方法は、腫瘍形成の研究において極めて重要です。
- また、潜在的な腫瘍抑制タンパク質の効果を評価することも可能です。
研究目的
- 細胞の足場独立性増殖を定量化する。
- 形質転換細胞の腫瘍形成能を実証する。
- 形質転換細胞の増殖に対するタンパク質の影響を評価する。
使用方法
- 細胞培養プレートにアガー層を播種する。
- 細胞を添加する前に、アガーを凝固させる。
- 凝固した層の上に、アガーに混合した細胞を播種する。
- 数週間後、可視化および定量のためにコロニーを染色する。
主な結果
- コロニーの形成が確認されれば、足場独立性増殖が認められたことを示す。
- コロニー数を定量化することで、細胞の形質転換に関する知見が得られる。
- 染色法を用いることで、コロニー形成の視覚化が向上する。
- 本アッセイは、腫瘍抑制タンパク質の効果を効果的に実証する。
結論
- 軟寒天コロニー形成アッセイは、腫瘍形成の研究において信頼性の高い手法です。
- この手法は、形質転換細胞の増殖特性に関する有用なデータを提供します。
- 本アッセイは、潜在的な治療用タンパク質の評価に利用可能です。
よくある質問
産業上の重要性
ソフトアガーコロニー形成アッセイは、悪性転換の主要な特徴である足場独立性増殖を評価するための厳格なin vitroモデルを提供します。これにより、バイオ製薬の研究開発チームは、定量的なコロニー形成の読み取り値を通じて、腫瘍抑制活性を評価し、オンコロジー標的のリスクを軽減することが可能になります。本アッセイは、分子介入を機能的な腫瘍表現型に関連付けることで、初期探索における予測の信頼性を高めます。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 定着独立性増殖の機能的な抑制を測定することにより、治療仮説を検証します。
- 運用上の価値： Wnt7AおよびFzd-9の共発現効果を表現型として読み出すことで、パスウェイの解明を可能にします。
- 予測的価値： 標的調節を疾患関連細胞における腫瘍形成能の低下に結びつけることで、ポートフォリオの優先順位付け（トリアージ）を支援します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： 様々な処理条件下における形質転換状態に関する半定量的なデータを生成します。
- 運用上の価値： 化合物スクリーニングにおける、足場依存性増殖と足場独立性増殖の比較を標準化します。
- 拡張性： 用量反応試験や遺伝的摂動研究のためのマルチウェルフォーマットに対応しています。
トランスレーショナル・前臨床研究
- トランスレーショナルな連続性： マウス肺癌細胞を用いて、ヒトの腫瘍形成メカニズムをモデル化します。
- バイオマーカーの整合性： コロニー形成能を、腫瘍抑制活性と相関する機能的リードアウトとして利用します。
- リスク調整済みの進展： 悪性転換フェノタイプの抑制に基づいた、go/no-go判定を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
このアッセイは、ターゲットの妥当性確認からリード化合物の同定、そして前臨床段階での有効性評価に至るオンコロジー創薬の連続的なプロセスに適合しており、分子メカニズムと腫瘍形成表現型の間の機能的な架け橋となります。
- ディスカバリーバイオロジー： 厳格な足場独立的な条件下で、悪性転換に対する経路特異的な影響を検証します。
- スクリーニング： 遺伝学的または薬理学的モジュレーターを評価するための、再現性と定量性のあるコロニー数を算出します。
- 分析： 条件間の比較および抑制率の算出のための数値的エンドポイントを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： 適切な前臨床モデルにおいて、Wnt経路の変調と腫瘍形成能の低下を関連付けます。
- エンタープライズでの再利用： さまざまなオンコジェニック経路および細胞株における転換を評価するための、再利用可能なプラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 分子レベルの変化と機能的変換フェノタイプを関連付けることで、メカニズム上の曖昧さを軽減します。
- 運用の価値： ハイコンテンツイメージングおよび解析に適した、標準化された半定量的なアウトプットを提供します。
- 戦略的価値： ゴールドスタンダードな腫瘍形成能アッセイにおける効果を検証することで、ターゲット選択の信頼性を向上させます。
- ポートフォリオへの影響： 足場独立性増殖を抑制する化合物またはターゲットを特定することで、リスク調整後の優先順位付けに寄与します。
実施上の検討事項
- 細胞培養、無菌操作、およびアガロースの取り扱いに関する専門知識が必要です。
- 数週間にわたるコロニー形成および染色のためのインキュベーション設備に依存します。
- 再現性のある結果を得るには、画像解析による標準化された定量化手法が必要です。
- モデルシステムに応じた細胞密度とアガロース濃度の最適化を伴います。
- アッセイ期間の長さと、慎重な正規化を必要とするコロニー形態のばらつきによって制限されます。
