軟寒天コロニー形成アッセイ

この手順の全体的な目標は、細胞の足場に依存しない成長を定量化することです。これは、最初に寒天の層を細胞培養プレートに播種し、それを硬化させることによって達成されます。2番目のステップは、前の寒天層の上に寒天中の細胞の混合物をプレートすることです。

次に、細胞は数週間にわたってコロニーを形成することが許されます。最後のステップは、可視化と定量のためにコロニーを染色することです。最終的に、軟寒天コロニー形成アッセイは、細胞形質転換の指標としてアンカレッジに依存しない増殖を示すために使用されます。

この手法がClonジェニックアッセイなどの他の方法よりも優れている主な利点は、軟寒天コロニー形成アッセイでは、細胞がアンカレッジに依存しない方法でコロニーを形成する必要があることです。処理した組織培養の各ウェルにラベルを付けることから手順を開始します。調査対象の各細胞株または条件に適した6ウェルプレート。

次に、1グラムの粉末培地と0.2グラムの重炭酸ナトリウムを脱イオン水に溶解して、2つのXcel培地を調製し、最終容量50ミリリットルにします。この媒体を0.2ミクロンのフィルターに通します。目的の細胞株の通常の培養に必要な追加のコンポーネントを追加します。

例えば、10%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシン溶液を添加したRPMI 1640培地でCMT 1 67細胞株を増殖させます。使用前に温水浴で中温から摂氏37度まで温めてください。次に、Xcel培地を1つ調製します。

次に、100ミリリットルの脱イオン水に1グラムの貴貴な寒天を加えて、1%貴貴な寒天を調製します。その後、0.6ミリリットルの脱イオン水に0.6グラムの貴貴な寒天を加えて、0.6%貴貴な寒天を調製します。次に、貴寒天混合物をオートクレーブします。

その後、コロニーを染色する目的で、1 つの XPBS で 1 ミリグラム/ミリグラムのニトロ ブルー テトラ発煙硫酸塩ストック溶液を作成します。この手順では、1%貴金属寒天のボトルを電子レンジで加熱しながら約1〜2分間電子レンジで加熱します。沸騰しないように溶液を注意深く監視してください。

次に、寒天が完全に溶解して溶液が透明になるまで、断続的に加熱と混合を続けます。その後、溶かした寒天溶液とプレウォーム2x培地を42°Cで満たされた氷のバケツに入れます。水道水。

さらに、50ミリリットルの円錐形のチューブをアイスバケツのチューブホルダーに入れ、お湯を入れます。次に、バケツを細胞培養フードに移します。次に、6ミリリットルの培地と6ミリリットルの1%貴金属寒天溶液を50ミリリットルの円錐管に加えます。

ピペットを数回上下させて混ぜます。速いペースで作業することで、柔らかい寒天の早期硬化を防ぐことができます。その後、5ミリリットルの血清ピペットで約5.5ミリリットルの混合物を引き出します。

気泡がピペットカラムの上部まで上昇するのを待ちます。次に、1.5ミリリットルの混合物を各ウェルに堆積させ、気泡の堆積を防ぎます。プレートを覆い、寒天混合物を室温で細胞培養フード内で30分間固化させます。

まず、トリプシンで細胞を採取し、培養液で1〜5個希釈し、培地を15ミリリットルの円錐管にします。細胞を数え、この時点で最終的な細胞懸濁液を調製するためにウェルごとに必要な細胞数を計算します。次に、0.6%寒天溶液を電子レンジで溶かします。

お湯の入った氷の入ったバケツに入れ、50ミリリットルの円錐形チューブをチューブホルダーに入れ、最終的なセル懸濁液を入れます。次に、0.6%寒天を溶かしたアイスバケツを細胞培養フードに移し、その後のステップで行います。6ウェルプレート用の総量12ミリリットルの細胞懸濁液を調製するには、まず、6ミリリットルの細胞懸濁液を50ミリリットルのコニカルチューブにピペットします。

次に、チューブに6ミリリットルの0.6%寒天を加えます。混合物を摂氏42度に保ち、早期の早期硬化を避け、細胞の生存率を最大化します。その後、混合物をすばやく、2〜3回ピペットで動かして細胞を分散させます。

5ミリリットルの血清ピペットで5.5ミリリットルの混合物を引き出し、気泡がピペットカラムの上部に上昇するのを待ちます。次に、それぞれに1.5ミリリットルの混合物を堆積させます。細胞寒天混合物を細胞培養フード内で室温で30分間固化させてから、摂氏37度の加湿細胞培養インキュベーターに入れます。

乾燥を防ぐために、週に2回、寒天の上層に100マイクロリットルの成長培地を追加し、適切なコロニー形成のために約21日間待ちます。細胞を染色するには、各ウェルに200マイクロリットルのニトロブルーテトラ発煙硫酸塩溶液を加え、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートします。コロニーが染色されたら、イメージャーを使用して井戸の写真を撮り、画像分析ソフトウェアを使用してコロニーをカウントします。

ここに示されているのは、CMT 1 67 LNCX LPC X細胞を発現するベクターとCMT 1 67 LLの軟寒天コロニー形成アッセイであり、発現細胞に対して7つまたは縮れた9つが生じました。CMT 1 67 L および CXL PC X 細胞と CMT 1 67 LL を発現するベクターは、7 a f 縮れました。軟質寒天培地形成アッセイでプレーティングした9つの過剰発現細胞、CMT1、67 LLは、7つの縮れた9つの細胞が、その開発後にコロニー形成の顕著な減少を示した。

この技術は、がん研究の分野の研究者がin vitroで細胞形質転換を探求する道を開きました。このビデオを見れば、アンカレッジに依存しない細胞増殖について細胞を評価する方法について十分に理解できるはずです。